INTRODUÇÃO

A
QUÍMICA FORENSE
Bruno Lemos Cons
 A Química Forense
Forense – latim forensis, que quer dizer público

• Apoio científico nas investigações de danos, mortes e crimes inexplicados.

• Aplicam o conhecimento tecnológico no cumprimento das leis sociais, utilizando

provas materiais recolhidas no momento da perícia criminal.

• Responsável pela realização de análises voltadas à identificação e constituição

dos elementos como:
 Análises de disparos de armas de fogo.
 Identificação de adulterações em veículos.
 Revelação de impressões digitais.
 Identificação de sangue em locais de crime.
 Constatação de substâncias entorpecentes e várias outras apreciações
que contribuem fortemente para solucionar os crimes.
 Histórico da Química Forense
• China:

 Século VII, durante a dinastia Tang, Ti Yen Chieh utilizou a lógica e a prova forense,
estudos da cena do crime, exames das pistas e conversas com testemunhas.

 Século XIII, foi publicado um livro com explicações de como realizar o

reconhecimento de sinais de afogamento, pela presença de água nos pulmões, e
estrangulamento, pela partição da cartilagem do pescoço, ou explicações de como
feridas podiam revelar o tipo e o tamanho da arma utilizada no crime.
• Jean Servais Stas (1813 – 1891) – Primeiro pesquisador a utilizar experimentos sobre
determinação de venenos vegetais no corpo humano. Onde ajudou a identificar um
envenenamento por nicotina.

• Christian Friedrich Schönbein (1799–1868) - descobriu o primeiro método confiável para

a identificação de sangue humano, utilizando peróxido de hidrogênio.

• James Marsh (1794–1846) - desenvolveu o método na detecção do arsênio no corpo

humano,utilizando um aparato aquecido onde gerava um espelho de arsênio.
 Biologia Molecular na Química Forense
Biologia Molecular é responsável pelo estudo da estrutura e da função do material genético
e também dos produtos gerados na expressão, que são as proteínas.

O DNA pode ser utilizado na área forense e diversos aspectos, os principais são:

 Para demonstrar a culpa de criminosos.

 Na exoneração dos inocentes.
 Na identificação de corpos e restos humanos em desastres.
 Na determinação de paternidade.
 Na elucidação de trocas de bebês em berçários.
 Na detecção de substituições e erros de rotulação em laboratórios de patologia
clínica.
 Na distinção de crimes isolados e crimes em série.
 Biologia Molecular na Química Forense
• O DNA apresenta várias características que permitem que ele seja utilizado na
investigação criminal. As mais importantes são:

 Apresenta alta estabilidade.

 Apresenta alto potencial discriminatório.
 Está presente em todas as células nucleadas do organismo humano,
facilitando a obtenção do mesmo.
 É uma molécula resistente a fatores ambientais.

• O DNA pode ser obtido de amostras de:

 Sangue.
 Ossos.
 Sêmen.
 Cabelos.
 Dentes.
 Unhas.
 Saliva.
 Urina.
 Biologia Molecular na Química Forense
O DNA NUCLEAR

• O genoma humano apresenta cerca de três bilhões de pares de bases e apenas 1 a 2%

desse total é codificado, correspondendo a aproximadamente 30.000 genes.

O DNA nuclear pode ser classificado em três tipos:

1. DNA cópia única ou DNA não repetitivo

Representa apenas 50% do genoma, correspondente a uma cópia por genoma. É
o responsável pela codificação dos genes, que são sequências ordenadas de
nucleotídeos localizadas em posições particulares em um cromossomo específico
que codificam produtos funcionais específicos (Proteínas e RNAs).
 Biologia Molecular na Química Forense
Os genes humanos são classificados em:
• Genes de classe I
São os genes responsáveis pela codificação de rRNAs (RNAs ribossomais).
• Genes de classe II
São os genes responsáveis pela codificação de mRNAs (RNA mensageiro) e,
consequentemente, proteínas.
• Genes de classe III
Os genes de classe III são os responsáveis por codificarem o tRNA (RNA
transportador).

2. DNA moderadamente repetitivo

Representa 40% do genoma humano; correspondente a um intervalo de 100 a
100.000 cópias por genoma.
 Biologia Molecular na Química Forense
3. DNA altamente repetitivo
Representa em torno de 10% do genoma; correspondente a mais de 100.000 cópias
por genoma. O DNA repetitivo não é codificado e pode ser representado por
sequências curtas ou similares.

• Essas sequências são encontradas de duas formas:

 Sequências em tandem (agrupadas) (DNA satélite; microssatélite e minissatélite)

 O DNA satélite é uma porção do DNA que se diferencia do restante do genoma

pela composição de bases, apresentando alto conteúdo GC.
 O DNA satélite pode ser classificado em: minissatélite (VNTRs), sequências de 5 a
50 pb, e em microssatélites (STRs), sequências de 1 a 4 pb.
 É por meio dessa variação que se torna possível a identificação humana, já que
cada indivíduo apresenta um padrão diferente em seu genoma dessas repetições.
 Biologia Molecular na Química Forense
Os STRs tornaram-se os marcadores genéticos mais usados devido às seguintes
características:
• Abundância no genoma humano.
• Elevado poder discriminativo.
• Robustez e especificidade em multiplex.
• Baixa taxa de mutação.
• Tamanho previsível dos fragmentos de amplificação, na ordem dos 90-500 pb.
• Estudo fácil mediante técnicas de PCR.

Há no mercado diversos kits (multiplex) capazes de genotiparem essas regiões.

Em casos de mistura de fluidos corporais de ambos os sexos, como é o caso das agressões
sexuais, a tipagem do cromossomo Y pode fornecer informação específica da componente
masculina.
Biologia Molecular na Química Forense
 Sequências dispersas

 São originadas de genes que perderam sua funcionalidade ou de RNAs

que mantiveram sua capacidade de duplicação e de movimentação pelo
genoma.
 Exemplos de sequências dispersas são: SINEs (Short Interspersed
Nuclear Elements), que representam sequências curtas e LINEs (Long
Interspersed Nuclear Elements), que representam sequências maiores.
 O número de cópias dessas sequências no genoma varia, no caso dos
SINEs, correspondem a 7% do genoma, fazendo com que o DNA
repetitivo seja largamente utilizado na investigação forense.
 Biologia Molecular na Química Forense
O DNA MITOCONDRIAL

• As mitocôndrias apresentam DNA próprio, sendo caracterizado por apresentar pequena

dimensão e ser uma molécula circular de fita dupla.

• A distribuição assimétrica de guaninas e citosinas faz com que haja uma cadeia leve (light
chain), constituída majoritariamente por citosinas e uma cadeia pesada (heavy chain),
extremamente rica em guaninas.
 Biologia Molecular na Química Forense
O DNA mitocondrial é constituído por:

a) Região codificante

A região codificante é constituída por 37 genes. Treze desses genes estão

envolvidos na fosforilação oxidativa, 22 são responsáveis por codificarem tRNAs e dois são
responsáveis pela codificação de rRNAs.

b) Região controle ou D-loop

A região controle é também chamada de D-loop ou região hipervariável, pois

acumula mutações pontuais cerca de dez vezes mais comuns que o DNA nuclear. A região
controle é a responsável por comandara síntese de RNA e DNA.
 Biologia Molecular na Química Forense
Características genéticas únicas do DNA mitocondrial (mtDNA)
 Hereditariedade materna
 O genoma mitocondrial é um genoma haploide, devido ao fato de ter sido
provado cientificamente que o seu DNA apresenta herança exclusivamente
materna. Isso ocorre devido a um mecanismo durante a fecundação de
seletividade de mitocôndrias. Dessa forma, a mãe transmite para o filho o seu
genoma mitocondrial, o que faz com que a descendência da linha materna tenha
sempre o mesmo genoma.

 Diante dessa característica de hereditariedade uniparental é possível a realização

de reconstruções de linhas evolutivas por meio do tempo, sem que haja
interferência dos efeitos da hereditariedade biparental e da inerente
recombinação existente no DNA nuclear.
 Biologia Molecular na Química Forense

 Ausência de recombinação
 Outra característica específica do mtDNA é a ausência de recombinação. Não
há evidências da contribuição paterna para o genoma mitocondrial. Diante
disso, o mtDNA é essencialmente constituído por cópias clonais do genoma
mitocondrial materno, comportando-se como um único locus.

 Elevado número de cópias

 O mtDNA está presente nas células em um elevado número de cópias, podendo
variar de acordo com o tipo de célula e tecido.
 Biologia Molecular na Química Forense
 Heteroplasmia

É dado o nome de heteroplasmia a existência de diferentes tipos de mtDNA em um

indivíduo. É um fenômeno resultante de mutações que ocorrem durante a proliferação
das células germinativas ou durante a replicação de células somáticas.

A heteroplasmia pode ser observada de três modos:

a) Um indivíduo pode ter mais de que um tipo de mtDNA no mesmo tecido.

b) Um indivíduo pode ser heteroplasmático em um tecido e homoplasmático.

c) Um indivíduo pode ter um tipo de mtDNA em um tecido e outro tipo em outro.

 Biologia Molecular na Química Forense
 Taxa de mutação

• mtDNA apresenta taxa de mutação muito maior quando comparada à taxa do DNA nuclear.
Esse fato é devido à ausência das histonas presentes no DNA nuclear; à baixa atividade de
reparação da mtDNA polimerase e à grande exposição do mtDNA aos radicais livres gerados
na fosforilação oxidativa.

• mtDNA tem sido amplamente utilizado nas investigações forenses quando a quantidade de
DNA nuclear é muito ínfima, em casos em que ele esteja muito degradado ou em situações
forenses nas quais existem apenas amostras de parentes da linhagem materna para
comparação.

• As técnicas de análise de mtDNA baseia-se nos polimorfismos encontrados nas sequências

hipervariáveis da região controle.
 Marcadores Genéticos
a) VNTRs ou Minissatélites
• VNTR significa “número variável de repetições em tandem”, são polimorfismos de DNA
que consistem em uma série de comprimento de repetições de fragmentos de DNA.
• Uma região VNTR apresenta cerca de 500 a 100pb (pb-pares de bases) repetidas em
sequências e apresentam grande importância nos processos de identificação humana
por exibirem um enorme número de alelos diferentes.
• A importância justifica-se no fato de que seja provável que não existam dois indivíduos
aparentados com o mesmo genótipo.

b) STRs ou microssatélites
• Short tandem repeats ou “repetições curtas em tandem”, os STRs ou microssatélites
são polimorfismos de até 200pb que apresentam grande importância na identificação
humana por serem muito abundantes no genoma humano.
 Marcadores Genéticos
c) Marcadores bialélicos

 Os SNPs (polimorfismos de substituição de nucleotídeos únicos - single

nucleotidepolymorphisms).

 Os polimorfismos de inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos

(polimorfismos de inserção – deleção; ins/del).

• Ambos apresentam a grande vantagem de poderem ser estudados em produtos

de amplificação muito curtos (50 pb ou menos) e, assim, apresentam distintas
vantagens sobre os microssatélites no estudo de DNA extremamente degradado.
Os ins/del são muito mais fáceis de serem tipados porque seus alelos diferem
somente no tamanho.
 Técnicas de Identificação do DNA
• A eletroforese é uma técnica por meio da qual é feita a separação das moléculas do
material genético em função da sua massa (tamanho), forma e compactação.

• Consiste na migração da molécula em questão em suportes (géis) por ação de uma

corrente elétrica, com diferentes velocidades, dependendo do seu tamanho e forma.

• As moléculas migram para o polo positivo, pois são carregadas negativamente, e como
força oposta à migração existe o atrito com o suporte (gel).
 Técnicas de Identificação do DNA
Southern blotting

Uma técnica que utiliza a capacidade da nitrocelulose ligar-se fortemente ao DNA

fita simples, mas não à fita dupla.

1. Clivagem do DNA genômico com enzimas de restrição.

2. Realização da eletroforese com o DNA genômico total.
3. Conversão do DNA na sua forma simples pela ação do NaOH.
4. Transferência das moléculas do gel para a folha de nitrocelulose por
capilaridade.
5. Secagem a 80ºC.
6. Contato da membrana de nitrocelulose com uma sonda (sequência de DNA
conhecida) marcada radioativamente.
7. Hibridização da sonda à sequência alvo.
8. Remoção da sonda por lavagem.
9. Autorradiografia pela exposição a um filme de raio-X.
Técnicas de Identificação do DNA

Southern blotting
 Técnicas de Identificação do DNA
Reação em cadeia da polimerase (PCR)

• Método in vitro rápido e versátil para a amplificação de sequências-alvo de DNA

definidas, presentes em uma preparação de DNA.

• Para que isso ocorra é necessário o contato entre o DNA extraído previamente,
os primers específicos para a sequência alvo, a DNA polimerase termoestável e os
quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP).

• Esses componentes são colocados em um termociclador e após um tempo

definido ocorre a produção de várias sequências de DNA idênticas à sequência
alvo.
Técnicas de Identificação do DNA
 Técnicas de Identificação do DNA
A técnica de PCR é uma técnica extremamente simples e de fácil realização.
Permite resultados em pouco tempo, o que garante a sua preferência pelos
peritos, quando comparado ao tempo gasto com a técnica Southern.

Vantagens da técnica de PCR:

• Velocidade e facilidade de utilização.

• Sensibilidade.
• Robustez.
• Possibilidade de análise de amostras degradadas.
 Amostragem e Coleta de material

• Essa é uma etapa muito importante da investigação de algum delito.

• O material em questão deve ser coletado, manipulado e armazenado de forma a

não perder as suas características intrínsecas responsáveis pela identificação.

• A coleta deve ser feita por profissionais habilitados e sempre que possível em até
24 horas após a ocorrência do delito em questão.
 Amostragem e Coleta de material
É necessário que os profissionais da área possuam um kit próprio de coleta.
• Maleta – destinada para transporte e armazenamento do material de coleta.
• Swab e/ou Cotonete (algodão) – utilizado na coleta de material líquido ou em
manchas secas. Pode ser utilizado cotonete comercial.
• Água destilada estéril – utilizada para umedecer o swab ou cotonete.
• Pinças – coleta de cabelo ou material sólido.
• Luvas descartáveis.
• Máscara cirúrgica.
• Touca cirúrgica.
• Envelopes – transporte e armazenamento das amostras.
• Seringas descartáveis – coleta de líquidos.
• Coletor universal – acondicionamento e transporte de amostras.
• Tubos plásticos – acondicionamento de transporte de amostras.
• Espátula descartável – para coleta de amostras sólidas.
• Estilete (com lâminas descartáveis) – efetuar cortes em tecidos, couro, etc.
• Bisturi (com lâminas descartáveis) – efetuar pequenos cortes e raspagem de
amostras secas.
• Tesoura – efetuar cortes em geral.
 Amostragem e Coleta de material
• Palito de cutícula – para coleta de amostras sob as unhas.
• Algodão hidrófilo.
• Fita adesiva – coleta de amostras.
• Papel (tipo ofício/A4) – coleta e acondicionamento de amostras.
• Isopor (pedaços) – fixar swab ou cotonetes para secar e transportar.
• Sacos plásticos – transporte e armazenamento de amostras.
• Sacos de papel - transporte e armazenamento de amostras.
• Caixa para transporte de swab.
• Caixa de isopor pequena – transporte das amostras.
 Amostragem e Coleta de material
Coleta de Fluidos Corporais (Sangue, esperma, saliva, etc )

• Os fluidos corporais em estado líquido, quando em pequenas quantidades, devem ser

coletados por meio de swab estéril e em grandes quantidades devem ser utilizadas seringas
descartáveis estéreis.

• Em situações em que os fluidos corporais estiverem secos, o procedimento de coleta vai

depender do tamanho e do tipo de objeto em questão. Quando os objetos forem pequenos
e de fácil deslocamento, são enviados inteiros para a análise, exemplos de fluidos
encontrados em roupas e objetos pessoais.

• Já quando estiverem em grandes superfícies de metal, paredes e móveis, devem ser

retirados com o auxílio de espátulas e bisturis estéreis e acondicionados em sacos plásticos
estéreis. Muitas vezes, é necessária a utilização de swab umedecido com água estéril para
facilitar a remoção do fluido.

• Todo procedimento é documentado, descrito e fotografado para fins da investigação.

 Amostragem e Coleta de material
Coleta de Tecidos Ósseos (ossos e dentes)

• Os tecidos duros funcionam como fonte de DNA.

• Todo material ósseo coletado deve ser armazenado em locais estéreis e submetido a
baixas temperaturas, preferencialmente a -20ºC, para evitar o crescimento microbiano.

• Se o congelamento não for possível, o material coletado deve ser armazenado em local o
mais fresco e seco possível para evitar a degradação do DNA.

Coleta de Tecidos Moles (Músculo, gordura, pele, unhas, fios de cabelo, etc)

• As amostras devem ser coletadas utilizando-se de pinças estéreis, em condições

controladas, para evitar possível contaminação, e devem ser armazenadas em condições que
limitem a degradação do DNA.

• Quando possível, as amostras devem ser submetidas ao congelamento (-20ºC a -80ºC).

• Quando essa forma de armazenamento não for possível, as amostras devem ser
armazenadas em locais estéreis em solução de etanol 95% ou soluções tamponantes
comerciais.