Livro Texto - Unidade III

BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA
Unidade III
7 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS À TERAPIA E AO
TRATAMENTO DE DOENÇAS
7.1 Polimorfismos moleculares
O genoma humano é constituído por mais de 3 bilhões de pares de bases. Cerca de 99,5% do DNA
de uma pessoa é o mesmo de qualquer outra pessoa não aparentada. Os seres humanos apresentam
variações em seus genomas que podem ser mudanças de apenas um nucleotídeo ou ganhos ou perdas
de cromossomos inteiros. Os estudos atuais revelaram que as variações genéticas ocorrem no genoma
em uma frequência de 0,1%-0,4% (KARKI et al., 2015). Essas variações explicam as diferenças entre
as pessoas, tais como: cor dos olhos, grupo sanguíneo e se a pessoa possui um alto ou baixo risco de
desenvolver uma determinada doença. É importante relembrar alguns conceitos de genética antes de se
estudar os polimorfismos. Alguns conceitos importantes são:
• Locus (plural loci): posição ocupada por um segmento de DNA no cromossomo.
• Alelos: versões alternativas da sequência de DNA presente no locus.
• Alelo selvagem: alelo predominante em mais de 50% dos indivíduos de uma população.
• Alelo variante: alelo não predominante nos indivíduos de uma população, normalmente
decorrente de uma mutação.
Uma vez relembrados esses conceitos, é possível dar continuidade ao estudo dos polimorfismos
moleculares. Em geral, a grande maioria dos nucleotídeos presentes no genoma de indivíduos diferentes
são as mesmas, casualmente podem ocorrer variantes de qualquer nucleotídeo, no entanto elas são
extremamente raras. Quando uma variante se apresenta com mais de 1% de frequência nos cromossomos
da população, ela é chamada de polimorfismo. Em contrapartida, quando a variante se apresenta com
menos de 1% de frequência, ela é chamada de mutação.
As variantes alélicas são importantes pois podem ser utilizadas como “marcadores” para rastrear
uma sequência genômica correspondente em famílias e em populações. São exemplos dos usos
dessas variantes:
• Mapeamento de genes em uma determinada região de um cromossomo.
• Tipagem de tecidos e órgãos para transplantes.
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Unidade III
• Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas.
• Aplicações forenses, especificamente identificação de restos mortais de vítimas de crimes, testes

de paternidade, comparação do DNA para identificação de suspeitos.
• Farmacogenômica, na qual o tratamento farmacológico é adaptado conforme o paciente carregue

ou não variantes que aumentam ou diminuem a eficácia do tratamento.
• Descoberta de variantes que levem à predisposição de doenças.
Em geral os polimorfismos podem ser classificados em: polimorfismos nucleotídicos individuais e

polimorfismos por inserção-deleção.
Lembrete
Polimorfismo é uma variante cuja frequência de aparecimento nos

cromossomos da população é acima de 1%.
7.1.1 Polimorfismos nucleotídicos individuais
Os polimorfismos nucleotídicos individuais (SNPs, do inglês single nucleotide polymorphisms) são

polimorfismos em que há alteração de um par de base em uma localização específica do genoma. Os
SNPs são os polimorfismos mais simples e mais comuns de todos. Na maior parte dos casos, o SNP tem
apenas dois alelos que ocupam uma certa posição no genoma (item A da figura seguinte). O alelo menos
frequente (raro) deve aparecer com uma frequência inferior a 50% na população. A maior parte dos SNPs
são encontrados em regiões não codificantes do genoma, no entanto existe um número significativo de
SNPs que ocorrem em genes. Cerca de metade desses são sinônimos, ou seja, não alteram a sequência
da proteína, enquanto a outra metade que altera a sequência da proteína são chamados não sinônimos.
Os SNPs não sinônimos são divididos em: missense e nonsense. Um SNP missense é quando ocorre a
mudança em um nucleotídeo e isso leva à alteração de um aminoácido, resultando em uma proteína
pouco funcional ou não funcional. Já o SNP nonsense é uma mutação pontual na sequência de DNA que
leva a formação de um códon de terminação, resultando em uma proteína não funcional.
Saiba mais
Um banco de dados público de SNPs, chamado dbSNP, pode ser

encontrado no link seguinte, acessando projetos e SNP. Nesse banco de
dados os SNPs são designados por números começando com rs.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
182
A. TGCCTTTATTTGGTAATTTTTTTGT[T/C]TCTGAGACAGTCTCACTCTGTTGCC
B. CCAAGCCTGGAGCT[A/G]GCCGTGGGCCAGGCAAG
C. CCTGATTTTATGATCTTCTAACTCT[A/-]AAATTATCACAAAAATTTCTATTGA
Figura 100 – Tipos de polimorfismos. Um SNP simples. O rs133045 é uma variante T/C no cromossomo 22 (A). Um polimorfismo
de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). O SNP rs36078338 cria ou elimina a sequência GCTAGC, que é o sítio de
reconhecimento para a enzima NheI (B). Um polimorfismo de deleção/inserção. O rs36126543 é uma inserção ou deleção
de um único nucleotídeo A em uma sequência do cromossomo 7 (C)
Algumas vezes, o SNP afetará um nucleotídeo que é parte de uma sequência que é reconhecida
por uma enzima de restrição. Isso ocorre em 10% dos SNPs e, portanto, a enzima somente será capaz
de clivar a sequência na presença de um dos alelos. Esse tipo de SNP é conhecido como polimorfismo de
comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs, do inglês restriction fragment length polymorphisms)
e quando esse SNP está presente, ele cria ou elimina o sítio de restrição (item B da figura anterior).
Saiba mais
Alguns polimorfismos são considerados fatores de risco para algumas

doenças. Recentemente o polimorfismo rs2904552 foi associado à
esquizofrenia. O alelo G foi significativamente mais frequente nos pacientes
com esquizofrenia quando comparado aos controles sem a doença. Esse
polimorfismo pode ser mais bem explorado em:
OTA, V. K. et al. PRODH polymorphisms, cortical volumes and thickness

in schizophrenia. PLoS One, v. 9, n. 2, p. e87686, 2014.
As variantes de genes que codificam enzimas responsáveis pelo metabolismo de fármacos, ou que
são alvos de fármacos, estão sendo estudadas em associação à resposta individual ao fármaco. Os SNPs são
muito importantes na área de farmacogenômica, pois seus estudos podem levar ao desenvolvimento
de uma medicina mais personalizada de acordo com a análise dos polimorfismos de cada pacientes.
A associação de diferentes SNPs com as mais diversas doenças tais como câncer, doenças infecciosas
autoimunes, transtornos psiquiátricos e outros pode ser útil como futuros alvos de terapia farmacológica
(SUKHUMSIRICHART, 2018).
7.1.2 Polimorfismos por inserção-deleção
Uma outra classe de polimorfismos é a que resulta de variações causadas pela inserção, deleção
ou inserção e deleção (indels: de inserções e deleções) de 2 a 100 nucleotídeos no genoma (item C da
figura anterior). Os indels podem ser classificados como simples ou multialélicos. Os simples apresentam
dois alelos, ou seja, a presença ou ausência do seguimento inserido ou deletado. Já os multialélicos se
183
Unidade III
apresentam como repetições de fragmentos de DNA em tandem (repetições de 1-6 bases de comprimento
que se encontram uma ao lado da outra no cromossomo intercaladas por outras sequências de DNA). Os
indels multialélicos são subdivididos em microssatélites e minissatélites.
Microssatélites
Os microssatélites são segmentos de DNA de 1 a 10 nucleotídeos repetidos no genoma. A maior

parte dos microssatélites são formados por unidades repetidas de 2, 3 ou 4 nucleotídeos.
A. ACAGAGATAGACACACACACACACACACACACACACACAAACAAGCATGCTC
B. ATCAATGGATGCATACGT(AGAT)15GAGAGGGGATTTATTAGAGGAATTAGC
Figura 101 – Microsatélites. O D6S282 é uma repetição (CA)n no cromossomo 6 (A). D12S391
é uma repetição de quatro nucleotídeos no cromossomo 12 (B)
Os microssatélites também podem ser denominados como polimorfismos de curtas repetições em

tandem (STRs, do inglês short tandem repeat). Um locus de STRs frequentemente é constituído por muitos
alelos (tamanhos de repetição) que podem ser avaliados rapidamente por procedimentos laboratoriais
padronizados para distinguir indivíduos diferentes e para inferir relações de parentesco. Dessa forma,
os STRs têm sido os principais marcadores para estudos forenses, identificação genética de animais e
paternidade por mais de duas décadas. Eles são mais informativos que os SNPs, pois apresentam um
maior número de alelos na população. Essa característica facilita o processo de genotipagem através
da determinação do tamanho do fragmento pela técnica de PCR (do inglês polymerase chain reaction).
Atualmente são conhecidos milhares de loci polimórficos de microssatélites no genoma humano. O quadro
a seguir mostra as principais diferenças entre SNPs e STRs.
Quadro 12 – Principais diferenças entre SNP e STR
Características SNP STR

Ocorrência no genoma 1 a cada 1 kb 1 a cada 15 kb
Tipo de marcadores Maior parte bialélica Di, tri, tetra ou penta
Número de alelos por marcador Normalmente 2 >5
Necessidade de pouco material, Muitos alelos, permitindo altas taxas
Vantagens na área forense maior sucesso em amostras de sucesso na detecção e separação
degradadas de amostras misturadas
Saiba mais
O biomédico com habilitação em genética pode realizar e analisar testes

de paternidade e identificação de perfil molecular na perícia criminal.
Para saber mais informações sobre essa habilitação consulte o website do
Sindicato dos Biomédicos Profissionais do Estado de São Paulo.
www.sinbiesp-biomedicina.com.br
184
Pai Mãe Criança
Tamanho do frangmento
Figura 102 – Esquema de marcador hipotético de microssatélite. O esquema representa as bandas de um gel de agarose após
amplificação por PCR. As bandas superiores representam fragmentos maiores e as inferiores, menores. Cada indivíduo
possui dois alelos com diferentes repetições (diferentes tamanhos) para esse microssatélite. Dessa forma, é possível
observar o parentesco da criança com os pais, pois ela possui um alelo herdado de cada um dos pais
Minissatélites
Os minissatélites são segmentos de DNA de 10 a 100 nucleotídeos repetidos centenas ou milhares de

vezes no genoma. Os minissatélites também podem ser chamados de número variável de repetições em
tandem (VNTRs, do inglês variable number of tandem repeats). Os loci de VNTRs apresentam um grande
número de diferentes alelos, isso se deve à alta taxa de mutações que leva a variações no tamanho. Essa
característica permite diversas possibilidades de genótipos e quando diferentes loci são combinados, o
número total de genomas cresce grandemente. Essas características fazem com que os minissatélites
sejam muito utilizados para identificação de indivíduos. Atualmente 13 loci de minissatélites são
utilizados pelo Federal Bureau of Investigation (FBI) nos Estados Unidos para a identificação de indivíduos
pela impressão digital de DNA (DNA fingerprinting).
7.1.3 Polimorfismos por número de cópias
Os polimorfismos por variação do número de cópias (CNVs, do inglês copy number variants) são
variações no número de cópias de maiores fragmentos do genoma, que variam de 1 mil pb a muitas
centenas de pares de quilobases. As CNVs menores são semelhantes às indels e muitas vezes apresentam
somente dois alelos (presença ou ausência do seguimento inserido ou deletado). Já as CNVs maiores
apresentam normalmente múltiplos alelos, devido à presença de números diferentes de cópias em tandem
de um fragmento de DNA. Os CNVs, em geral, são responsáveis pelo maior número de nucleotídeos que
diferem os genomas. Alguns CNVs aparentemente não têm influência no fenótipo, no entanto, mais de
40 CNVs estão relacionados a doenças. Os CNVs mais conhecidos são as repetições de trinucleotídeos
(TNRs, do inglês trinucleotide repeats), que consiste na repetição de três nucleotídeos em tandem. Os
TNRs apresentam uma expansão e contração dinâmica que está relacionada a diversas doenças, como
por exemplo a síndrome do X frágil (CLANCY, 2008).
O National Human Genome Research Institute (NIH) dos Estados Unidos criou um programa chamado
HapMap Project que tem como um dos objetivos estudar as variações genéticas dos indivíduos. Até
185
Unidade III
o presente momento, mais de 80 milhões de variantes foram encontradas, incluindo SNPs, indels e
outras. Esses dados são importantes para o desenvolvimento de marcadores genéticos de doenças
e principalmente para relacionar as variantes genéticas ao fenótipo dos indivíduos.
7.1.4 Origem das mutações
As mutações podem ocorrer em células da linhagem germinativa e em células somáticas. Quando a

mutação ocorre nas células da linhagem germinativa, ela pode ser transmitida para a prole. Portanto,
cada célula do embrião carregará a mutação. Em contrapartida, quando ela ocorre em uma célula
somática, não há transmissão para a prole, mas a mutação pode ocorrer em qualquer local do corpo
humano e pode ser transmitida às células-filhas através do processo de mitose. Estima-se que entre
10 mil e 1 milhão de nucleotídeos sejam danificados por célula humana por dia devido a diversos
fatores tais como: influências ambientais, exposição a determinados reagentes químicos, mutações
espontâneas e erros durante a replicação que levem a alterações no DNA.
Um dos principais fatores ambientais que causam mutações no DNA é a exposição a luz ultravioleta.
Um exemplo é a hidrolise da base citosina para sua forma hidratada, o que leva ao pareamento incorreto
com a adenina. Dessa forma, durante a replicação, a citosina hidrolisada será substituída por timina.
Essa substituição em genes está altamente associada a carcinomas. A luz ultravioleta também pode
levar à formação de pontes covalentes entre bases pirimidinas adjacentes na fita do DNA, resultando
na formação de dímeros de pirimidina. Normalmente existe um mecanismo de reparo que corrige essas
mutações, no entanto quando esse sistema não funciona, esses dímeros não serão reparados.
Lembrete
Os agentes químicos, principalmente os que liberam radicais livres,

podem modificar nucleotídeos, alterando o pareamento das bases
nitrogenadas. Um exemplo é o benzo[a]pireno que é um carcinogênico
presente no cigarro. Esse composto é capaz de induzir lesões na base
guanina no gene supressor de tumor P53, consequentemente, a célula
perde um importante mecanismo de reparo e esse tipo de mutação está
altamente correlacionada ao câncer de pulmão.
As mutações espontâneas, como o próprio nome já diz, ocorrem espontaneamente. Por exemplo, a
despurinação, no qual uma base purina sofre hidrolise e isso, se não corrigido, pode levar à incorporação
incorreta de base nitrogenada, causando a mutação. A desaminação também é um outro exemplo de
mutação espontânea. A desaminação é a remoção de um grupo amina da base, se ocorre a desaminação
da citosina, ela é convertida em uracila, que irá parear com a adenina em vez da guanina na próxima
replicação, levando a uma substituição de base. O mecanismo de reparo do DNA pode reconhecer uma
uracila como não pertencente ao DNA e irá ocorrer o reparo normalmente. No entanto, se a citosina
estiver metilada, a desaminação resultará na conversão para timina. A timina, por ser uma base natural
do DNA, não será reconhecida pelo sistema de reparo. Mais de 30% das substituições de nucleotídeos
únicos ocorrem por esse mecanismo.
186
Lembrete
O processo de replicação do DNA é altamente fidedigno, a maior parte

dos erros é rapidamente removida do DNA e corrigida pelo mecanismo
de reparo celular. A taxa de mutação total por base é menor que 1x10-10
por divisão celular, ou seja, menor que uma mutação por genoma, por
divisão celular.
Um exemplo de mutação que pode ocorrer durante a replicação do DNA é a expansão dos TNRs,
como mencionado anteriormente.
Quadro 13 – Exemplos de mutações e doenças genéticas
Mutação Definição Exemplo (Gene) Doença/condição

Mutação pontual Alteração de um par de base A>G, A>T
Alteração de um nucleotídeo que A82P
Missense resulta em um códon que codifica Deficiência 3βHSD
(Não sinônima) um aminoácido diferente (HSD3B2)
Substituição de um nucleotídeo que
Nonsense resulta em um códon de terminação G23X (HBB) Talassemia beta
prematuro
Alteração de um nucleotídeo que
Sinônima resulta em um aminoácido com V1531(GJB2) Perda auditiva
propriedades similares ao substituído
Deleção, inserção ou duplicação de
Alteração de matriz Hipercolesterolemia
um nucleotídeo não divisível por 3 920dupTCAG (LDLR)
de leitura familiar
alterando a matriz de leitura
Variações no número de cópias de
CNVs (CGG)n>200 (FMR1) Síndrome do X frágil
maiores fragmentos do genoma
Adaptado de: Mahdieh et al. (2013).
Existem também alguns elementos móveis no genoma, que se movem pelo DNA e são importantes
pois originam as sequências repetitivas no nosso genoma e também são um importante mecanismo de
resistência em bactérias, são eles:
• Transposons: elementos transponíveis presentes no genoma que têm a capacidade de mudar de

posição ao longo do cromossomo. Os transposons podem inserir cópias de si mesmos em outra
região do genoma ou se deslocarem no genoma inserindo-se em outra posição. Muitos transposons
são compostos por genes e a grande maioria estão presentes em bactérias. Alguns transposons de
eucariotos estão presentes em Drosophila (elemento P) e milho (elementos Ac e Ds).
• Retrotransposons: esses elementos são identificados no genoma pois são ladeados por
sequências terminais repetidas (LTRs, do inglês long-terminal repeat), semelhante às encontradas
nos retrovírus. Eles se mobilizam por retrotransposição, ou seja, são capazes de codificar uma
187
Unidade III
transcriptase reversa que permite a replicação desses elementos. Os retrotransposons foram

encontrados no genoma de diversos organismos e em maior quantidade em Drosophilas.
• Lines (do inglês long intersperced elements): os lines também se movem por retrotransposição,
mas não possuem LTRs e não codificam transcriptase reversa, mas sim enzimas de alta homologia
que têm a mesma função. No homem e no camundongo, o elemento line mais comum é o L1. No
genoma humano temos 850 mil cópias de L1 e acredita-se que ele seja responsável por mutações
que causaram doenças genéticas.
• Sines (do inglês short intersperced elements): os sines são semelhantes aos lines, mas são
sequências menores. Um exemplo são as sequências Alu, que estão presentes de 500 mil a
1 milhão de cópias no genoma humano. Há casos de doenças hereditárias que ocorreram devido à
inserção dessas sequências em genes funcionais. Parece que a multiplicação dos sines foi recente.
Juntos, lines e sines, representam 40% do genoma humano.
7.1.5 Polimorfismos moleculares e doenças
A maior parte das sequências variantes presentes na população são inofensivas e muitas vezes não
tem efeito no fenótipo. Algumas variantes levam a alteração do fenótipo, mas isso faz parte da variação
normal de indivíduo para indivíduo. No entanto, certas variantes estão relacionadas a doenças ou à
susceptibilidade a desenvolver doenças.
A anemia falciforme é uma doença causada por uma mutação missense que leva à substituição de
um aminoácido polar por um apolar na molécula de globina presente na hemoglobina. Essa alteração
leva à agregação da proteína e alteração da morfologia das hemácias. Algumas variantes levam a
alterações de matriz de leitura, isso normalmente ocorre quando há deleção ou adição de nucleotídeos
não múltiplos de 3. Um exemplo é o que ocorre no gene GJB2, que codifica a proteína conexina 26, um
importante componente das junções comunicantes. A adição de apenas um nucleotídeo forma um códon
de terminação prematuro no gene. Essa é a mutação mais frequente na surdez autossômica recessiva
na maior parte da população europeia.
éxon 1 éxon 2
Normal L G G V N
CTG GGG GGT GTG AAC
Mutante L G V Terminação
CTG GGG GTG TGA
Figura 103 – Exemplo de alteração de matriz de leitura. A deleção de um nucleotídeo no gene GJB2
leva à alteração da matriz de leitura, formando um códon prematuro no éxon 2
188
Saiba mais
Para ter mais informações sobre mutações e doenças genéticas, leia:
NUSSBAUM, R. et al. Livro de genética médica. 8. ed. São Paulo:

Elsevier, 2016.
7.2 Técnicas de detecção de mutações gênicas
Anteriormente, estudamos os principais tipos de mutações encontrados no nosso genoma. Agora

vamos estudar as diversas técnicas utilizadas na detecção dessas mutações. É muito importante
a identificação dessas mutações, pois muitas delas são responsáveis por doenças genéticas. Além
disso, essas técnicas são muito úteis na identificação de vítimas, testes de paternidades e demais
ensaios forenses. Estes últimos serão abordados com mais detalhes adiante. Os métodos podem ser
divididos em citogenéticos e moleculares. Os métodos citogenéticos estudam as alterações estruturais
e numéricas dos cromossomos. Já os métodos moleculares são capazes de identificar alterações
menores e muitas vezes pontuais que não conseguem ser detectadas pelos métodos citogenéticos.
Estudaremos agora os seguintes métodos citogenéticos: cariótipo, hibridização in situ por fluorescência
(Fish, do inglês fluorescence in situ hybridization) e hibridização genômica comparativa (CGH, do
inglês comparative genomic hybridization). Também serão abordados os métodos moleculares:
polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs, do inglês restriction fragment
length polymorphisms), reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) e
suas variantes e sequenciamento de DNA.
7.2.1 Cariótipo
Cariótipo é o processo de parear e ordenar os cromossomos de um organismo. A preparação do

cariótipo envolve o uso de corantes específicos que auxiliam na identificação dos cromossomos. A coloração
considerada atualmente como padrão ouro para detecção e caracterização de anormalidades genômicas
estruturais e numéricas é o bandeamento Giemsa (bandeamento G). A figura seguinte mostra um
exemplo de cariótipo humano realizado por bandeamento G.
189
Unidade III
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y
Figura 104 – Exemplo de cariótipo humano por bandeamento G
O cariótipo normal de mulheres e homens são 46, XX e 46, XY, respectivamente. Quando ocorre
uma anormalidade, o cariótipo também descreve o tipo de anormalidade e as bandas do cromossomo
ou sub‑bandas afetadas. O exame de cariótipo é aconselhado nas seguintes ocasiões: suspeita de
anormalidade cromossômica, desordens sexuais, anormalidades congênitas múltiplas e/ou envolvendo
retardo mental, deficiência de aprendizado não diagnosticado, infertilidade ou abortos de repetição
e tumores.
O preparo do cariótipo envolve uma série de etapas:
• Escolha da célula: como os cromossomos só são visíveis em células que estão em divisão, é
necessário recorrer a tecidos que têm naturalmente muitas células em divisão (como o da medula
óssea) ou induzir as células a se dividirem. O reagente fito-hemaglutinina é utilizado para induzir
a divisão dos linfócitos do sangue periférico.
• Parar as células na metáfase: nessa etapa os cromossomos são mais distinguíveis porque ficam
grossos e curtos; portanto, é preciso acumular células em metáfase para o estudo. Por isso, se usa
o reagente colchicina (1 h).
• Separação dos cromossomos: a técnica deve fazer com que os cromossomos fiquem bem
separados uns dos outros, para uma boa identificação. Por isso, é utilizada uma solução hipotônica,
normalmente cloreto de potássio que “libera” os cromossomos.
• Coloração: o material é fixado, depositado sobre uma lâmina de vidro e corado com corante
de Giemsa.
190
Observação
A conchicina é um alcaloide extraído de plantas do gênero Colchicum

(autumn crocus) que impede a polimerização das fibras do fuso por meio
da ligação com a proteína tubulina. Dessa forma, impede a anáfase e as
células ficam paradas em metáfase (LEUNG; YAO HUI; KRAUS, 2015).
Após a coloração, os cromossomos podem ser fotografados ou digitalizados e organizados

por tamanho e posição do centrômero. Quando o centrômero é localizado no meio, o cromossomo
é denominado metacêntrico (1, 3, 16, 19 e 20). Quando o centrômero é localizado próximo às
extremidades, acrocêntrico (13, 14, 15, 21, 22 e Y) e todos os outros são submetacêntricos. Um outro
tipo de cromossomo, o telocêntrico, com o centrômero numa extremidade e apenas um único braço,
não ocorre no cariótipo humano normal, mas pode ser observado em rearranjos cromossômicos.
Os braços dos cromossomos são definidos por números de regiões distantes do centrômero, números de
banda, sub-banda e sub-sub-banda. Por exemplo: 12q13.12 se refere ao cromossomo 12, braço longo,
região 1, banda 3, sub-banda 1, sub-sub-banda 2.
Diversas doenças podem ser diagnosticadas com o auxílio do cariótipo, por exemplo, a síndrome
de Down, que é causada pela trissomia do cromossomo 21, a síndrome de Turner, que é causada pela
monossomia do cromossomo X.
7.2.2 Hibridização in situ por fluorescência (Fish)
O método Fish consiste na hibridização de uma sonda marcada no cromossomo denaturado, na

fase de metáfase ou intérfase, previamente fixado em uma lâmina. A sonda pode ser marcada com um
fluoróforo que se anelará a uma sequência específica de DNA, permitindo ser visualizado em microscópio
de fluorescência. Com esse método é possível utilizar diferentes fluoróforos e, consequentemente,
marcar diversas sequências diferentes do DNA. O método de Fish é utilizado para detectar a presença ou
ausência de uma determinada sequência do DNA ou para marcar sequências repetidas.
Em geral, a técnica de Fish tem uma maior resolução e especificidade quando comparada a
análise por bandeamento G, mas ela não permite uma análise eficiente do genoma inteiro. A sua
utilização permite a análise de um alvo específico conhecido, mas não a procura de sequências
desconhecidas. Essa técnica é muito utilizada para verificar as causas de trissomias, microdeleções,
entre outras alterações.
A figura seguinte mostra um exemplo do emprego da técnica de Fish para diagnóstico da leucemia
linfoblástica aguda (LLA).
191
Unidade III
Célula normal Célula de paciente com LLA

ABL (9q34)
BCR (22q11)
BCR-ABL
Figura 105 – Exemplo do uso da técnica de Fish para diagnóstico de LLA. A foto da esquerda representa
uma célula normal marcada com uma sonda vermelha para o gene ABL (9q34) e BCR verde (22q11),
a foto da direita, os genes ABL e BCR marcados em vermelho e verde, respectivamente, e a
fusão dos genes BCR-ABL, em amarelo
Saiba mais
Você sabe o que é LLA? A LLA é o segundo mais frequente tipo de

leucemia em adultos. Para saber mais leia:
TERWILLIGER, et al. Acute lymphoblastic leukemia: a comprehensive

review and 2017 update. Blood Cancer J., v. 7, n. 6, 2017.
7.2.3 Hibridização genômica comparativa (CGH)
A técnica de hibridização genômica comparativa (CGH, do inglês comparative genomic

hybridization) é baseada na comparação do DNA genômico total, por exemplo de uma célula tumoral,
com o DNA genômico de uma célula normal. Normalmente, uma quantidade idêntica de DNA do
tumor e da célula normal são marcados com dois fluoróforos diferentes que marcam todo o genoma.
A mistura é colocada em uma lâmina e a razão dos sinais das duas cores é comparada ao longo de
cada cromossomo para identificar as diferenças entre eles. Uma variante do CGH são os arranjos de
CGH, nessa técnica, utiliza-se um suporte sólido (microarranjo), contendo sequências de DNA que
foram previamente ordenadas em mapas lineares correspondendo a cada cromossomo. Assim como
no CGH convencional, a amostra investigada é marcada com um fluoróforo e o DNA controle com
um, diferente. As duas amostras são simultaneamente hibridizadas no microarranjo. Posteriormente
é calculada a razão entre a amostra investigada em relação ao controle. Um excesso de sequências
de DNA em uma amostra ou de outra indica uma super ou sub-representação dessas sequências no
genoma da investigada em relação ao controle.
192
Microarranjos com
fragmentos de DNA
Super-representação
Sem alteração
Sub-representação
DNA DNA
Investigado Controle
Figura 106 – Exemplo de microarranjos de CGH
É importante ressaltar duas limitações dessa técnica. A primeira é que apenas o número de cópias
de DNA relativo à amostra controle é mensurado. A segunda, é de que nem sempre essas variações têm
um significado clínico importante, a maior parte parece ser uma variação benigna.
7.2.4 Polymerase chain reaction (PCR) e suas variantes
Para realização de uma reação de PCR, é necessário um par de oligonucleotídeos iniciadores (do
inglês primers), cujas sequências devem ser complementares às regiões terminais da sequência a ser
amplificada. A enzima Taq polimerase (derivada de uma bactéria que vive a 90 °C) é utilizada na reação
para que as bases nitrogenadas sejam adicionadas e a sequência de DNA seja amplificada. Durante a
reação, a dupla fita de DNA deve ser aquecida a 95 °C e posteriormente resfriada para que ocorra o
anelamento dos primers com a sequência e em seguida ocorra a amplificação pela Taq polimerase.
Basicamente a reação ocorre em três etapas:
• Denaturação da dupla fita: aquecimento do DNA a 95 °C para que ocorra a separação das fitas
que constituem a molécula de DNA.
• Anelamento dos primers: normalmente esta etapa ocorre em torno de 50 °C para que os primers
possam se anelar com a sequência de DNA complementar na dupla fita, delimitando, assim, a
região que será amplificada. Portanto, todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm
a sequência dos primers nas extremidades.
• Extensão/polimerização: normalmente a extensão ocorre por volta de 72 °C e nessa etapa

ocorre a ação da Taq polimerase que adicionará as bases livres, complementares a sequência que
está sendo amplificada. Esse alongamento ocorre no sentido 5’→3’.
193
Unidade III
Lembrete
A PCR foi descoberta em 1983 por Kary Mullis. A técnica é baseada na

amplificação de diversas cópias de uma sequência específica de DNA, por
exemplo, a de um determinado gene.
O conjunto das etapas de desnaturação, anelamento e extensão é chamado de ciclo. Este se repete,
normalmente, de 35 a 45 vezes, levando à amplificação exponencial da região alvo. Muitas variantes dessa
reação foram desenvolvidas, entre elas, as principais são a PCR pela transcriptase reversa (RT-PCR, do inglês
reverse transcription PCR) e a PCR em tempo real ou qPCR (do inglês quantitative PCR). As reações de PCR
são realizadas em equipamentos chamados termocicladores.
Figura 107 – Exemplo de termociclador
Observação
Outras enzimas também podem ser utilizadas na reação de PCR,

alguns exemplos são a Vent polimerase e Pfu polimerase. Essas enzimas
são interessantes, pois o produto amplificado possui extremidades cegas,
diferentemente da Taq que adiciona uma adenina extra no terminal 3’.
A RT-PCR é uma técnica que usa como molde o RNA, ao invés do DNA, como na PCR convencional. Para
que a reação ocorra, é necessário utilizar uma enzima que funcione como DNA-polimerase, mas que use
como molde o RNA. Essa enzima é denominada transcriptase reversa e ela é capaz de sintetizar uma fita de
DNA complementar (cDNA, do inglês complementary DNA) a partir do RNA. Inicialmente é necessário realizar
194
a extração das moléculas de RNA mensageiro (RNAm) das células ou do tecido alvo. É importante que não
existam traços de DNA na amostra. Os RNAs possuem uma cauda de poli A (sequências repetidas de adenina)
e, por isso, é possível utilizar um primer denominado Oligo dT (formado por uma sequência de timinas) que
se anela à cauda de poli A. A partir desse ponto a transcriptase reversa inicia o processo de síntese do cDNA.
Uma vez sintetizado o cDNA, a reação poderá seguir como na PCR convencional.
5’ 3’
A) A U G C U G C A G U C A A A A A A
B) 5’ 3’
A U G C U G C A G U C A A A A A A
T T T T T T
3’ 5’
C) 5’ 3’
T T T T T T
G T C A G 5’
A C
C G
A
T Transcriptase
Reversa
dNTPs
5’ 3’
D) A U G C U G C A G U C A A A A A A
T T T T T T
Transcriptase
Reversa
A G
5’
G T C
A C
C G
A
T
5’ 3’
T A C G A C G T C A G T T T T T T
E) Transcriptase
Reversa 5’
T A C G A C G T C A G T T T T T T
F)
3’ 5’
A T G C T G C A G T C A T G C T G C A G T C
G) T A C G A C G T C A G T A C G A C G T C A G
Figura 108 – Exemplo de reação de RT-PCR. A reação se inicia com a amplificação de um molde de RNA (A). Para que a
reação se inicie, é necessária a ligação do oligo dT (B) que funciona como primer para que a transcriptase reversa possa
adicionar os nucleotídeos (C). A reação prossegue (D) com a formação do cDNA (F) que será utilizado como molde
para amplificação por PCR convencional (G). dNTPs: desoxirribonucleotídeos fosfatados
195
Unidade III
A grande vantagem da RT-PCR é que ela torna possível a análise da expressão gênica, pois usa como
molde o RNA. Embora a reação não possa ser considerada quantitativa, é possível avaliar se o gene é muito
ou pouco expresso em determinadas células/tecidos ou se um dado tratamento farmacológico pode alterar
a expressão do gene. A figura seguinte mostra a foto de um gel de agarose, após a corrida por eletroforese.
É possível identificar os diferentes níveis de expressão gênica de acordo com o tipo de tecido estudado.
M A B C D E F
100pb
100pb
Figura 109 – Exemplo de análise da expressão do gene Idua por RT-PCR. A figura representa a corrida da eletroforese do produto
da RT-PCR. O gel de cima representa a expressão do gene Idua em diferentes tecidos e a foto de baixo representa a expressão
do gene controle Gapdh. Controle negativo sem cDNA (A), coração (B), músculo esquelético (C), rim (D), baço (E) de
camundongos normais, baço de camundongo nocaute para o gene IDUA (F)
Saiba mais
Camundongos nocautes são animais em que um ou mais genes foram

desligados. Esses modelos são muito utilizados para doenças genéticas,
como, por exemplo, o caso da doença mucopolissacaridose do tipo I (MPSI),
doença de acúmulo lisossomal que ocorre devido a mutações no gene IDUA
(alfa L Iduronidase). Para saber mais sobre a doença MPSI e os modelos
nocautes, leia:
GENETICS HOME REFERENCE. Mucopolysaccharidosis type I. 2012.

Disponível em: https://ghr.nlm.nih.gov/condition/mucopolysaccharidosis-
type-i. Acesso em: 28 abr. 2020.
KNOCKOUT Mouse Models. Genoway, [s.d.]. Disponível em: https://www.

genoway.com/services/customized-mouse/knockout-models/overview.
htm. Acesso em: 28 abr. 2020.
Uma outra variante da PCR é a PCR em tempo real, também conhecida por qPCR (do inglês quantitative
PCR). Essa técnica permite realizar uma série de análises tais como: avaliação quantitativa da expressão
gênica, avaliação do número de cópias de um gene, genotipagem, entre outras. A primeira etapa da
qPCR é semelhante à RT-PCR, em ambas é realizada a extração do RNA que segue para a transcrição
reversa, no entanto, na qPCR é adicionado um marcador fluorescente que é capaz de emitir fluorescência
à medida que as duplas fitas de DNA estão sendo formadas. A medida da fluorescência é utilizada para
avaliar em tempo real o progresso da reação e essa medida é proporcional a quantidade de RNAm
presente na amostra. Portanto, é possível verificar a superexpressão ou subexpressão de determinados
genes. No caso de células tumorais, é possível verificar quais genes estão super ou subexpressos em
relação à célula normal.
196
A qPCR é muito utilizada na área de diagnósticos moleculares. Alguns exemplos são a quantificação
da carga viral em pacientes portadores de determinados vírus, detecção de patógenos, diagnóstico de
doenças genéticas, identificação de mutações e pré-disposição genética para determinadas doenças,
entre outras (ALBERTS, 2017).
Observação
A PCR em tempo real é utilizada no monitoramento da evolução

da síndrome de imunodeficiência humana (Aids), causada pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV). A quantificação do RNA do HIV-1 (carga viral)
é considerada o marcador laboratorial de escolha para o acompanhamento
da resposta do paciente à terapia antirretroviral. Essa metodologia apresenta
limite mínimo de detecção de 40 cópias/mL.
Esse exame é realizado pelo setor de biologia molecular em laboratórios

de análises clínicas.
Os principais tipos de reagentes empregados em qPCR são:
• SYBR Green: é um marcador intercalante de DNA, ele se liga na dupla fita da molécula de DNA e
emite um sinal fluorescente. A excitação máxima do SYBR Green é 494 e 521 nm. A intensidade
do sinal aumenta proporcionalmente ao número de ciclos da reação, devido ao acúmulo do
produto da PCR. Para a reação ocorrer, são necessários primers específicos, o reagente SYBR Green
que normalmente é vendido na forma de master mix (mistura de SYBR Green e dNTPs) e um
equipamento capaz de realizar a leitura da fluorescência.
Anelamento
SYBR Green
5’ 3’
3’ 5’
Polimerização
5’ 3’
Figura 110 – Exemplo de reação de PCR em tempo real com o reagente SYBR Green
197
Unidade III
• Sondas TaqMan: as sondas TaqMan são sequências específicas de oligonucleotídeos que carregam
um fluoróforo, também chamado de repórter, no terminal 5’, e um quencher (absorve a fluorescência
emitida pelo fluoróforo) no 3’. Durante a fase de anelamento/extensão, a sonda é clivada pela Taq
polimerase que tem atividade éxonuclease 5’-3’, separando o fluoróforo do quencher. A fluorescência
que passa a ser detectada é proporcional à quantidade de produto da PCR.
R = Repórter
Polimerização Q = Quencher
Primer senso R Sonda Q

5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’
Primer reverso
R
Clivagem Q
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’
R Q
Polimerização
completa 3’
5’
3’ 5’
5’ 3’
5’
Figura 111 – Exemplo de reação de PCR em tempo real com sonda TaqMan
Saiba mais
A PCR em tempo real com sondas é muito utilizada na detecção de

SNPs e genotipagem, nesse caso, para cada SNP é desenhada uma sonda
específica com um determinado fluoróforo e o equipamento é capaz de
realizar a leitura dos fluoróforos e posterior análise dos dados. Para saber
mais, leia:
SUKHUMSIRICHART, W. Polymorphisms. In: LIU, Y. Genetic diversity and

disease susceptibility. London: IntechOpen, 2018.
198
7.2.5 Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
O método polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs, do inglês restriction

fragment length polymorphisms) é baseado na capacidade de determinadas enzimas em clivarem uma
sequência específica de DNA. As diferenças entre os alelos podem ser observadas quando os SNPs fazem
parte da sequência reconhecida pela enzima. Para a genotipagem de SNPs, é necessária a amplificação
da sequência que contém o SNP por PCR. O produto dessa reação é incubado com a enzima de restrição
e separado por eletroforese em gel de agarose. A genotipagem dos SNPs é determinada através do
tamanho dos fragmentos obtidos após a eletroforese. Uma limitação dessa técnica é que nem todos os
SNPs são reconhecidos por sequências de enzimas.
C C A G G C C A C G
G G T C C G G T G C
Mval
C C A G G C C A C G
G G T C C G G T G C
C C A G G C C A C G
G G T C C G G T G C
M CC GG GC
100 pb -
71 pb
50 pb -
32/39 pb
Figura 112 – Exemplo de RFLP e separação por eletroforese em gel de agarose. A enzima MvaI reconhece a sequência de DNA
CCWGG, o W representa os nucleotídeos A ou T. A troca de G>C faz com que a enzima não reconheça mais o sítio de restrição
e após a eletroforese é possível observar o tamanho dos fragmentos obtidos. No indivíduo com genótipo CC será observado um
fragmento de 71 pb, referente ao produto de PCR amplificado dos dois alelos e não clivado pela enzima de restrição. No indivíduo
GG será observado um fragmento referente à sobreposição dos produtos da clivagem pela enzima, um de 32 pb e outro de 39 pb. No
heterozigoto GC serão observados dois fragmentos, um de 71 pb referente ao alelo que não possui o sitio de restrição da enzima e
outro fragmento referente ao outro alelo que possui o sitio de restrição da enzima
7.2.6 Sequenciamento de DNA
Dois tipos de sequenciamento são muito utilizados para determinação de mutações gênicas,
são eles o sequenciamento de Sanger e o sequenciamento de última geração (NGS, do inglês next
generation sequencing).
O sequenciamento de Sanger (nome do cientista que desenvolveu a metodologia) utiliza os

didesoxirribonucleosídeos trifosfato (ddNTPs) que são derivados dos desoxirribonucleosídeos trifosfatos
(dNTPs), porém sem o grupo 3’hidroxila e com a adição de um marcador fluorescente. Para reação
199
Unidade III
ocorrer, utiliza-se uma DNA polimerase, primers, ddNTPs e dNTPs. Quando a DNA polimerase adiciona o
ddNTP, a polimerização do DNA é interrompida, gerando diversos fragmentos de diferentes tamanhos.
Os fragmentos são aplicados em um capilar fino e longo e são separados por eletroforese. Uma câmara
faz a leitura da fluorescência e transmite a informação para um programa no computador que monta a
sequência. O método de Sanger permitiu um grande avanço na área de sequenciamento de DNA, sendo
crucial para o desenvolvimento do projeto internacional do genoma humano. Esse projeto permitiu o
sequenciamento de genomas humanos e de muitos outros organismos.
Primer
5’ 3’
3’ 5’
DNA
ddNTPs
ddTTP
ddCTP
ddATP
ddGTP
Capilar
Polimerização
5’ 3’ Laser Câmara
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
Cromatográfo
Figura 113 – Exemplo de sequenciamento de DNA por Sanger
Saiba mais
O Projeto Genoma iniciou em 1990 e teve como objetivo determinar a

sequência de DNA do genoma humano. Saiba mais sobre esse ambicioso
projeto no artigo:
CHIAL, H. DNA sequencing technologies key to the Human Genome

Project. Nature Education, v. 1, n. 1, p. 219, 2008.
Métodos mais novos que começaram a ser desenvolvidos a partir de 2005 permitiram que o
sequenciamento dos genomas ficasse mais rápido e barato. Esses métodos são chamados de NGS e
permitem o sequenciamento de diversos genomas em paralelo, em algumas semanas. O NGS permitiu
o descobrimento das mais diversas variações nas sequências dos nucleotídeos e permitiu que novas
mutações fossem reveladas. Diferentes métodos de NGS são utilizados atualmente, como por exemplo
200
o sequenciamento Illumina e Íon Torrent. O sequenciamento por NGS é uma maneira mais eficiente de
identificar mutações raras.
7.3 Testes de paternidade e forense
Agora que você já aprendeu sobre os diversos tipos de variações gênicas e as diferentes técnicas
para identificação de mutações gênicas podemos prosseguir com o uso do DNA nos testes de
paternidade e forense.
7.3.1 A impressão digital de DNA
A palavra forense está relacionada a testes científicos usados pela polícia na tentativa de solucionar
crimes. Dessa forma, podemos interpretar que DNA forense seria o uso do DNA na investigação
criminal. A característica do DNA que permite diferenciar os indivíduos, relacionados ou não, a partir
de uma amostra qualquer que contenha material genético, é conhecida como impressão digital de
DNA, ou do inglês DNA fingerprint. O primeiro relato de identificação criminal por meio do exame de DNA
ocorreu em 1985, na Inglaterra. O Dr. Alec Jeffreys, um geneticista da Universidade de Leicester, na
Grã-Bretanha, usou a técnica de RFLP para identificar o suspeito de dois assassinatos. Desde então,
o DNA passou a ser um dos principais exames solicitados para identificação de vítimas, suspeitos de
crimes e testes de paternidade.
O uso do DNA só é possível devido à variabilidade genética de cada indivíduo. Os indivíduos

mais próximos apresentam maior similaridade na sua sequência de DNA, enquanto indivíduos mais
distantes possuem sequências mais distintas. Somente os gêmeos idênticos apresentam a mesma
sequência de DNA.
As regiões do DNA utilizadas nas análises de DNA forense são os microssatélites ou STR (do inglês
short tandem repeats). Os STRs se localizam em um loci que é comum nos seres humanos, porém a
sequência de nucleotídeos e o número de vezes que se repetem é variável o suficiente para ser única
em cada indivíduo. É assim que se forma a impressão de DNA digital do nosso código genético e essa
impressão é herdada dos pais e, por isso, também é possível realizar a identificação de parentesco. Na
década de 1990, os minissatélites ou VNTRs eram muito utilizados para impressão digital de DNA, mas
a grande limitação desse marcador era a necessidade de se obter uma grande quantidade de amostras
de DNA da cena do crime, pois a técnica utilizada era a de Southern blotting, além disso o padrão de
bandas era de difícil interpretação devido ao problema de binning. Esse problema ocorria quando não
era possível dizer quais pares de bandas representavam os alelos. Dessa forma, era necessário comparar
duas impressões digitais de DNA em cada banda, individualmente, por posição e intensidade. A distância
no gel tinha que ser dividida pelo número de bins. As bandas que apresentavam o mesmo bin eram
denominadas correspondentes. Por exemplo, se dez de dez bandas forem correspondentes, a chance de
a amostra ser do suspeito, em vez de uma pessoa aleatória da população, é 1 em p10, sendo p é a chance
da banda de uma pessoa aleatória ser correspondente.
201
Unidade III
Saiba mais
Southern blotting é uma técnica que permite a identificação de

fragmentos de DNA específicos. Essa técnica se tornou obsoleta frente às
novas metodologias de PCR. Para saber mais sobre essa técnica, acesse:
AGENOR, D. Southern blotting. UFMG, [s.d.]. Disponível em: http://labs.

icb.ufmg.br/lbcd/grupoc/1southBlotg.html. Acesso em: 28 abr. 2020.
Por conta desses entraves, os STRs tornaram-se o padrão de escolha para impressão digital de DNA.
Eles são facilmente genotipados por PCR, utilizando uma pequena quantidade de material biológico.
Os alelos podem ser definidos sem ambiguidade pela precisa repetição numérica, evitando o problema
de binning. Painéis padronizados de microssatélites são utilizados em diferentes jurisdições. A tabela
seguinte mostra os principais exemplos dos painéis usados pelo CODIS (combined DNA index system),
utilizado pelo FBI dos Estados Unidos e SGM+ (second generation multiplex) na Europa. O CODIS utiliza
13 STRs mais amelogenina para determinação do sexo, em contrapartida o SGM+ 10 STRs mais a
amelogenina. Novos sistemas que amplificam 16 loci (incluindo a amelogenina) estão disponíveis no
mercado, um exemplo é o PowerPlex.
Tabela 5 – Painel de microssatélites marcadores utilizados na impressão digital de DNA
Marcador Cromossomo Codis (EUA) SGM + (Europa) PowerPlexTM

D2S1338 2 + +
TPOX 2 + +
D3S1358 3 + + +
FGA 4 + + +
CSF1PO 5 + +
D5S818 5 + +
D7S820 7 + +
D8S1179 8 + + +
THO1 11 + + +
VWA 12 + + +
D13S317 13 + +
Penta E 15 +
D16S539 16 + + +
D18S51 18 + + +
D19S433 19 + +
D21S11 21 + + +*
Amelogenina X, Y + + +
+ Microssatélites utilizados em cada painel. * também utiliza o Penta D.
Adaptada de: Strachan e Read (2011).
202
Observação
A amelogenina é um gene que codifica uma proteína importante para

formação da coroa dentária. Esse gene está presente no cromossomo X
e no Y, no entanto a sequência de bases não é exatamente a mesma nos
dois cromossomos. O painel PowerPlex16 possui primers que amplificam
uma determinada região do gene que tem 6 pb de deleção no cromossomo X
e não apresenta deleção no Y. Dessa forma, se o indivíduo for do sexo
masculino ele apresenta a amplificação de duas bandas, uma referente a
106 pb do cromossomo X e outra de 112 pb do Y. Se o indivíduo for do sexo
feminino, no gel aparecerá somente a banda de 112 pb, facilitando assim a
diferenciação do sexo.
7.3.2 A coleta e processamento das amostras
A coleta do DNA de uma cena de crime é muito importante e esse material pode ser proveniente de
diversos tipos de amostras tais como: sangue, sêmen, secreção, tecidos moles, pelos e anexos dérmicos,
urina, saliva etc. No caso da identificação de pessoas mortas podem ser utilizados DNA obtido de ossos
ou dentes. Um dos entraves da coleta é a obtenção do material em quantidade e qualidade necessárias
para a análise. Normalmente 20 células ou 1-20 ng de DNA é suficiente para a seguir com a análise.
No caso de investigação de paternidade, o DNA normalmente é extraído em condições ideais, por isso
os riscos de contaminação e degradação são muito baixos. Em contrapartida, as amostras obtidas em
cena de crime nem sempre estão em boas condições, problemas como pouca quantidade de material
genético, degradação e contaminação são frequentes. A tabela seguinte mostra a quantidade de DNA
proveniente de cada amostra de material biológico.
Tabela 6 – Quantidade de DNA nas amostras biológicas
Amostra Quantidade de DNA

Sangue: 20.000-40.000 ng/mL
Mancha de 1 cm de área
2
Cerca de 200 ng
Mancha de 1 mm de área
2
Cerca de 2 ng
Saliva 1000-10.000 ng/mL
Sêmen: 150.000-300.000 ng/mL
Esfregaço vaginal pós-coital 0-3000 ng
Cabelo:
Arrancado 1-750 ng/fio
Desprendido 1-12 ng/fio
Fonte: Federal Judicial Center (2000, p. 44).
203
Unidade III
Observação
O DNA forense tem diversas aplicações, tais como: identificação de

suspeitos em casos de crimes sexuais, por exemplo, estupro, atentado
violento ao pudor, ato libidinoso diverso da conjugação carnal;
identificação de cadáveres em decomposição, carbonizados, mutilados,
entre outras condições; identificação de cadáveres abandonados;
investigação de paternidade; aborto provocado; infanticídio; anulação de
registro civil de nascimento.
A contaminação é um fator muito importante e que deve ser levado em consideração no momento
da coleta. Para evitar a contaminação por contato físico, o coletor deve utilizar máscaras e luvas e as
amostras devem ser manipuladas com pinças. É importante ressaltar que os manipuladores devem trocar
as luvas sempre que observarem que elas tenham sido contaminadas. Um outro tipo de contaminação
se dá pela presença de produtos como corantes, tintas, óleos, terra, entre outros. Esses contaminantes
muitas vezes são inevitáveis, pois muitas vezes estão presentes nos locais onde estão as amostras
biológicas. A contaminação biológica normalmente resulta da mistura de DNA exógeno com o DNA
presente de fato na evidência. Esse tipo de contaminação pode ser evitado por meio da limpeza, com
álcool, dos instrumentos da coleta como tesoura, bisturi, pinça entre outros. Além disso, devem ser
evitados tosse, espirro ou fala sobre o material da amostra.
Saiba mais
Você sabia que o a habilitação em genética permite ao biomédico

realizar testes moleculares para identificação de paternidade e perfil
molecular na perícia criminal. Para um maior conhecimento das
habilitações permitidas, leia:
CONSELHO REGIONAL DE BIOMEDICINA. Manual do biomédico. 2017.

Disponível em: https://crbm1.gov.br/site/wp-content/uploads/2016/04/
Manual-do-Biomedico-Edicao-digital-2017.pdf. Acesso em: 28 abr. 2020.
É muito importante fotografar cada vestígio antes de realizar a coleta. Além disso, é muito
importante que a amostra seja conservada da maneira correta até a chegada ao laboratório.
Os tecidos moles e órgãos devem ser congelados, o sangue líquido em grande quantidade deve ser
coletado em tubo estéril com anticoagulante EDTA e deve ser transportado à 4 °C. Caso o sangue esteja
em pequena quantidade, deve ser coletado com um swab estéril. Se houver mancha de sangue seco em
objetos pequenos, eles devem ser transportados ao laboratório. Os vestígios úmidos devem ser secos
à temperatura ambiente.
204
7.3.3 Procedimentos para a análise do DNA
Após a coleta da amostra, alguns procedimentos básicos são seguidos independentemente do tipo
de amostra a ser analisada. Esses procedimentos são:
• Extração do DNA da amostra: primeiramente é realizada a lise das células e solubilização

do DNA. Posteriormente, as proteínas e outras macromoléculas são removidas por clivagem
enzimática ou química. Na última etapa, o DNA é precipitado. Os reagentes utilizados em cada
procedimento dependem do tipo de amostra. O laboratório de criminalística de São Paulo
usa extração de DNA pelo iodeto de sódio para sangue bem conservado; fenol-clorofórmio
para ossos e dentes ou para manchas de sangue em péssimo estado de conservação; método
orgânico para manchas, lâminas e swabs contendo esperma. Nos casos de ossos em péssimo
estado de conservação, utiliza-se o DNA-IQ (partículas paramagnéticas que isolam o DNA de
inibidores da PCR).
• Quantificação do DNA: são empregadas as metodologias de espectrofotometria de absorção

no ultravioleta e se houver contaminação por proteínas, fenol, EDTA e outros DNAs, deve-se ser
utilizado o método de fluorescência.
• Amplificação o DNA pela técnica de PCR: a PCR é o método de escolha dos laboratórios
para amplificação do DNA, as etapas dessa reação foram previamente descritas. Os loci de
STRs possuem alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 300 pb e são os polimorfismos preferidos
na análise pericial. Os loci podem ser analisados individualmente ou em grupos por meio de
sistemas denominados multiplex que permitem o estudo simultâneo de diversos loci. Diversos
painéis de STR estão disponíveis, os mais utilizados são o CODIS, o SGM+ e o PowerPlex.
Normalmente, dois painéis multiplex são usados em cada país, caso do Brasil. Também foram
desenvolvidos painéis para o cromossomo Y que são muito utilizados no caso de crimes sexuais.
Os principais loci analisados são: DYS393, AMELY-sex-test, DYS19, DYS390, DYS391, DYS389I.II,
YCAII, DYS385, DYS392.
• Realizar a análise comparativa dos perfis genéticos obtidos: após a reação de PCR, os
fragmentos amplificados são analisados em gel de poliacrilamida, nesse gel, são adicionados
marcadores de posição dos alelos, amostra de DNA conhecida (controle positivo). É realizada a
eletroforese das amostras e os fragmentos menores percorrem a maior distância no gel. Após a
corrida, a identificação dos fragmentos pode ser realizada através da coloração do gel em prata
ou pelo método da fluorescência. Isso depende dos reagentes que foram utilizados durante a
amplificação. O uso da florescência permite a identificação dos fragmentos por analisadores
automáticos à laser. Quando o gel é revelado pela prata, são observadas bandas referentes aos
alelos identificados. Em contrapartida, na fluorescência analisada por métodos automatizados,
os alelos são representados por bandas ou picos de fluorescência.
• Análise dos dados: a análise do padrão das bandas pode levar à conclusão de que duas amostras
de DNA apresentam perfis diferentes, dessa forma são de pessoas diferentes. Mas se os padrões
das bandas combinarem, duas possibilidades podem acontecer, ou as amostras são provenientes
205
Unidade III
de gêmeos idênticos ou são de pessoas diferentes com o mesmo padrão de DNA nos loci. A
grande pergunta é: qual a chance de isso ocorrer? Para responder a essa pergunta, é necessária
a realização de uma série de análises e cálculos matemáticos que fogem deste conteúdo. Mas é
sempre bom reiterar que o DNA por si só não é uma prova cabal, ele deve vir associado a outras
evidências coletadas durante a investigação.
• Laudo: é o documento apresentado por escrito onde se dispõe a atividade desenvolvida pelo
perito. Nesse documento, o perito apresentará o resultado dos exames, pesquisas, investigações
e diligências. É muito importante que os laboratórios responsáveis pela análise forense do DNA
estabeleçam procedimentos que certifiquem a validade dos dados apresentados.
Observação
Em casos de crimes sexuais, muitas vezes os espermatozoides podem

estar contaminados com células epiteliais da vítima. Dessa forma deve ser
realizada a separação do material masculino e feminino através de um
procedimento chamado lise diferencial. Nessa técnica, são empregados
dois detergentes fracos para liberar o DNA das células epiteliais e dois
detergentes fortes para liberar o DNA dos espermatozoides. Uma vez que
as frações estejam isoladas, prossegue-se com a extração do DNA.
7.3.4 Identificação de restos humanos
Caso o cadáver não apresente grau de putrefação generalizada, podem ser retiradas amostras de
sangue das cavidades cardíacas, mechas de cabelos, músculo. No entanto, se há putrefação generalizada,
devem ser retiradas amostras ósseas e dentárias.
A identificação de restos mortais é muito importante nos casos de acidentes em massa, restos
mortais de pessoas que passaram por situações de combates, como guerras. Nesses casos é muito
importante coletar o DNA dos parentes das vítimas para auxiliar na identificação, quando esta
não pode ser determinada de maneira convencional (aparência física, digitais dermatológicas,
arcada dentária).
A ordem de preferência é coletar amostras de ossos longos como fêmur e tíbia, mas caso não seja
possível, outros ossos podem ser coletados. Os dentes são um importante material em casos forenses,
pois eles são mais resistentes à degradação pós-morte ou por efeito do clima. Os dentes armazenam
muito DNA e são facilmente transportados. Muitas vezes quando os outros ossos não estão disponíveis,
eles podem ser utilizados para identificação das vítimas (TRENT, 2005).
206
Saiba mais
Um artigo científico brasileiro mostrou a análise de STRs em ossos

expostos ao clima tropical brasileiro. Para saber mais sobre esse artigo leia:
SOLER, M. P. et al. STR analysis in bones exposed to Brazilian tropical

climate. Forensic Science International, v. 3, n. 1, p. e550-e551, 2011.
7.3.5 Investigação de paternidade
O teste de impressão de DNA digital desenvolvido por Jeffreys, em 1984, ficou disponível para teste
de paternidade em 1988. Antes disso, a tipagem sanguínea era utilizada como forma de identificar
a paternidade, no entanto, os grupos sanguíneos ABO possuíam múltiplos alelos e antígenos e essa
metodologia era eficiente na identificação de somente 40% dos casos.
Atualmente, o método de escolha é baseado na amplificação dos microssatélites, assim como

para identificação de vítimas. No caso da paternidade, dois cenários podem ser observados: 1) caso
clássico de mãe, criança e pai e 2) casos mais complexos sem mãe, por exemplo, criança e possível
pai. No teste de paternidade, os STRs apresentam alta sensibilidade (poucos falsos negativos), mas
baixa especificidade (falso positivos podem ocorrer, pois pessoas não relacionadas podem apresentar
os mesmos alelos). No caso clássico, as chances de isso ocorrer é reduzida com o uso de um maior
número de STRs ou outros polimorfismos. Porém, nos casos mais complexos, não é possível saber quais
alelos da criança vieram da mãe. Portanto, são necessários o uso de alguns programas estatísticos. A
figura a seguir mostra um exemplo do caso clássico de teste de paternidade. É possível observar que
a criança compartilha três alelos da mãe e quatro com o pai 1. Os pais 2 e 3 foram excluídos, pois
compartilham somente dois alelos com a criança. Esse exemplo também mostra a necessidade de
investigação de diversos STRs.
Pais
M C 1 2 3
Figura 114 – Exemplo de caso clássico de teste de paternidade. M significa mãe, e C, criança
207
Unidade III
Observação
O DNA forense pode ser empregado nas autópsias para auxiliar a

identificar a causa da morte. Um exemplo é o caso de uma mulher de
44 anos, com distúrbios psiquiátricos, encontrada morta na banheira.
Embora a causa da morte na autópsia fosse afogamento, não estava muito
claro se tratava-se ou não de suicídio. O teste de DNA procurou mutações
associadas a ataque cardíaco, e as análises mostraram que ela tinha uma
mutação que causava a síndrome do prolongamento do QT (ondas que
aparecem no eletrocardiograma). Por isso, o afogamento ocorreu devido a
uma arritmia, portanto o caso não era de suicídio (TRENT, 2005).
7.4 Avaliação da combinação de tecidos para transplantes
O primeiro transplante de órgãos bem-sucedido foi realizado em 1953 e, desde então, o número de
transplante cresceu exponencialmente. De acordo com a Associação Brasileira de Transplantes de órgãos,
no ano de 2019 (janeiro-setembro) foram realizados 6.722 transplantes de órgãos, 10.995 transplantes
de tecidos e 2.575 transplantes de medula óssea. O transplante renal lidera a lista, seguido pelo fígado,
coração, pulmão e pâncreas. Esses dados mostram a importância do transplante de órgãos e tecidos no
Brasil e a necessidade da realização de testes de compatibilidade para viabilizar a doação. Abordaremos
os principais fatores analisados para realização do transplante, bem como os testes moleculares.
7.4.1 Conceitos gerais
O transplante consiste na transferência de células, tecidos ou órgãos, chamados enxertos, de um

indivíduo para outro, geralmente, diferente. Ele é muito utilizado com o intuito de substituir órgãos e
tecidos não funcionais por órgãos ou tecidos saudáveis. É chamado doador o indivíduo que fornece o
enxerto e receptor ou hospedeiro o indivíduo que o recebe.
Quando um enxerto é transplantado de um indivíduo para o mesmo indivíduo é chamado enxerto

autólogo. Quando o receptor e o doador são geneticamente idênticos é chamado enxerto singênico.
Se os dois indivíduos forem geneticamente diferentes, mas da mesma espécie, é chamado enxerto
alogênico (ou aloenxerto). Quando o enxerto é transplantado entre indivíduos de espécies diferentes, é
denominado enxerto xenogênico (ou xenoenxerto).
O transplante de enxertos de um indivíduo para outro geneticamente não idêntico leva inevitavelmente
à rejeição do transplante devido a uma resposta imune adaptativa. As moléculas reconhecidas como
estranhas nos transplantes são denominadas aloantígenos e aquelas presentes nos xenoenxertos
são denominadas xenoantígenos. Os linfócitos e anticorpos que reagem com os aloantígenos ou
xenoantígenos são chamados de alorreativos ou xenorreativos, respectivamente (ABBAS; LICHTMAN;
PILLAI, 2015).
208
A resposta aloimune entre os indivíduos geneticamente diferentes ocorre via complexo principal
de histocompatibilidade (MHC, do inglês major histocompatibility complex), também conhecido como
antígenos leucocitário humano (HLA, do inglês human leukocyte antigen), essa resposta é a principal
barreira nos transplantes de órgãos sólidos, tecidos e medula óssea.
O MHC é subdividido em MHC de classe I (MHC-I) e classe II (MHC-II), ambos são capazes de
apresentar diversos peptídeos. Isso é devido aos variados genes HLA que codificam os MHCs. A expressão
codominante dos genes HLA regulam a resposta imunológica adquirida conhecida como HLA-classe I
e HLA-classe II. Os genes HLA localizam-se no cromossomo 6p21.3 e são codificados por 12 loci MHC-I
(HLA-A, -B e -C) e 9 de MHC-II (HLA-DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1, -DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5).
HLA-A
21.32p
21.31p
21.2p
HLA-C Centrômero
HLA-B
q
HLA-DR
HLA-DQ
HLA-DP
Figura 115 – Exemplo da distribuição dos genes HLA no cromossomo 6
Os genes HLA têm a expressão ativada por citocinas como IFN-γ e IL-4 e interagem com receptores
de células TCD8 e TCD4.
As células T do receptor podem responder ao aloantígeno do doador por três diferentes vias:
• Reconhecimento direto do aloantígeno através da interação do receptor de células T (TRC, do

inglês T cell receptor) com o MHC-peptídeo apresentado pelas células apresentadoras de antígeno
(APC, do inglês antigen-presenting cell) do doador (predominante).
• Reconhecimento indireto do aloantígeno quando os peptídeos derivados do MHC do doador são

fragmentados e apresentados pelas APCs do próprio receptor para as células T.
209
Unidade III
• Reconhecimento semidireto do aloantígeno é a captura do complexo MHC-peptídeo do doador

pelas APCs do hospedeiro.
O HLA é a região mais polimórfica do genoma humano e não está somente relacionada aos
transplantes, mas também está envolvida na susceptibilidade em mais de cem doenças de natureza
inflamatória, infecciosa e autoimune. Os indivíduos apresentam de duas a quatro cópias do gene DRB.
Normalmente, dois loci DRB1 estão presentes, um em cada cópia do cromossomo 6, loci adicionais de
DRB3, DRB4 ou DRB5 podem ser encontrados. O loci DRA tem 7 alelos, já o loci HLA-B tem mais de
2.200 alelos. Os alelos de um determinado loci normalmente diferem por substituições sinônimas ou
não sinônimas.
7.4.2 Nomenclatura HLA
Em geral, dois sistemas de nomenclatura se aplicam ao HLA. O primeiro é baseado no reconhecimento

sorológico. A classificação por esse sistema é constituída por letras e números (ex. HLA-B51 ou B51).
O segundo sistema, de nomenclatura mais moderna, inicia-se com HLA- e o nome do locus, seguido
por * e os números dos dígitos que especificam os alelos. Os dois primeiros dígitos determinam
um grupo de alelos. O terceiro, de quatro dígitos, especifica um alelo sinônimo. Os dígitos 5 até 6
representam mutações sinônimas. Os sétimos e oitavos dígitos distinguem mutações fora da região
codificante. As letras L, N, Q ou S especificam um nível de expressão ou outros dados não genômicos.
A figura seguinte mostra um exemplo da nomenclatura HLA.
Hífen separa o nome
do gene do prefixo Alterações de expressão
Separador Separadores
HLA-A*02:101:01:02N
Prefixo HLA Gene Diferenças em regiões
não codificantes
Grupo de alelos
Proteína HLA
específica
Substituição
sinônima
Figura 116 – Exemplo de nomenclatura HLA. N significa nulo
Cada letra do sufixo apresenta uma variação de expressão:
• Sufixo N: alelos não expressos.
• Sufixo L: alelos que apresentam menor expressão, comparados aos níveis normais.
• Sufixo S: denota um alelo específico que codifica para uma proteína solúvel.
210
• Sufixo C: alelos que codificam proteínas presentes no citoplasma das células.
• Sufixo A: expressão aberrante, há dúvidas de como a proteína é expressa.
• Sufixo Q: expressão do alelo é questionável, a mutação observada no alelo afeta a expressão de

outros alelos.
Saiba mais
Para conhecer mais a respeito da nomenclatura dos HLA, acesse:
http://hla.alleles.org/
7.4.3 Tipagem de HLA e influência na doação de órgãos
A tipagem do HLA é muito utilizada para verificar se o doador e o receptor são compatíveis. Quando
um transplante é realizado, as moléculas de HLA do doador são reconhecidas pelo sistema imunológico
do receptor, desencadeando uma resposta imunológica. A correspondência entre os antígenos MHC do
doador como os do receptor mostram um efeito positivo na sobrevida do enxerto. No transplante de
órgãos, a resposta imune adaptativa é a principal resposta ao órgão transplantado. Um dos principais
fatores que levam à perda do enxerto são provenientes do HLA-DR e antígenos -DR. Os efeitos da
incompatibilidade HLA-DR são mais importantes nos primeiros seis meses depois do transplante, o
efeito do HLA-B aparece nos dois primeiros anos e o HLA-A tem efeitos deletérios na sobrevivência do
enxerto a longo prazo.
Diversos testes de biologia molecular voltados à identificação do HLA se aplicam para evitar a rejeição
do enxerto e esses testes serão abordados mais adiante.
7.4.4 Tipagem de HLA por sorologia
A tipagem de HLA por sorologia foi descrita em 1964 por Terasaki e McClelland e é baseada no ensaio de
linfotoxicidade complemento dependente (CDC, do inglês complement-dependent lymphocytotoxicity).
O ensaio utiliza apenas 1 mL de reagente de tipagem para test e 1 mL de células alvo na concentração de
2-4X106/mL. As células e o soro são misturados. Após 30 minutos, o soro de coelho é adicionado como
uma fonte de complemento (4-5 mL) e o ensaio é incubado por 30 minutos. Se um poço contém um
anticorpo específico para as moléculas de HLA expressas na superfície da célula, a ligação irá ativar o
complemento e o resultado será a morte celular. As reações são fixadas, coradas e lidas em equipamento
específico.
As células mais utilizadas no CDC são os linfócitos de sangue periférico, que são isolados do sangue
total através de gradiente de centrifugação. Os linfócitos também podem ser obtidos do baço e dos
linfonodos de doadores cadáveres.
211
Unidade III
Embora a técnica de CDC tenha sido muito utilizada no passado, o advento das técnicas de biologia
molecular permitiu uma maior especificidade na detecção dos polimorfismos da região HLA. Dessa
forma o CDC gradualmente passou a ser substituído por ensaios mais sensíveis em fase sólida como Elisa
(do inglês enzyme-linked immunosorbent assay) e outras tecnologias como citometria de fluxo, fluxo
de painel imunológico (PRA, do inglês panel-reactive antibodies). Esses ensaios usam micropartículas
cobertas com moléculas de HLA purificadas, permitindo maior especificidade na detecção de anticorpos
anti-HLA. O monitoramento de anticorpos anti-HLA pré e pós-transplante é realizado através desses
ensaios em fase sólida.
7.4.5 Tipagem de HLA por primers sequência-específica
A tipagem de HLA por primers sequência-específica (PCR-SSP) é uma técnica de muito utilizada, na
qual múltiplos pares de primers alelo-específico são usados para identificar os alelos presentes em uma
determinada amostra de DNA. A figura seguinte mostra um exemplo de uma reação de PCR-SSP, mostrando
o padrão de HLA de um paciente e dois possíveis doadores. No caso do exemplo, o doador 1 que possui
padra de bandas HLA idênticos ao receptor poderia doar o órgão, já o doador 2, não seria compatível.
Receptor 1 Doador 1 Doador 2
HLA HLAB HLAC HLADR HLA HLAB HLAC HLADR HLA HLAB HLAC HLADR
Figura 117 – Exemplo de tipagem de HLA por PCR-SSP. O tamanho e a disposição das bandas do HLA, HLB,
HLC, HLADR são fictícias. Os quadradinhos em azul representam bandas do produto da PCR
Nos laboratórios a PCR-SSP é realizada para diversos subtipos de HLA, existem painéis comerciais
prontos com primers para os HLAs e para genes endógenos. Após a PCR-SSP o produto é separado por
eletroforese em gel de agarose. Existem métodos de alta resolução no qual os primers são capazes de
identificar um único alelo. Em cada tipo de transplante é utilizado um painel diferente, por exemplo no
transplante renal são analisados os HLA A, B e DR, já no caso do transplante de medula óssea, todos os
subtipos de HLA são avaliados.
Para realização da técnica de PCR-SSP, alguns parâmetros devem ser seguidos.
• Molde de DNA: o DNA normalmente é obtido de amostras de sangue coletadas com os

anticoagulantes EDTA ou citrato.
212
• Tamanho do fragmento amplificado: o produto da PCR deve estar em 150-700 pb e o controle

deve possuir mais de 200 pb que a amplificação do maior alelo. Assim, é possível identificar a
diferença na corrida de eletroforese.
• Teste dos primers: a especificidade dos primers deve ser testada com amostras selecionadas
para os testes. Por exemplo: se o primer direto reconhece os alelos HLA-A*01 e A*03 e o primer
reverso, HLA-A* e A*11, a combinação específica deveria somente amplificar HLA*03. Os testes com
amostras positivas para HLA-A*01 ou A*11 irá testar a probabilidade desses primers em amplificar
falsos positivos.
Observação
A heparina não deve ser utilizada como anticoagulante para coleta

de amostra de sangue em que se deseje extrair DNA, pois exerce
efeito inibitório sobre a reação da DNA polimerase, podendo se ligar
diretamente à enzima ou ao DNA via interação com cátions divalentes.
Caso não exista uma alternativa, a amostra deve ser tratada com
heparinase II antes da PCR.
A maior vantagem da PCR-SSP é a rapidez para obtenção dos resultados, aproximadamente 3,5 h.
Essa é ainda a metodologia de escolha para a análise de compatibilidade de HLA em órgãos doados por
cadáveres. Uma desvantagem é que continua sendo um método comparativo, que necessita de grandes
quantidades de DNA polimerase e primers. Quando deve ser realizada a análise de muitas amostras, o
tempo para obtenção dos dados é ainda maior.
7.4.6 Tipagem de HLA por sonda de oligonucleotídeo sequência específica
A tipagem de HLA por sonda de oligonucleotídeo sequência específica (SSOP, do inglês

sequence-specific oligonucleotide probing) é também uma técnica baseada em PCR, não específica de
alelos, mas sim de éxons dos genes HLA contendo regiões hipervariáveis que conferem especificidade
aos alelos. Múltiplos Southern blots do produto amplificado por PCR são preparados em membranas de
náilon, que são então, hibridizadas contra sondas SSO específicas à mudança de base, que se ligam em
regiões complementares. As ligações não específicas são removidas após a hibridização por processos
de lavagem. As sondas ligadas são detectadas, normalmente por reações de quimiluminescência e o
tipo de HLA de um indivíduo e interpretado por comparação com os padrões negativos e positivos da
reação. A vantagem dessa técnica é poder analisar várias amostras simultaneamente. A SSOP passou
por diversas alterações para tornar a técnica mais segura, antigamente as sondas eram marcadas com
fósforo radioativo, atualmente são utilizadas sondas marcadas com biotina.
213
Unidade III
1. Amplificação dos
éxons 2 e 3 por PCR
(primers biotinilador)
Produto da PCR +
solução denaturante
Membrana de
nitrocelulose com
2. Denaturação do produto da PCR, sonda ligada
seguida por hibridização
3. Lavagens
4. Detecção dos fragmentos ligados

pela sonda
Figura 118 – Exemplo de tipagem por SSO
7.4.7 Tipagem de HLA por sequenciamento
O sequenciamento de DNA pela técnica de Sanger (descrita anteriormente), assim como o PCR-SSP,
é muito utilizado na identificação da variação alélica dos genes HLA. Normalmente, são analisadas as
regiões mais polimórficas como HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ e -DP.
Para realização do sequenciamento, é necessária, inicialmente, a amplificação por PCR dos 2 e 3

para os genes de classe I e éxon 2 para os genes de classe II. Esses éxons são escolhidos pois a maioria
dos HLAs de classe I podem ser determinados pelos éxons 2 e 3 e para a classe II o éxon 2 é suficiente.
Posteriormente, os produtos da PCR são sequenciados pela técnica de Sanger. A amplificação por PCR
pode ser realizada de duas maneiras:
• Classe I (A, B e C): é realizada uma reação de PCR, utilizando primers específicos para o locus.
Posteriormente, é realizado o sequenciamento, as sequências obtidas são comparadas às de
um banco de dados de HLA, em casos de ambiguidade (normalmente 40%), é realizado um
sequenciamento adicional. Em caso de se manter a ambiguidade, também pode ser realizada a
clonagem do produto da PCR em plasmídeos para posterior sequenciamento.
• Classe II (DRB1, DQB1): ambos alelos do locus são amplificados juntos por PCR e sequenciados
concomitantemente, posteriormente as sequências obtidas são comparadas às de um banco
de dados de HLA. Em casos de ambiguidades (normalmente 10%), os alelos são separados para
outra rodada de sequenciamento em grupo ou utilizando primers específicos. Também pode ser
realizada a clonagem do produto da PCR em plasmídeos para posterior sequenciamento.
214
O sequenciamento de DNA é utilizado em casos de doadores não aparentados e transplante de

células-tronco hematopoiéticas derivadas do cordão umbilical. A seleção de um doador que possua as
mesmas combinações de HLA-A, -B, -C e -DRB1 aumenta a chance de sobrevivência do enxerto. Quando
o doador carrega uma combinação de um alelo diferente em um desses quatro locus, o doador ainda
pode ser considerado para o transplante. A técnica de sequenciamento é menos utilizada em transplante
de órgãos sólidos. Um ponto positivo do sequenciamento em relação às outras metodologias é que ele
permite avaliar todos os nucleotídeos localizados em regiões polimórficas ou conservadas e permite a
identificação de novos alelos.
Kits de sequenciamento de HLA estão disponíveis comercialmente e são vendidos por diversas
empresas. A grande vantagem de usar os kits das empresas são os controles de qualidade e a
estratégia. No entanto, os kits comerciais não compartilham a sequência dos primers e demais
oligonucleotídeos. Também não fornecem reagente extra para casos de ambiguidade ou para
isolamento de um novo alelo.
7.4.8 Sequenciamento de última geração para tipagem de HLA
O sequenciamento de última geração (NGS) de HLA classe I ou II é um método que tornou

possível contornar as ambiguidades alélicas e a incompleta cobertura genômica dos métodos
anteriores. No entanto, o custo da técnica ainda é muito alto, de forma que nem todos os
laboratórios conseguem utilizar essa tecnologia. Para realização do sequenciamento NGS, é
necessário seguir os seguintes passos:
• Amplificação da região alvo por PCR, quantificação e purificação dos fragmentos amplificados.
• Preparação da biblioteca que consiste na ligação dos fragmentos amplificados em adaptadores

chamados de index, purificação dos fragmentos utilizando beads e seleção pelo tamanho.
• Sequenciamento usando a plataforma NGS.
• Análise dos dados através do software.
O primeiro passo é a preparação do molde de DNA. No caso do HLA, é o isolamento do DNA

específico do HLA do resto do genoma e a preparação da biblioteca. A região alvo pode ser o MHC
inteiro, os genes inteiros ou somente certos éxons. A técnica de PCR é a mais utilizada para isolar as
sequências HLA, usando primers específicos, é possível amplificar a sequência escolhida. Um entrave
dessa técnica é desenhar os primers de forma que eles consigam amplificar a maioria dos alelos do
HLA. O próximo passo é a preparação da biblioteca que pode ser de duas categorias: bibliotecas de
fragmentos ou final-pareadas. As bibliotecas final-pareadas são baseadas nas sequências presentes
nas terminações da sequência de DNA, portanto o sequenciamento é realizado de um terminal ao
outro e vice versa, esse método é utilizado pelos sequenciadores Illumina. As bibliotecas são marcadas
comum “código de barras” para que sejam sequenciadas várias amostras simultaneamente em uma
mesma corrida de sequenciamento.
215
Unidade III
Após o sequenciamento por NGS, é necessária uma cuidadosa análise de bioinformática. No caso
das sequências HLA, o anelamento da sequência obtida deve ser comparado a um banco de dados de
HLA o IMGT/HLA.
Diversas tecnologias de NGS estão disponíveis para determinar as variações HLA e consequentemente
auxiliar na tipagem de transplantes. A figura seguinte exemplifica as principais diferenças entre a
tipagem de HLA por sequenciamento de Sanger e NGS.
Tipagem de HLA Sanger Tipagem HLA NGS
Amostra
Amostra Extração DNA
Extração DNA PCR de múltiplos Preparação da biblioteca

genes HLA
PCR de um único Captura de sequência HLA

gene HLA Preparação da biblioteca de múltiplos genes HLA
PCR alelo específico Preparação do molde

ou sequenciamento Sequenciamento de sequenciamento
com primers alelo não clonal
específico 2-3X Sequenciamento clonal
Ambiguidade Análise
Análise
Genotipagem de um gene HLA Genotipagem de todos os genes HLA
Figura 119 - Esquema mostrando as principais diferenças da tipagem de HLA pela técnica de sequenciamento de Sanger e NGS
7.4.9 HLAs avaliados nos transplantes
A tipagem HLA é muito importante no caso dos transplantes de órgãos e de medula óssea.
A compatibilidade do sistema ABO também é avaliada, no entanto, diversos transplantes já foram realizados,
com sucesso, em pacientes ABO incompatíveis. Na tipagem HLA, é avaliada a presença de anticorpos
circulantes contra o HLA, por meio de um painel imunológico (PRA, do inglês panel-reactive antibodies).
Para essa finalidade, o soro do receptor é testado contra um painel de antígenos HLA que representam
a população à qual o paciente pertence. No caso, do transplante de coração, é utilizada a plataforma
Luminex. Os resultados do PRA mostram o percentual de reatividade e com isso é possível determinar o
PRA calculado (PRAc) que define o grau de sensibilização do paciente. Quanto mais anticorpos estiverem
presentes, maior será o PRA. Quanto mais elevado o PRA, mais difícil se torna encontrar um doador
compatível. É importante observar não somente a porcentagem do PRA, mas também a especificidade
do anticorpo, caso o receptor tenha anticorpos específicos contra o doador (DSA, do inglês donor specific
antibodies), ele deve ser evitado.
Em geral, a tipagem HLA tem maior influência clínica nos transplantes de rins e medula óssea.
No transplante de coração, o HLA é importante, mas outros fatores como tempo de isquemia,
disponibilidade de doador, necessidade clínica do receptor, tornam a avaliação HLA menos importante.
Transplantes de córnea também não são influenciados por HLA, a não ser que a córnea seja transplantada
em um tecido vascularizado ou inflamado.
216
7.5 Noções de terapia gênica
A terapia gênica pode ser definida como o uso do material genético (DNA ou RNA) na forma de fármacos
para tratamento de doenças. Para a realização de um procedimento de terapia gênica, é necessário definir
os seguintes componentes: gene terapêutico, vetor e forma de administração do vetor.
O gene terapêutico normalmente consiste em um cDNA (DNA complementar) com a sequência de

ORF (fase de leitura aberta) completa. No entanto, com a descoberta da regulação de expressão gênica
por microRNAs e siRNA, eles também estão sendo usados no campo de terapia gênica.
Com o propósito de administrar no paciente o gene terapêutico são utilizados vetores. Eles
funcionam como carreadores do gene e podem se apresentar na forma de vírus ou plasmídeos. Entre
os vetores virais, os mais utilizados são os adenovírus, retrovírus e lentivírus. Os plasmídeos podem ser
aplicados diretamente no paciente ou complexados com lipossomo ou policátions, formando lipoplexo
ou poliplexo, respectivamente, para aumentar a eficiência de transfecção.
Observação
A palavra transfecção é utilizada para representar a inserção de um

plasmídeo dentro da célula, já a palavra transdução é referente a entrada
de um vetor viral na célula.
Quando um vetor carreando um gene terapêutico é administrado diretamente no paciente, o

procedimento é chamado terapia gênica in vivo. No entanto, quando uma população de células
específicas é retirada do paciente, modificadas in vitro com o vetor e reintroduzidas no paciente, esse
procedimento é denominado terapia gênica ex vivo.
A
C
Figura 120 – Exemplos de procedimentos de terapia gênica. Terapia gênica in vivo (A).
Terapia gênica ex vivo com plasmídeo (B). Terapia gênica ex vivo com vetor viral (C)
217
Unidade III
Abordaremos agora um pouco da história da terapia gênica, os principais vetores utilizados nos
protocolos clínicos e as doenças tratadas.
7.5.1 Histórico
O histórico foi dividido de acordo com os acontecimentos mais relevantes na área de terapia gênica
até o presente momento.
• 1990: foi realizado o primeiro estudo clínico de terapia gênica, realizado pelos cientistas Michael
Blaese e French Anderson. O estudo visou ao tratamento de uma doença genética rara denominada
imunodeficiência severa combinada (SCID, do inglês severe combined immunodeficiency) causada por
mutações no gene que codifica a enzima adenosina deaminase (ADA). As crianças, sem tratamento,
dificilmente sobrevivem além dos dois anos de idade, pois têm o sistema imune comprometido
e facilmente são acometidas por doenças oportunistas. As opções terapêuticas são: transplante de
medula óssea e terapia de reposição enzimática através do uso da enzima PEG-ADA, no entanto,
essas terapias são falhas e não são capazes de restaurar o sistema imunológico dos pacientes por
um longo período. Para o procedimento de terapia gênica, dois pacientes tiveram seus linfócitos T
extraídos e transduzidos com retrovírus expressando a ADA. Ambos pacientes foram acompanhados
durante quatro anos e apresentaram um aumento de linfócitos T e ganho de peso, o primeiro paciente
também apresentou aumento da enzima ADA que foi semelhante à de um heterozigoto. Já o segundo,
não apresentou aumento significativo do nível enzimático. É importante ressaltar que os pacientes
continuaram recebendo a terapia de reposição enzimática durante todo o protocolo de terapia gênica.
• 1992: Claudio Bordignon e Fluvio Mavillo e colaboradores do H. San Raffaele Telethon Institute
for Gene Therapy (HSR-Tiget) desenvolveram o primeiro estudo clínico envolvendo terapia gênica
e células-tronco. O protocolo foi realizado em crianças com SCID e envolveu a coadministração de
células-tronco hematopoiéticas e linfócitos autólogos transduzidos com retrovírus expressando o
gene ADA 7. Os pacientes apresentaram restabelecimento das células do sistema imune, aumento
da atividade da ADA no plasma e correção do crescimento. Mas ambos continuaram com a
reposição enzimática durante todo o procedimento de terapia gênica. Os resultados promissores
levaram à inclusão de mais crianças no protocolo.
• 1999: ocorreu a morte de um paciente após um procedimento de terapia gênica por toxicidade
associada ao vetor. Jesse Gelsinger, 18 anos, apresentava deficiência da enzima ornitina
transcarbamilase (OTC) que leva a um acúmulo de amônia no organismo. Os pacientes acometidos
por essa doença dificilmente sobrevivem além dos cinco anos de idade, devido a complicações
neurológicas. O protocolo, que se encontrava em fase um, foi realizado no Institute for Human
Gene Therapy (IHGT), Universidade da Pensilvânia, Filadélfia. O paciente recebeu uma injeção
de adenovírus expressando OTC diretamente na artéria hepática e apresentou um quadro
inflamatório, seguido de falência hepática, falecendo quatro dias após a injeção. Investigações
foram realizadas e mostraram uma série de irregularidades e vários eventos adversos que não
foram reportados, como, por exemplo, não informar o paciente dos possíveis efeitos adversos e
também não informar sobre a morte de três macacos devido a uma reação inflamatória grave
após a injeção do vetor.
218
• 2000: Alan Fisher e Marina Cavazzana-Calvo do Necker Hospital for Sick Children reportaram
a cura de duas crianças com SCID ligada ao X (SCID-X1), uma doença genética caracterizada
pela deficiência no amadurecimento de células T e células natural killer. O tratamento envolvia
a extração de células-tronco da medula óssea dos pacientes e sua modificação com retrovírus
expressando o gene que codifica a cadeia gama do receptor da interleucina 2. As duas crianças
apresentaram restabelecimento de células do sistema imunológico e conseguiram abandonar o
ambiente estéril e protegido, podendo voltar para casa. Vinte crianças receberam o tratamento e
foram curadas, no entanto, cinco delas desenvolveram leucemia devido à mutagênese insercional
causada pelo vetor retroviral. As crianças receberam o atendimento e o tratamento para leucemia
e foram curadas, no entanto, uma delas faleceu.
• 2003: a empresa SiBiono GeneTech Co (Shenzhen, China) conseguiu uma aprovação na China
para tratamento de câncer de cabeça e pescoço com Gendicine, um adenovírus que codifica o gene
supressor de tumor p53 (Ad-p53). O Genedicine foi o primeiro fármaco à base de terapia gênica
aprovado para comercialização. O p53 é um gene supressor de tumor, portanto sua expressão leva
a regressão do tumor. O China’s State Food and Drug Administration (SFDA) aprovou a Gendicine
para uso clínico em 2003 e licenciou a sua produção comercial em 2004. A aprovação desse
medicamento ainda é controversa, uma vez que a comercialização do fármaco foi aprovada ainda
na fase III do estudo e os dados de regressão tumoral ainda não são claros.
• 2009: cientistas da Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, e colaboradores reportaram que um

menino de 8 anos com amaurose congênita de Leber (ACL) conseguiu uma visão normal após
o tratamento com vírus adeno-associado (AAV) carreando um gene que codifica a proteína
retinal pigment epithelium-specific (RPE65). A ACL causa perda da visão após o nascimento ou
na infância e leva a cegueira total na vida adulta. Todos os 12 pacientes do estudo de 8-44 anos
tiveram alguma melhora na visão, embora o paciente mais jovem tenha obtido o maior benefício.
• 2010: a Amsterdam Molecular Therapeutics consegue autorização na Europa para a Glybera

(alipogene tiparvovec) para tratamento de uma doença genética causada pela deficiência da
lipoproteína lipase (LPL). A doença é caracterizada pelos altos níveis de triglicérides na corrente
sanguínea que podem levar a uma pancreatite fatal. O gene da LPL, expresso por um AAV, foi
administrado via injeção subcutânea na parte superior das coxas. Uma revisão atual mostrou os
resultados de seis anos de ensaio clínico de 19 pacientes tratados com o Glybera. Uma redução de
50% da taxa de internações por pancreatite foi observada. No entanto, em 2017, a empresa decidiu
não renovar a sua licença na Europa, devido à não aprovação do medicamento nos Estados Unidos.
• 2015: aprovação do primeiro fármaco à base de terapia gênica pelo FDA. O IMLYGIC (talimogene
laherparepvec), comercializado pela Amgen Inc., é um Herpes simplex vírus 1 que carrea o gene
GM-CSF (do inglês granulocyte macrophage colony stimulating fator). O medicamento foi
aprovado para tratamento de lesões de melanoma.
• 2017/2018: aprovação de dois fármacos à base de terapia gênica pelo FDA. O Yescarta (axicabtagene
ciloleucel), produzido pela Kite Pharma Inc. para tratamento de linfoma agressivo não Hodgkin.
O tratamento consiste na modificação genética de células T do próprio paciente; para isso, essas
219
Unidade III
células são retiradas do paciente e são transduzidas com um vetor retroviral, expressando um
transgene que codifica para o chimeric antigen receptor (CAR). O CAR se liga ao antígeno CD19 que
é expresso na superfície de células B do linfoma. Dessa forma, os linfócitos T passam a responder
contra as células tumorais. As células modificadas são chamadas de CAR T-cell (célula T com receptor
de antígeno quimérico). O Kymriah (tisagenlecleucel), produzido pela Novarts Pharmaceuticals
Corp., é um tratamento semelhante ao Yescarta, mas utiliza um lentivetor carreando o gene CAR.
O medicamento foi aprovado para uso no tratamento de leucemia linfoblástica aguda de células B
em crianças e adultos até 25 anos. O Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl), comercializado pela
Spark Therapeutics Inc., é um AAV que carrea o gene RP65 para tratamento de distrofia de retina
causada por mutações nesse gene. O medicamento é uma alternativa terapêutica promissora no
tratamento dessa doença genética rara que leva à perda da visão.
Tratamento com células CAR T
Produção das células

Coleta do sangue Célula T CAR T em laboratório
do paciente para Inserção gênica
obter células T do CAR
Célula T
Receptor de antígeno quimérico
Células CAR T ligam-se às

células do câncer e as destroem Célula T CAR
Célula cancerosa
Antígenos
Crescimento das células
CAR T em laboratório
Célula T CAR
Célula cancerosa
Infusão das células
CAR T no paciente
Células CAR T: mecanismo da ação
Céluls T Célula do Tumor
CAR possibilita as células T de

Expressão do reconhecerem o antígeno tumor
CAR
Inserção
DNA viral
r
mo
tu
odo
en
tíg
An
Morte das células do tumor

As células CAR T se multiplicam e
liberam citocinas
Figura 121 – Exemplo do tratamento com Células CAR e mecanismo de ação
220
• 2019 até o presente: tratamento do primeiro paciente brasileiro com as células CAR T. O paciente
foi diagnosticado em 2011 com linfoma não Hodgkins e desde então passou por diversas terapias,
contudo nenhuma levou a uma melhora significativa do seu quadro. A terapia com células CAR T
foi desenvolvida pelo Centro de Terapia Celular (CTC), um Centro de Pesquisa, Inovação e Difusão
da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), sediado na USP de Ribeirão
Preto. O paciente foi tratado com uma aplicação de células CAR T e trinta dias depois, apresentou
ganho de peso, dispensou o uso da morfina, não apresentou mais suores noturnos e apresentou
redução das manchas tumorais (TOLEDO, 2019).
Saiba mais
Para saber mais sobre a terapia brasileira com células CAR T, leia:
TOLEDO, K. Células do próprio paciente são usadas em tratamento

inovador contra o câncer. Revista Fapesp, out. 2019. Disponível em:
http://agencia.fapesp.br/celulas-do-proprio-paciente-sao-usadas-em-
tratamento-inovador-contra-o-cancer/31656/. Acesso em: 28 abr. 2020.
Até o presente momento, são mais de 3 mil protocolos clínicos com terapia gênica ao redor do
mundo e mais de vinte fármacos sendo comercializados. A grande maioria dos ensaios clínicos são para
tratamento de câncer (cerca de 70%), seguido por doenças monogênicas e doenças infecciosas.
7.5.2 Vetores não virais
Os vetores não virais são representados pelos plasmídeos, que são moléculas circulares de DNA,
constituído pelas seguintes sequências:
• Origem de replicação: possibilita a replicação do plasmídeo independente do DNA genômico

bacteriano.
• Gene de resistência a antibiótico: permite a seleção das bactérias transformadas com o

plasmídeo através da sua adição no meio de cultura.
• Múltiplo sítio de clonagem (MSC): sequência de nucleotídeos reconhecida por enzimas de

restrição. No MSC, normalmente é inserido o gene de interesse sob controle do promotor no
terminal 5’, finalizando com um sinal de poliadenilação (PoliA) no terminal 3’.
A figura seguinte mostra um exemplo de um plasmídeo muito utilizado em pesquisas científicas.

Trata-se do pGFP-N3, plasmídeo que expressa o gene que codifica a proteína verde fluorescente chamada
de GFP (do inglês green fluorescent protein).
221
Unidade III
NheI (591)
BmtI (595)
AfeI (596)
BglII (609)
PaeR7I - XhoI (613)
Eco53kI (618)
0
450
SacI (620)
HindIII (622)
50
Prom 0 EcoRI (629)
ori oto PstI (638)
r CM SalI (639)
V Acc65I (645)
KpnI (649)
SacII (652)
0
MC
400
PspOMI (653)
S
TspMI - XmaI (656)
ApaI (657)
1000 P
SmaI (658)
GFGPF
liA
BamHI (660)
XcmI (671)
a po
Caud
pGFP-N3
4724 bp
3500
iA
1500
pol
da
Cau
Ne
oR 300
/K 0
ri
an
1oroi
R
f1f 0
200
2500
Figura 122 – Plasmídeo pGFP-N3. A figura representa as sequências de DNA presentes no plasmídeo pGFP-N3. Em amarelo temos
a origem de replicação. Em verde luminescente o gene GFP, em azul o múltiplo sítio de clonagem (MSC) com diversos exemplos de
enzimas de restrição capazes de reconhecer sequências nesse sítio. Em branco, as regiões promotoras, no caso, o promotor CMV
(citomegalovírus) está promovendo a expressão do gene GFP constitutivamente. Em cinza, temos a sequência de poliadenilação. Em
verde claro, temos os genes que codificam proteínas que permitem resistência aos antibióticos Neomicina e Kanamicina
Uma diversificada engenharia pode ser realizada nos plasmídeos, a fim de expressar o gene de
interesse, diversos promotores podem ser utilizados. Por exemplo o promotor CMV (citomegalovírus)
é muito utilizado, pois pode expressar constitutivamente o gene de interesse em qualquer célula. No
entanto, existem diversos promotores que podem expressar os genes de maneira específica em um tipo
de célula, por exemplo, o promotor MCK7, que é um promotor específico de células musculares.
Um entrave dos plasmídeos é a sua baixa capacidade de transfectar as células de interesse. Dessa
forma, técnicas adicionais devem ser utilizadas para facilitar a entrada do plasmídeo na célula, tanto in
vivo como in vitro. Métodos como a nucleofecção, eletroporação, sonoporação, injeção hidrodinâmica e
complexos de plasmídeos com lipossomos, policátions ou partículas magnéticas, são alternativas muito
utilizadas para aumentar a taxa de transfecção.
Em relação à expressão do gene de interesse pelos plasmídeos, ela ocorre de forma transiente,
uma vez que o plasmídeo permanece episomal, ou seja, não se integra no genoma da célula alvo,
e sua permanência na célula é diluída à medida em que a célula se divide. A duração da expressão
222
do transgene também pode ser reduzida pela presença de sequências CpG, dinucleotídeos de citosina
fosfato e guanina não metilados, presentes no DNA bacteriano, e quando são reconhecidas pelo sistema
imune de células de mamíferos, silenciam a expressão gênica por metilação.
Com o intuito de remover as sequências CpG e demais sequências bacterianas do plasmídeo, foram
desenvolvidos os vetores minicirculares, que são menores que o plasmídeo original, o que facilita a
sua entrada na célula alvo e permite uma maior duração da expressão do transgene. No entanto, essa
técnica de produção possui baixo rendimento com pequena contaminação do DNA original.
Saiba mais
Para saber mais sobre vetores minicirculares, leia:
GASPAR, D. et al. Minicircle DNA vectors for gene therapy: advances

and applications. Expert Opin. Biol. Ther., v. 15, n. 3, p. 353-379, 2015.
Os plasmídeos são muito estudados e já existem 466 ensaios clínicos em andamento. Por exemplo,
os ensaios clínicos para produção de vacina para hepatite B e para tratamento de isquemia crítica
de membros. Este último encontra-se em fase III e utiliza o plasmídeo expressando HGF (do inglês
hepatocyte growth factor), que é um importante fator angiogênico. Recentemente foi aprovada para
comercialização na Ásia uma vacina contra um flavivírus que causa encefalite.
Saiba mais
Você sabia que existem vetores não virais integrativos? Os sistemas

denominados sleeping beauty transposon e integrasse phiC31 são
importantes ferramentas que permitem a expressão permanente do gene
de interesse. Leia:
EHRHARDT, A. et al. A direct comparison of two nonviral gene therapy

vectors for somatic integration: in vivo evaluation of the bacteriophage
integrase phiC31 and the sleeping beauty transposase. Mol. Ther., v. 11,
n. 5, p. 695-706, 2005.
7.5.3 Vetores virais
Os vetores virais são caracterizados pela utilização de um vírus, destituído de suas sequências
patogênicas, como carreadores de genes. Eles são classificados de acordo com o tipo de vírus escolhido,
os mais estudados na área de terapia gênica são: adenovírus (Ad), lentivírus (Lv), retrovírus (Rv) e vírus
adenoassociado (AAV).
223
Unidade III
Diversos fármacos estão sendo comercializados na área de terapia gênica, grande parte deles utiliza
os vetores virais como carreadores dos genes. A tabela seguinte mostra os principais fármacos aprovados.
A comercialização desses fármacos criou um marco na história da farmacologia e abriu uma janela de
oportunidades na área de terapia gênica.
Tabela 7 – Principais fármacos à base de terapia gênica aprovados para comercialização
Vetor viral Ensaios clínicos Medicamento Doença

Ad 574 Genedicine Tumor
Strimvelis SCID-ADA
Rv 524 Yescarta Linfoma
Lv 304 Kymriah Leucemia
Glybera LPLD
AAV 244 Luxturna DR
Zolgensma SMA
LPLD: deficiência de lipoproteína lipase; SMA: atrofia muscular espinhal; DR: distrofia de retina.
Adenovírus (Ad)
O Adenovírus (Ad) são vírus de DNA fita dupla, não envelopados com capsídeo icosaédrico. Diversos
subtipos desse vírus foram identificados e o mais utilizado é o Ad5. Eles podem transduzir células
quiescentes ou em divisão e permitem uma forte expressão do gene de interesse. No entanto, essa
expressão é transiente, uma vez que esse vírus não tem a capacidade de se integrar no genoma das
células do hospedeiro. O tamanho máximo do gene que pode ser carreado é 8 kb. Esse gene deve ser
inserido entre as sequências invertidas repetidas ITR (do inglês inverted terminal repeats), sendo que a
ITR direita funciona como promotor e a ITR esquerda indica o fim da transcrição do gene. Diversos genes
adenovirais são importantes para a produção da partícula viral, existem genes que são expressos mais
cedo (E1-4) e outros, mais tarde (L1-5A). Para a produção do Ad recombinante, o gene E3 foi retirado
por ser patogênico, e o gene E1, necessário para autorreplicação viral, foi inserido no genoma de células
HEK-293 (do inglês human embryonic kidney); conhecidas como células empacotadoras, devido a sua
capacidade de produzir o vetor viral. A deleção desse gene no genoma do Ad, recombinante trouxe
mais segurança ao procedimento, tornando o vírus incapaz de se autorreplicar nas células do
hospedeiro. Os demais genes foram adicionados em um outro plasmídeo, chamado plasmídeo de
empacotamento. Uma vez que os plasmídeos com o gene de transferência e o de empacotamento são
transfectados nas células HEK-293 E1+, os vírus começam a ser produzidos e podem ser coletados e
utilizados para os procedimentos de terapia gênica. A figura seguinte mostra um exemplo da construção
de um Ad recombinante.
Genes de empacotamento
BE BD
sem E1 e E2
HEK-293
+
E1+
BE ITR Genes de interesse ITR BD
Figura 123 – Exemplo de empacotamento de vetor Ad. BD: braço direito, BE: braço
esquerdo, ITR: inverted terminal repeats, HEK: human embryonic kidney
224
Retrovírus (Rv)
Os retrovírus (Rv) apresentam genoma RNA de dupla fita de filamento positivo (7-11 kb) e são capazes
de integrar o seu genoma na célula. Os Rv recombinantes integram no genoma da célula hospedeira um
gene de até 8 kb, no entanto essa integração ocorre de forma randômica e somente ocorre em células
em divisão. Diversas sequências são necessárias para produção do Rv, são elas (LENTIVIRAL, [s.d.]):
• LTR (do inglês long-terminal repeat): uma região composta por três partes denominadas
U3 (unique 3), R (repeated region) e U5 (unique 5). A U3 contém as sequências necessárias
para a ativação da transcrição do RNA viral, a R contém um sítio de ligação para a proteína Tat
(transativador que ativa a transcrição da LTR promotora). A U5, assim como a U3, é importante
na ativação da transcrição do RNA viral, mas quando posicionada na 3’LTR, funciona como uma
cauda poliA. Assim, a 5’LTR atua como um promotor de RNA polimerase II e a 3’LTR como um
terminador da transcrição pela adição de uma cauda poliA. O gene de interesse deve ser inserido
entre a 5’LTR e a 3’LTR.
• cPPT (do inglês central polypurine tract): serve como um sítio de reconhecimento para a
síntese do DNA viral. Aumenta a eficiência de transdução e expressão do transgene.
• Psi (Ψ): sítio necessário para empacotamento do RNA viral.
• WPRE (do inglês woodchuck hepatitis virus post‐transcriptional regulatory element):

aumenta a exportação do material genético para o núcleo da célula hospedeira.
• Gag: codifica proteínas que compõem a matriz, o capsídeo e o nucleocapsídeo.
• Pol: codifica as enzimas transcriptase reversa e demais integrases virais.
• VSV-G (vesicular somatitis virus G glycoprotein): envelope viral modificado, permitindo

tropismo por diversos tipos celulares.
Para a produção de Rv, são utilizadas as células PT67 que são uma linhagem de fibroblastos murino,
chamada NIH-3T3, modificada com os genes Gag-Pol e também com envelope do vírus MoMLV (do inglês
moloney murine leukemia virus). No entanto, atualmente esses vírus podem ser também produzidos em
células HEK-293T.
LTR Genes de interesse LTR PT-67
Figura 124 – Exemplo de empacotamento de vetor Rv. LTR: repetição terminal longa
225
Unidade III
Observação
As células PT-67 foram muito utilizadas no passado para a produção

de Rv, no entanto, mais tarde foi descoberto que essas células produziam
um vírus que era facilmente inativado pelo soro humano, portanto isso
tornava-o deficiente para protocolos em humanos. As células HEK-293T
são capazes de produzir Rv resistentes à inativação, além disso foram
modificadas para expressarem o antígeno tumoral (T) do simian virus 40
(SV40), por isso a adição da letra T no nome.
Os Rv recombinantes foram os primeiros vetores utilizados nos protocolos clínicos de terapia gênica.
Atualmente são 524 fármacos em ensaios clínicos e dois medicamentos já em comercialização. Os
vetores mais conhecidos são os provenientes do MoMLV e o MSCV (do inglês murine stem cells virus).
Lentivírus (Lv)
Os lentivírus (Lv) são provenientes do vírus HIV. Uma das principais características dos Lv é que
eles são capazes de integrar o gene no genoma de células quiescentes. Por isso, são bastante utilizados
nos protocolos in vivo. Para obtenção do Lv recombinante, diversos genes selvagens presentes no vírus
HIV foram removidos. A primeira modificação foi a retirada das sequências virais gag, pol, env e rev do
genoma do Lv. Essas sequências foram separadas em diferentes plasmídeos e, para a produção do vírus,
são transfectadas nas células empacotadoras HEK-293T. Uma segunda modificação foi o uso do
envelope VSV-G, permitindo a pseudotipagem do vírus.
Outra modificação foi a criação dos vetores self-inactivating (SIN) através da deleção de sequências do
terminal 3’LTR. A presença dessas sequências favorecia a ativação de proto-oncogenes e, dessa forma, tornava
inseguro o uso desses vetores nos ensaios clínicos. Cada modificação realizada produzia uma geração de Lv
mais segura, até o presente momento temos quatro gerações desses vetores. Os Lv de terceira geração, mais
utilizados, possuem promotores específicos e, portanto, não utilizam mais a 5’LTR como promotor. Os vetores
de quarta geração subdividiram ainda mais as sequências necessárias para a produção da partícula viral,
tornando o procedimento mais seguro. A figura seguinte mostra um exemplo da produção de Lv.
Envelope
VS V - G
cDNA* g /P
ol/Rev/T
HEK-293T
Ga
at
Vetor com o gene Vetor de Partícula lentiviral

de interesse empacotamento
Figura 125 – Exemplo de produção de Lv
226
Vírus adenoassociado (AAV)
Os vírus adenoassociados (AAV) são vírus de DNA simples fita, não envelopados, encapsulados por
um capsídeo icosaédrico. Os AAV foram descobertos como contaminantes que apareceram durante a
produção de Ad. Foi observado que os AAV apresentavam baixa capacidade de replicação e, por isso,
necessitavam da presença de Ad para que ela ocorresse de forma mais eficiente. Para a produção do
AAV recombinante, é necessária expressão dos genes rep e o cap que são importantes para produção de
proteínas estruturais e importantes para replicação, transcrição e demais passos da produção viral. Esses
genes normalmente são carreados em plasmídeos separados. O gene de interesse deve ser inserido entre
as sequências ITRs, assim como também ocorre para produção dos Ad. As demais etapas da produção
ocorrem da mesma forma que nos Ad. Existem diversos sorotipos de AAV e cada um apresenta um
tropismo por determinados tecidos.
Edição genômica
A edição genômica é uma ferramenta que permite a correção da mutação de uma sequência de
DNA de maneira precisa. Para realização da edição genômica, são utilizadas nucleases que reconhecem
e cortam sequências específicas de DNA. Inicialmente, as nucleases tipo dedo-de-zinco (do inglês
zinc‑finger) e as nucleases efetoras ativadoras de transcrição (do inglês Talen) eram utilizadas apenas
por grupos de pesquisa restritos e especializados pelo mundo, devido à complexidade de execução de
suas técnicas e principalmente pela limitação das nucleases em quebrar a dupla fita de DNA quando
estão em dímeros, fazendo-se necessário o reconhecimento da sequência de DNA nas duas fitas da
região alvo. De fato, a edição genômica se tornou popular, acessível e mais abrangente após a adaptação
do sistema de defesa de procariotos contra vírus, gerando a tecnologia CRISPR/Cas9.
Saiba mais
Atualmente, muito tem se comentado acerca da edição genômica

pelo sistema CRISPR/Cas9. Para saber mais sobre essa outra ferramenta de
terapia gênica leia os artigos:
GUIMARÃES, M. Uma ferramenta para editar o DNA. Revista da Fapesp,

fev. 2016.
FELLMANN, C. et al. Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and

therapy. Nat. Rev. Drug. Discov., v. 16, p. 89-100, 2017.
8 MANEJO LABORATORIAL
Abordaremos agora o manejo de um laboratório de biologia molecular. Ao final deste estudo, você
estará apto a identificar os equipamentos, procedimentos e áreas necessárias para que seja possível
manipular amostras biológicas e realizar testes de biologia molecular.
227
Unidade III
8.1 Normas
De acordo com a portaria n. 1.312/MS, de 30 de novembro de 2000 (BRASIL, 2000), os laboratórios

de biologia molecular são classificados como tipo II, o que significa que são capazes de realizar
procedimentos de histocompatibilidade por meio de sorologia e biologia molecular. Segundo a RDC
n. 50/2002, o laboratório de biologia molecular é classificado no nível de segurança 2 (NB-2). Sendo
adequado para trabalhos que envolvam sangue humano, líquidos corporais, tecidos ou linhagens de
células humanas primárias em que a presença de um agente infeccioso é desconhecida.
Dessa forma os laboratórios devem obedecer às normas definidas por essa portaria para montarem a
estrutura do laboratório de acordo com a legislação vigente. A maior parte dos exames laboratoriais utiliza
a técnica de PCR, no entanto, essa técnica está sujeita a diversos interferentes, caso haja contaminação
da amostra com material genético previamente amplificado em outras reações, os chamados amplicons.
Os riscos de contaminação podem ser minimizados com organização do espaço do laboratório e com
procedimentos para tornar segura a manipulação de amostras e compostos tóxicos. Além de criar um
espaço que permita o funcionamento correto dos equipamentos, a estocagem correta de amostras e
reagentes, laudos e setores administrativos.
8.2 Laboratório
O laboratório deve dispor de áreas e espaços bem delimitados e de acordo com a RDC n. 50/2002,
caso existam procedimentos que apresentem um potencial de produção de salpicos ou aerossóis, eles
devem ser conduzidos em equipamento de contenção primária ou cabine de segurança biológica, além
da utilização de barreiras primárias, como óculos, aventais e luvas. No mesmo laboratório devem existir
barreiras secundárias como, por exemplo, pias para lavagem de mãos e áreas de descontaminação do
lixo. É obrigatório que o laboratório de biologia molecular possua as seguintes áreas:
• Área de separação de amostras: área utilizada para separar as amostras, pode conter centrífuga
e pipetador automático.
• Área de pré-PCR: pode ser localizada no mesmo espaço das áreas de preparação da amostra, desde
que haja um espaço definido para cada uma das áreas e que ele seja respeitado. No entanto, caso
haja mistura de amostras (por exemplo, mistura de plasmas de diferentes doadores em um mesmo
tubo), os espaços deverão ser separados em área de amostras e reagentes. A área de amostras
é onde será realizada a extração do material genético e adição dos ácidos nucléicos à reação de
PCR. Essa etapa deverá ser realizada em cabine de segurança biológica NB2, com ultravioleta. A
limpeza da sala deve ser realizada com reagentes químicos (por exemplo, NaOH 0,5M, HCL 1N)
e/ou ultravioleta (deve ser ligado 15 minutos antes e depois da manipulação da amostra). O uso
do avental deve ser obrigatório nesse espaço. É recomendado que os equipamentos, vidrarias e
reagentes utilizados nessa sala sejam diferentes dos utilizados na área de reagentes. A área de
reagentes é utilizada para dos reagentes necessários para realização da PCR. Essa etapa também
deve ser realizada em cabine de segurança biológica NB2, com ultravioleta e para limpeza devem
ser seguidos os mesmos procedimentos da área de amostra.
228
• Área de pós-PCR: essa área deve ser instalada em uma sala diferente e isolada da área de
pré-PCR, para que sejam evitadas contaminações. Assim como na área pré-PCR, devem ser
utilizados procedimentos de limpeza com reagentes químicos e luz ultravioleta. Normalmente, o
termociclador é mantido nessa área.
Observação
Deverá existir um laboratório de contingência em caso de interdição

da área pré-PCR. Esse laboratório deve ser equipado e montado, pois o
processo não pode ser interrompido.
8.3 Equipamentos
Cada área contém equipamentos específicos e algumas regras devem ser respeitadas:
• A geladeira usada para armazenar as amostras não deve ser a mesma que a utilizada para
armazenar os reagentes.
• As portas devem ser projetadas de forma a permitir a passagem dos equipamentos.
• Não se deve deixar correr gel de eletroforese de DNA no mesmo ambiente no qual se realiza o
preparo do mix da PCR.
• Os termocicladores devem estar devidamente calibrados e passar por manutenções periódicas.
• A localização dos termocicladores é optativa: podem ficar em locais de pré e pós-amplificação.

No entanto, se ficarem em locais de pré-amplificação, os tubos contendo amostras amplificadas nunca
devem ser abertos nesse recinto, mas somente em salas de manuseio de amostras pós‑amplificação.
• As pipetas utilizadas nas técnicas de biologia molecular, normalmente são utilizadas para captação
(popularmente denominado de “pipetagem”) de volumes muito pequenos (ex.: 0,5 µL). Por isso,
devem passar por calibrações periódicas e serem manipuladas por profissionais experientes e
que tenham realizado cursos de capacitação. Pois qualquer volume a mais que seja pipetado nas
reações de PCR pode interferir nos resultados.
Observação
Os termocicladores são equipamentos utilizados nas reações de PCR

que permitem a variação da temperatura e as repetições dos ciclos da
reação. Existem diversos termocicladores disponíveis no mercado.
229
Unidade III
Figura 126 – Exemplo de conjunto de pipetas usado em laboratório de biologia molecular
Saiba mais
Para saber mais sobre como pipetar corretamente, leia:
SP LABOR. Boas práticas em pipetagem aspectos importantes envolvendo

este procedimento. [s.l.], [s.d.]. Disponível em: https://lidoc.paginas.ufsc.br/
files/2013/10/splabor-boas-pr%c3%a1ticas-de-pipetagem.pdf. Acesso em:
28 abr. 2020.
8.4 Recursos humanos
O laboratório deve ter pessoal devidamente qualificado e treinado com conhecimento técnico e
experiência para as funções designadas. Recomenda-se que o responsável técnico possua título de
especialista em biologia molecular humana.
Deve ser realizada a gestão do sistema de qualidade sempre que selecionados e implantados
novos sistemas analíticos. É obrigatório que haja validação desses sistemas e avaliação dos riscos
dos procedimentos para garantia da qualidade. Toda e qualquer atualização deve ser realizada com
aprovação do supervisor técnico ou responsável designado.
8.5 Segurança
Alguns tópicos são muito importantes para que haja segurança no laboratório, são eles:
• Treinamento: os profissionais devem ser treinados antes de realizarem qualquer procedimento

no laboratório. Devem ser disponibilizados manuais com recomendações gerais e específicas
de segurança.
230
• Equipamentos de proteção: para realização dos procedimentos no laboratório, devem ser

utilizadas luvas e aventais descartáveis. Em alguns procedimentos, pode ser solicitado o uso de
máscaras e óculos de proteção.
• Reagentes tóxicos: muitos dos reagentes usados em um laboratório de biologia molecular são
tóxicos, dessa forma o laboratório deve deixar à disposição dos trabalhadores os manuais de
segurança com instruções sobre manuseio, estocagem e descarte desses produtos.
• Agentes físicos (ultravioleta): a luz ultravioleta é um dos principais agentes físicos que merece
atenção, especialmente porque é utilizada para visualização de géis de agarose. Dessa forma, é
muito importante que os profissionais usem proteção para os olhos e para a face. Outro ponto
importante é o uso de voltagens elevadas na eletroforese, esses procedimentos devem ser
realizados na presença do profissional para evitar riscos de incêndio.
• Manipulação de substâncias voláteis: deve-se sempre utilizar capelas de exaustão quando

houver manipulação de substâncias voláteis e tóxicas.
• Materiais biológicos: deve-se estar atento aos requerimentos da Comissão Técnica Nacional de
Biossegurança (CNTBio) para a manipulação de materiais biológicos, especialmente organismos
geneticamente modificados.
Saiba mais
Para saber mais sobre manipulação de amostras biológicas, acesse:
http://ctnbio.mctic.gov.br/
8.6 Recepção e identificação de amostras
Assim que chegarem ao laboratório, as amostras devem ser devidamente identificadas e registradas.
Preferencialmente deve-se utilizar um código de identificação para evitar confusões e erros. As amostras
devem vir acompanhadas de um formulário de requisição de exames, com informações tais como:
1) nome do paciente, 2) identificação do laboratório, 3) data de nascimento e/ou idade, 4) sexo do
paciente, 5) tipo de amostra, 6) profissional que solicitou o exame etc.
Os laboratórios devem estabelecer critérios de aceitação e rejeição de amostras, e, uma vez que esses
critérios não sejam obedecidos, as amostras devem ser rejeitadas.
8.7 Documentação e procedimentos
Deve haver um registro de todos os procedimentos utilizados no laboratório em documentos, os

chamados procedimentos operacionais padrões (POPs), assim qualquer profissional que esteja em
treinamento pode ter acesso aos POPs e executar os procedimentos.
231
Unidade III
Um bom POP deve conter informações detalhadas sobre os protocolos utilizados no laboratório,
preparo dos reagentes e soluções utilizadas. Indicações sobre a marca, número de catálogo,
fabricante. Também devem estar descritos os procedimentos de segurança e os itens de proteção
que devem ser utilizados em cada procedimento, principalmente o que deve ser feito em caso de
contaminação. Além disso, devem ser descritos os procedimentos para utilização dos equipamentos
do laboratório.
Sempre deve ser realizado um treinamento introdutório para os iniciantes e um programa de

educação continuada para toda a equipe.
8.8 Validação dos testes realizados no laboratório
É muito importante que o laboratório realize a validação dos testes que serão realizados antes de
introduzi-los na rotina. Para uma validação eficiente devem ser seguidos alguns procedimentos:
• Extensa revisão da literatura sobre os testes que serão realizados.
• Identificar e caracterizar o locus e a mutação que serão avaliados.
• Devem-se calcular os parâmetros de sensibilidade e especificidade.
• Definir os tipos de amostras que serão analisadas.
• Determinar quais são as etapas críticas e sujeitas a erro.
• Identificar as limitações do teste.
É sempre importante acompanhar a literatura científica e do mercado em busca de melhorias em

reagentes, métodos e equipamentos, bem como softwares.
Todos os testes realizados devem ser documentados e guardados por no mínimo cinco anos. Os
registros devem conter o número de pacientes incluídos em cada corrida, os métodos e equipamentos
utilizados, a quantidade e a pureza do material genético utilizado em cada analise, o número de lote
e validade dos reagentes, os dados brutos obtidos em cada corrida, em caso de métodos próprios do
laboratório, cada reagente deve ser aprovado.
8.9 Elaboração de laudos
Os laudos devem ser elaborados de forma a serem compreendidos pelos profissionais de saúde. Além
disso, precisam ser transmitidos de forma a preservar a confidencialidade do paciente. Alguns tópicos
importantes devem ser contemplados em um laudo:
• Nome do indivíduo.
232
• Data do nascimento.
• Data da coleta.
• Sensibilidade analítica.
• Valores de referência.
• Descrição resumida da metodologia acompanhada, se possível, da bibliografia correspondente.
• Descrição dos resultados.
• Descrição clara das áreas não cobertas pelo teste.
• Data do laudo.
• Assinatura, nome e registro no respectivo conselho profissional do responsável técnico pelo exame
(ou laboratório).
• Nome, endereço e telefone do laboratório.
Quando se tratar de laudos de doenças genéticas complexas com múltiplas mutações possíveis,
deve ser incluso no laudo uma estimativa da chance de detecção da mutação e o risco residual de ser
portador de mutações não testadas. Além disso, o laudo pode incluir uma discussão sobre as limitações
dos achados e das implicações clínicas da mutação encontrada.
O laudo de cada técnica tem suas particularidades, por exemplo, o laudo de um exame genético
realizado por sequenciamento NGS deve conter a versão específica do método de bioinformática
utilizado, e essa análise deve ser passível de rastreio. Já um laudo de paternidade deve conter:
• a chance individual de paternidade para cada sistema genético
• a chance combinada de paternidade;
• a probabilidade de paternidade (porcentagem);
• as fontes alélicas utilizadas para os cálculos e a população.
233
Unidade III
Saiba mais
Para saber mais sobre laudos e demais diretrizes de diagnósticos

moleculares, leia:
SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA. Lista de orientação em

diagnóstico molecular. [s.l.], 2018. Disponível em: sbpc.org.br/wp-content/
uploads/2018/09/ListaDeOrientacaoEmDiagnosticoMolecular2018.pdf.
Acesso em: 28 abr. 2020.
Resumo
Os seres humanos apresentam variações em seus genomas, que

podem ser mudanças de apenas um nucleotídeo ou ganhos ou perdas
de cromossomos inteiros. Os polimorfismos são variantes cuja frequência
de aparecimento nos cromossomos de uma população é acima de 1%.
Eles são classificados em SNPs ou indels. Os SNPs, mais comuns, são
polimorfismos em que há alteração de um par de base em uma localização
específica do genoma, já os indels podem ser classificados como simples
ou multialélicos. Os simples apresentam dois alelos, ou seja, a presença
ou ausência do seguimento inserido ou deletado. Já os multialélicos se
apresentam como repetições de fragmentos de DNA em tandem (repetições
de 1-6 bases de comprimento que se encontram uma ao lado da outra
no cromossomo intercaladas por outras sequências de DNA). Os indels
multialélicos são subdivididos em microssatélites (também conhecidos
como STR) e minissatélites. Os microssatélites são segmentos de DNA de
1 a 10 nucleotídeos repetidos no genoma, já os minissatélites são
segmentos de DNA de 10 a 100 nucleotídeos repetidos centenas ou
milhares de vezes no genoma.
A maior parte das sequências variantes presentes na população são

inofensivas e muitas vezes não tem efeito no fenótipo. Algumas variantes
levam à alteração do fenótipo, mas isso faz parte da variação normal de
indivíduo para indivíduo. No entanto, certas variantes estão relacionadas
a doenças ou à susceptibilidade de desenvolver doenças. Dessa forma, é
importante o desenvolvimento de técnicas que sejam capazes de detectar
a presença dessas variantes. Diversas técnicas de biologia molecular são
utilizadas sendo as principais: cariótipo, Fish, PCR, RT-PCR, qPCR, RFLP e
sequenciamento de DNA. O uso de cada uma dessas técnicas varia de acordo
com o tipo de variante estudada, protocolo padronizado pelo laboratório
e custo.
234
As técnicas de biologia molecular são bastante utilizadas nos testes

de paternidade e forense. As regiões do DNA utilizadas nas análises de
DNA Forense são os STR que se localizam em um loci, que é comum nos
seres humanos. Porém, a sequência de nucleotídeos e o número de vezes
que se repetem é variável o suficiente para ser única em cada indivíduo. É
assim que se forma a impressão de DNA digital do nosso código genético e
essa impressão é herdada dos pais e, por isso, também é possível realizar a
identificação de parentesco.
A coleta do material genético para fins forenses deve ser bastante

rigorosa e obedecer a uma série de critérios para que não sofra nenhum
tipo de contaminação. As amostras coletadas podem ser: sangue, sêmen,
secreção, tecidos moles, pelos e anexos dérmicos, urina, saliva etc.
O DNA também pode ser uma ferramenta valiosa na combinação

de tecidos para transplantes. Nesse caso, os genes HLA presentes no
cromossomo 6, são avaliados para verificar se o doador e o receptor são
compatíveis, essa avaliação é chamada tipagem. A tipagem pode ser
realizada por: sorologia, PCR-SSP, SSOP e sequenciamento.
É possível também utilizar o material genético (DNA ou RNA) como

terapia, procedimento conhecido como terapia gênica. Diversas doenças
como linfomas, leucemias e algumas doenças genéticas já estão sendo
tratadas por terapia gênica. Normalmente, o material genético é carreado
por vetores que podem ser derivados de plasmídeos, portanto denominados
não virais ou por vírus como Rv, Adv, AAV, Lv, entre outros, sendo
denominados vetores virais.
Em suma, é muito importante que um laboratório que utilize técnicas de

biologia molecular para fins diagnósticos obedeça a regras que já estão
definidas na RDC n. 50/2002. Permitindo assim a liberação de laudos e
diagnósticos que sejam confiáveis e de fácil interpretação para médicos e demais
profissionais da área da saúde.
235
Unidade III
Exercícios
Questão 1. (Enade, 2016). Os alimentos transgênicos resultam de um processo de modificação molecular

por meio das técnicas de engenharia genética. A obtenção de plantas transgênicas passa por três etapas:
obtenção do gene que deve ser incorporado em um vetor para se processar a transformação; introdução do
gene na planta receptora; e regeneração da célula em uma nova planta, por meio da cultura de tecidos.
Disponível em: http://www.fruticultura.iciag.ufu.br. Acesso em: 15 mar. 2020. Adaptado.
A respeito dos vetores utilizados na engenharia genética, avalie as afirmativas a seguir.
I – Os plasmídeos bacterianos são utilizados como vetores de clonagem do gene de interesse para a
transformação genética em plantas.
II – Os plasmídeos são dependentes do DNA cromossômico para replicação, sendo frequentemente

manipulados no processo de transformação gênica.
III – Para ser um bom vetor de clonagem, um plasmídeo deve possuir origem de replicação, sítios de
clivagem para endonucleases de restrição e um gene que codifique resistência a um antibiótico.
É correto o que se afirma em:
A) I, apenas.
B) II, apenas.
C) I e III, apenas.
D) II e III, apenas.
E) I, II e III.
Resposta correta: alternativa C.
Análise das afirmativas
I – Afirmativa correta.
Justificativa: geralmente são utilizados plasmídeos bacterianos como vetores na clonagem do gene
de interesse para a transformação genética de plantas.
236
II – Assertiva incorreta.
Justificativa: os plasmídeos bacterianos são independentes do DNA cromossômico, capazes de auto

replicação, por isso facilmente manipulado no processo de transformação genética.
III – Assertiva correta.
Justificativa: os genes marcadores são utilizados na seleção e são responsáveis por codificar uma
proteína com atividade enzimática, ou para um produto, que irá conferir às células transformadas da
planta resistência a um determinado substrato; esse gene marcador permite que apenas as células
transformadas cresçam em detrimento das células não transformadas. Os genes repórteres são aqueles
que codificam para uma proteína, geralmente com atividade enzimática, cujo produto é facilmente
detectável, possibilitando a identificação ou marcação das células transformadas sem eliminar as células
não transformadas. Funciona como gene complementar ao gene de seleção.
Disponível em: http://www.pucgoias.edu.br/enade/2019/e-books/

ebook-biomedicina-2019.pdf. Acesso em: 15 mar. 2020.
Questão 2. (Fundatec, 2017). A maior parte do genoma humano é idêntica entre os indivíduos, porém
existem regiões que podem variar de pessoa para pessoa (polimorfismos). Essas regiões polimórficas,
dependendo de suas características, podem apresentar aplicações diferentes nos exames forenses.
Após os trabalhos pioneiros de Alec Jeffrey, os _I_ foram os primeiros polimorfismos moleculares
utilizados em investigações criminais, sendo atualmente amplamente substituídos pelos _II_. Outra
classe de polimorfismos moleculares, os _III_ têm sido aplicados na identificação humana em casos
de amostras degradadas ou com reduzidas concentrações de DNA, devido aos pequenos amplicons
produzidos. Alguns polimorfismos podem ser empregados como AIMs, a exemplo de alguns _IV_ e _V_,
podendo fornecer informações sobre ancestralidade dos indivíduos ou mesmo serem utilizados para
predição de características físicas.
Assinale a alternativa que preenche, correta e respectivamente, as lacunas do trecho anterior.
A) RFLPs – SNPs – STRs – VNTRs – INDELs.
B) SNPs – RFLPs – STRs – INDELs – mini-STRs.
C) RFLPs – VNTRs – INDEs – INDELs – SNPs.
D) VNTRs – STRs – RFLPs – SNPs – INDELs.
E) VNTRs – STRs – SNPs – SNPs – INDELs.
Resposta correta: alternativa E.
237
Unidade III
Análise da questão
Na lacuna I são os VNTRs, que são minissatélites ou repetições em tandem de número variável.
As sequências de DNA podem ser encontradas repetidas dezenas ou até centenas de vezes, em algumas
regiões do genoma (loci) e, por serem variáveis podem ser utilizadas para diferenciar os indivíduos,
sendo de 10 a 100 pb repetidas em tandem em múltiplas regiões do genoma;
Na lacuna II são os STRs, por serem microssatélites com sequências curtas repetidas em tandem no
genoma, possuírem tamanho de 2 a 10 pb e se localizarem em regiões não codificantes do genoma. Para
que esses marcadores sejam úteis na identificação humana, devem ser polimórficos (diferentes números
de repetições) para serem diferenciados entre si e os STRs apresentam vários alelos para o mesmo locus.
Nas lacunas III e IV são os SNPs, sendo variações de uma única base (polimorfismo em um único
nucleotídeo). Sua vantagem de uso está nas análises muito degradadas, quando o DNA se encontra muito
fragmentado. Eles podem ser encontrados em sequências codificantes, íntrons, regiões intergênicas e
regulatórias. Ao compararmos os cromossomos homólogos de um mesmo indivíduo, observamos um
SNP a cada 1000 pb.
Na lacuna V são os INDELS, que são inserções ou deleções de nucleotídeos em determinadas regiões
do DNA que podem variar de um nucleotídeo a centena deles.
A utilização de IV-SNPs e V-INDELS na identificação humana ainda é incipiente, mas assim como os
SNPs, devem se tornar uma metodologia importante no futuro.
238
FIGURAS E ILUSTRAÇÕES
Figura 1
A) LEEUWENHOEK_MICROSCOPE.PNG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/d/de/Leeuwenhoek_Microscope.png. Acesso em: 25 mar. 2020.
B) ADEEL, A. A. A relic of the Wellcome Tropical Research Laboratories in Khartoum (1903-1934).

Sudan J. Pardiatr., v. 16, n. 1, p. 70, 2016. Adaptada.
Figura 2
LEUWENHOEK_PICTURE_OF_ANIMACULES.PNG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/

wikipedia/commons/0/05/Leuwenhoek_picture_of_animacules.png. Acesso em: 25 mar. 2020.
Figura 3
OSC_MICROBIO_03_01_REDIEXPT.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/d/d9/OSC_Microbio_03_01_Rediexpt.jpg. Acesso em: 25 mar. 2020. Adaptada.
Figura 4
RATCLIFF, M. J. Temporality, sequential iconography and linearity in figures: the impact of the
discovery of division in infusoria. Hist. Philos. Life Sci., v. 21, n. 3, p. 264, 1999.
Figura 5
FILE:SWAN-NECKED_FLASK_USED_BY_PASTEUR._WELLCOME_M0012521.JPG. Disponível em: https://

upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e2/Swan-necked_flask_used_by_Pasteur._Wellcome_
M0012521.jpg. Acesso em 25 mar. 2020.
Figura 8
FIGURE_04_02_02.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/06/

Figure_04_02_02.jpg. Acesso em: 25 mar. 2020.
Figura 9
A) EHRENBERG_EUGLENA_VIRIDIS.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/e/e8/Ehrenberg_euglena_viridis.jpg. Acesso em: 25 mar. 2020.
B) MIKROFOTO.DE-VOLVOX-8.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/

ee/Mikrofoto.de-volvox-8.jpg. Acesso em: 25 mar. 2020.
239
Figura 10
CLIFT, D.; SCHUH, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature
Reviews Molecular Cell Biology, v. 14, n. 9, p. 3, 2013.
Figura 11
STEVENS, N. M. A study of the germ cells of certain diptera, with reference to the heterochromosomes
and the phenomena of synapsis. Journal of Experimental Zoology, v. 5, n. 3, p. 19, 1908. Adaptada.
Figura 12
MORGAN, T. H. The Physical Basis of Heredity. Filadélfia: Lippincott Company, 1919.
Figura 13
KOSZUL, R. et al. The Centenary of Janssens’s Chiasmatype Theory. Genetics, v. 191, n. 2, p. 313, 2012.
Figura 16
SAGER, R.; RYAN, F. R. Cell heredity. 2. ed. John Wiley & Sons, 1961. p. 14. Adaptada.
Figura 17
WATSON, J. D. et al. DNA recombinante genes e genomas. 3. ed. Artmed, 2009. p. 16. Adaptada.
Figura 18
LOEFFLER, J. M.; FISCHETTI, V. A. Lysogeny of Streptococcus pneumoniae with MM1 Phage: improved
adherence and other phenotypic changes. Infection and Immunity, v. 74, n. 8, p. 4490, 2006. Adaptada.
Figura 23
DNA_STRUCTURE%2BKEY%2BLABELLED.PN_NOBB.PNG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/

wikipedia/commons/4/4c/DNA_Structure%2BKey%2BLabelled.pn_NoBB.png. Acesso em: 20 abr. 2020.
Figura 24
DEVLIN, T. M. Manual de bioquímica com correlações clínicas. 7. ed. São Paulo: Blucher, 2011. p. 41. Adaptada.
Figura 25
DNACONFORMATIONS.PNG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/00/

Dnaconformations.png. Acesso em: 20 abr. 2020.
240
Figura 27
DNA_PALINDROME.SVG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/75/DNA_

palindrome.svg. Acesso em: 22 abr. 2020.
Figura 28
LODISH, H. et al. Molecular cell biology. 5. ed. Nova York: Freeman, 2004. p. 107. Adaptada.
Figura 29
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger princípios de bioquímica. 3. ed. São Paulo: Sarvier, 2002. p. 720. Adaptada.
Figura 30
SCHVARTZMAN, J. B.; STASIAK, A. A topological view of the replicon. EMBO Reports, v. 5, n. 3, p. 257,
2004. Adaptada.
Figura 31
SUBHASH_NUCLEOID_06.PNG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/98/

Subhash_nucleoid_06.png. Acesso em: 22 abr. 2020.
Figura 32
HENTHORN, N. T. et al. Nanodosimetric simulation of direct ion-induced DNA damage using different
chromatin geometry models. Radiation Research, v. 188, n. 6, p. 693, 2017.
Figura 33
A) DEAN, F. et al. Escherichia coli Type-1 Topoisomerases: identification, mechanism, and role in
recombination. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. v. 47, p. 773, 1983. Adaptada.
B) BROWN, P.; COZZARELLI, N. A sign inversion mechanism for enzymatic supercoiling of DNA. Science,
v. 206, n. 4422, p. 1082, 1979. Adaptada.
Figura 34
WANG, X.; LLOPIS, P. M.; RUDNER, D. Z. Organization and segregation of bacterial chromosomes.
Nature Reviews Genetics, v. 14, n. 3, p. 193, 2013. Adaptada.
241
Figura 35
COOPER, G. M. A célula: uma abordagem molecular. 2. ed. São Paulo: Artmed, 2001. p. 171-172.
Figura 36
A) LODISH, H. et al. Molecular cell biology. 5. ed. Nova York: Freeman, 2003. p. 428. Adaptada.
B) PAULSON, J. R.; LAEMMLI, U. K. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes. Cell,

12(3), 817–828, 1977. p. 820. Adaptada.
C) ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 6. ed. São Paulo: Artmed, 2017. p. 977. Adaptada.
D) ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 6. ed. São Paulo: Artmed, 2017. p. 982. Adaptada.
Figura 37
A) FIGURE_10_02_03.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/9d/

Figure_10_02_03.jpg. Acesso em: 23 abr. 2020. Adaptada.
B) KINETOCHORE.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/25/

Kinetochore.jpg. Acesso em: 23 abr. 2020.
Figura 38
SHELTERIN-COMPLEX.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/6c/

Shelterin-complex.jpg. Acesso em: 23 abr. 2020. Adaptada.
Figura 39
DNA_EXONS_INTRONS.GIF. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/12/

DNA_exons_introns.gif. Acesso em: 23 abr. 2020. Adaptada.
Figura 40
A-B) BERGET, S. M.; MOORE, C.; SHARP, P. A. Spliced segments at the 5′ terminus of adenovirus 2 late
mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 74, n. 8, p. 3173, 1977.
C) COOPER, G. M. The cell: a molecular approach. 8. ed. Oxford: Oxford University Press, 2019. p. 190.
Figura 41
DNA_ALTERNATIVE_SPLICING.GIF. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/0/0a/DNA_alternative_splicing.gif. Acesso em: 23 abr. 2020. Adaptada.
242
Figura 42
DNA_REPLICATION_SPLIT.SVG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/70/

DNA_replication_split.svg. Acesso em: 23 abr. 2020.
Figura 43
MESELSON-STAHL_EXPERIMENT_DIAGRAM_TR.SVG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/3/39/Meselson-stahl_experiment_diagram_tr.svg. Acesso em: 23 abr. 2020. Adaptada.
Figura 44
ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 6. ed. São Paulo: Artmed, 2017. p. 240. Adaptada.
Figura 45
CAIRNS, J. The Chromosome of Escherichia coli. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology,
v. 28, n. 0, p. 43-44, 1963. Adaptada.
Figura 47
KRISHNA, T. S. R. et al. Crystal structure of the eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA.
Cell, v. 79, n. 7, p. 1236, 1994. Adaptada.
Figura 48
DEVLIN, T. M. Manual de bioquímica com correlações clínicas. 7. ed. São Paulo: Blucher, 2011. p. 151.
Figura 49
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rate. Nature, v. 462, n. 7275, p. 942, 2009. Adaptada.
B) CHASTAIN, P. D. et al. Architecture of the replication complex and DNA loops at the fork generated by
the Bacteriophage T4 proteins. Journal of Biological Chemistry, v. 278, n. 23, p. 21281, 2003. Adaptada.
Figura 51
Figura 53
243
Figura 57
GARCIA, A.B. Biologia molecular. 3.ed. Rio de Janeiro: Fundação CECIERJ, 2009. v. 2. p. 85.
Figura 62
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principles of biochemistry. 6. ed. Nova York: W. H. Freeman, 2012.
p. 301. Adaptada.
Figura 63
A) SANCAR, A. Structure and function of DNA photolyase and cryptochrome blue-light

photoreceptors. Chemical Reviews, v. 103, n. 6, p. 2210, 2003. Adaptada.
B) SANCAR, A. Structure and function of DNA photolyase and cryptochrome blue-light

photoreceptors. Chemical Reviews, v. 103, n. 6, p. 2222, 2003. Adaptada.
Figura 64
COOPER, G. M. A célula: uma abordagem molecular. 2. ed. São Paulo: Artmed, 2001. p. 218.
Figura 65
POLETTO, M.; LEGRAND, A. J.; DIANOV, G.L. DNA base excision repair: the achilles’ heel on tumour cells
and their micro-environment? Current Pharmaceutical Design, v. 23, p. 4759, 2017.
Figura 66
SPIVAK, G. Nucleotide excision repair in humans. DNA Repair, v. 36, p. 14, 2015. Adaptada.
Figura 67
Figura 68
Figura 69
COOPER, G. M. A célula: uma abordagem molecular. 2. ed. São Paulo: Artmed, 2001. p. 223.
244
Figura 70
A) LODISH, H et al. Molecular cell biology. 8. ed. Nova York: W. H. Freeman, 2016. p. 206. Adaptada.
B) COOPER, G. M. The cell: a molecular approach. 8. ed. Oxford: Oxford University Press, 2019.
p. 239. Adaptada.
Figura 71
COOPER, G. M. The cell: a molecular approach. 8. ed. Oxford: Oxford University Press, 2019. p. 256. Adaptada.
Figura 72
Figura 73
GARCIA, A. B. Biologia molecular. 3. ed. Rio de Janeiro: Fundação Cecierj, 2009. v. 2. p. 191. Adaptada.
Figura 74
PANDIT, S.; WANG, D.; FU, X. D. Functional integration of transcriptional and RNA processing
machineries. Current Opinion in Cell Biology, v. 20, n. 3, p. 261, 2008. Adaptada.
Figura 76
Figura 78
DE SOUZA, G. A. Biologia molecular. 1. ed. Rio de Janeiro: Fundação Cecierj, 2008. v. 3. p. 70. Adaptada.
Figura 79
Figura 80
Figura 81
245
Figura 82
A) COOPER, G. M. The cell: a molecular approach. 8. ed. Oxford: Oxford University Press, 2019. p. 324. Adaptada.
B) COOPER, G. M. The cell: a molecular approach. 8. ed. Oxford: Oxford University Press, 2019. p. 326. Adaptada.
Figura 83
ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. p. 473.
Figura 84
Figura 85
Figura 86
WATSON, J. D. et al. DNA recombinante genes e genomas. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. p. 148.
Figura 87
Figura 90
Figura 91
Figura 92
Figura 93
Figura 94
246
Figura 95
VIDIC, J. et al. Point-of-Need DNA Testing for Detection of Foodborne Pathogenic Bacteria. Sensors,
v.19, n. 5, p. 18, 2019.
Figura 96
VIDIC, J. et al. Point-of-Need DNA Testing for Detection of Foodborne Pathogenic Bacteria. Sensors,
v.19, n. 5, p. 18, 2019.
Figura 101
STRACHAN, T.; READ, A. Human molecular genetics. 4. ed. Abingdon: Garland Science/Taylor & Francis
Group, 2011. p. 420. Adaptada.
Figura 104
CIOCCA, L. et al. Array-CGH characterization and genotype-phenotype analysis in a patient with a ring
chromosome 6. BMC Med Genomics, v. 6, n. 3, p. 3, 2013.
Figura 105
ASIF, M. et al. A novel four-way complex variant translocation involving chromosome

46,XY,t(4;9;19;22)(q25:q34;p13.3;q11.2) in a chronic myeloid leukemia patient. Front Oncol., v. 6, p.
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NUSSBAUM, R. et al. Livro de genética médica. 8. ed. São Paulo: Elsevier, 2016. p. 61. Adaptada.
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Figura 107
RT_PCR_MODEL.JPG/1024PX-RT_PCR_MODEL.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/thumb/e/e7/RT_PCR_Model.jpg/1024px-RT_PCR_Model.jpg. Acesso em: 28 abr. 2020.
Figura 111
TAQMAN_GX_CARTOON.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1e/

TaqMan_GX_cartoon.jpg. Acesso em: 28 abr. 2020. Adaptada.
247
Figura 113
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Sanger-sequencing.svg. Acesso em: 28 abr. 2020. Adaptada.
Figura 114
DNA_PATERNITY_TESTING_EN.SVG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/5/55/DNA_paternity_testing_en.svg. Acesso em: 28 abr. 2020.
Figura 115
HLA_MHC_COMPLEX_ILLUSTRATION.JPG. Disponível em: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/2/22/HLA_MHC_Complex_illustration.jpg. Acesso em: 28 abr. 2020.
Figura 116
NAMING.PNG. Disponível em: http://hla.alleles.org/inc/images/naming.png. Acesso em: 28 abr. 2020.

Adaptada.
Figura 118
SHELDON, S.; POULTON, K. HLA Typing and its influence on organ transplantation. Methods in
Molecular Biology, v. 333, p. 164, 2006. Adaptada.
Figura 120
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Figura 121
SALLES, S. Terapia inédita na América Latina devolve futuro a paciente com câncer terminal. Jornal
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Sites
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http://hla.alleles.org/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
258
www.magnomics.pt
www.sinbiesp-biomedicina.com.br
Exercícios
Unidade I – Questão 1: UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA (UFPA). UFPA 2016/2.
Unidade II – Questão 1: INSTITUTO NACIONAL DE ESTUDOS E PESQUISAS EDUCACIONAIS ANÍSIO

TEIXEIRA (INEP). Exame Nacional de Desempenho de Estudantes (Enade) 2011: Biologia. Questão 12.
Disponível em: http://download.inep.gov.br/educacao_superior/enade/provas/2011/BIOLOGIA.pdf.
Acesso em: 13 maio 2020.
Unidade II – Questão 2: INSTITUTO NACIONAL DE ESTUDOS E PESQUISAS EDUCACIONAIS ANÍSIO

TEIXEIRA (INEP). Exame Nacional de Desempenho de Estudantes (Enade) 2016: Biomedicina. Questão 25.
Disponível em: http://download.inep.gov.br/educacao_superior/enade/provas/2016/biomedicina.pdf.
Unidade III – Questão 1: INSTITUTO NACIONAL DE ESTUDOS E PESQUISAS EDUCACIONAIS ANÍSIO

TEIXEIRA (INEP). Exame Nacional de Desempenho de Estudantes (Enade) 2016: Biomedicina. Questão 13.
Disponível em: http://download.inep.gov.br/educacao_superior/enade/provas/2016/biomedicina.pdf.
Unidade III – Questão 2: FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE-EMPRESA DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS

(FUNDATEC). IGP-RS 2017: Perito Criminal. Questão 77. Disponível em: https://arquivos.qconcursos.
com/prova/arquivo_prova/55279/fundatec-2017-igp-rs-perito-criminal-biomedicina-farmacia-
biologia-prova.pdf?_ga=2.198097903.1330285760.1589473706-682056908.1589473706. Acesso em:
13 maio 2020.
259
260
Informações:
www.sepi.unip.br ou 0800 010 9000

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BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À BIOMEDICINA

7.1 Polimorfismos moleculares

• Locus (plural loci): posição ocupada por um segmento de DNA no cromossomo.

• Alelos: versões alternativas da sequência de DNA presente no locus.

• Mapeamento de genes em uma determinada região de um cromossomo.

• Tipagem de tecidos e órgãos para transplantes.

• Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas.

• Aplicações forenses, especificamente identificação de restos mortais de vítimas de crimes, testes

• Farmacogenômica, na qual o tratamento farmacológico é adaptado conforme o paciente carregue

• Descoberta de variantes que levem à predisposição de doenças.

Em geral os polimorfismos podem ser classificados em: polimorfismos nucleotídicos individuais e

Polimorfismo é uma variante cuja frequência de aparecimento nos

7.1.1 Polimorfismos nucleotídicos individuais

Os polimorfismos nucleotídicos individuais (SNPs, do inglês single nucleotide polymorphisms) são

Um banco de dados público de SNPs, chamado dbSNP, pode ser

Alguns polimorfismos são considerados fatores de risco para algumas

OTA, V. K. et al. PRODH polymorphisms, cortical volumes and thickness

7.1.2 Polimorfismos por inserção-deleção

Os microssatélites são segmentos de DNA de 1 a 10 nucleotídeos repetidos no genoma. A maior

Os microssatélites também podem ser denominados como polimorfismos de curtas repetições em

Quadro 12 – Principais diferenças entre SNP e STR

Características SNP STR

O biomédico com habilitação em genética pode realizar e analisar testes

Pai Mãe Criança

Os minissatélites são segmentos de DNA de 10 a 100 nucleotídeos repetidos centenas ou milhares de

7.1.3 Polimorfismos por número de cópias

7.1.4 Origem das mutações

As mutações podem ocorrer em células da linhagem germinativa e em células somáticas. Quando a

Os agentes químicos, principalmente os que liberam radicais livres,

O processo de replicação do DNA é altamente fidedigno, a maior parte

Quadro 13 – Exemplos de mutações e doenças genéticas

Mutação Definição Exemplo (Gene) Doença/condição

Adaptado de: Mahdieh et al. (2013).

• Transposons: elementos transponíveis presentes no genoma que têm a capacidade de mudar de

transcriptase reversa que permite a replicação desses elementos. Os retrotransposons foram

7.1.5 Polimorfismos moleculares e doenças

Para ter mais informações sobre mutações e doenças genéticas, leia:

NUSSBAUM, R. et al. Livro de genética médica. 8. ed. São Paulo:

7.2 Técnicas de detecção de mutações gênicas

Anteriormente, estudamos os principais tipos de mutações encontrados no nosso genoma. Agora

Cariótipo é o processo de parear e ordenar os cromossomos de um organismo. A preparação do

Figura 104 – Exemplo de cariótipo humano por bandeamento G

O preparo do cariótipo envolve uma série de etapas:

A conchicina é um alcaloide extraído de plantas do gênero Colchicum

Após a coloração, os cromossomos podem ser fotografados ou digitalizados e organizados

7.2.2 Hibridização in situ por fluorescência (Fish)

O método Fish consiste na hibridização de uma sonda marcada no cromossomo denaturado, na

Célula normal Célula de paciente com LLA

Você sabe o que é LLA? A LLA é o segundo mais frequente tipo de

TERWILLIGER, et al. Acute lymphoblastic leukemia: a comprehensive

7.2.3 Hibridização genômica comparativa (CGH)

A técnica de hibridização genômica comparativa (CGH, do inglês comparative genomic

Figura 106 – Exemplo de microarranjos de CGH

7.2.4 Polymerase chain reaction (PCR) e suas variantes

• Extensão/polimerização: normalmente a extensão ocorre por volta de 72 °C e nessa etapa

A PCR foi descoberta em 1983 por Kary Mullis. A técnica é baseada na

Figura 107 – Exemplo de termociclador

Outras enzimas também podem ser utilizadas na reação de PCR,

Camundongos nocautes são animais em que um ou mais genes foram

GENETICS HOME REFERENCE. Mucopolysaccharidosis type I. 2012.

KNOCKOUT Mouse Models. Genoway, [s.d.]. Disponível em: https://www.

A PCR em tempo real é utilizada no monitoramento da evolução

Esse exame é realizado pelo setor de biologia molecular em laboratórios

Os principais tipos de reagentes empregados em qPCR são: