Relatório De Aulas Práticas

Biologia Molecular e Forense

Aula prática 04 – Enzimas de Restrição em Bacteriófago

Lambda (λ) e Mapas de Restrição

Data: 06/04/2022

Nicoli Yumi Alves dos Santos

Profª. Drª. Ana Beatriz Goes Fernandes Monteiro

Biomedicina – 1º Semestre 2022
● Introdução
Enzimas de restrição é uma técnica desenvolvida pelos pesquisadores Daniel Nathans,
Werner Arber e Hamilton Smith (1978) na qual, foi esclarecida os mecanismos e função
dessas enzimas. Conhecidas também como “tesoura molecular”, técnica desenvolvida
através de bacteriófagos, onde faz-se corte em moléculas de DNA, quando ao encontrar
sequencias de pares de bases nitrogenadas, em que a fita 3’5’ deve ser palindrômica com a
5’3’, se obtém o corte, conhecida como sítios de ligação.
Nesses cortes, se tem como o mais conhecido e feito o “corte coesivo” na qual faz se que
tenhas extremidades, corte feito em zigue zague, pois com a ligação através da proteína
DNAligase, tem -se a junção da molécula de DNA novamente (CARDOSO).

● Objetivo
Demonstrar como se produz uma reação de restrição em DNA de fago λ, comparando
endonucleases que reconhecem sequências de 4 pb (corte frequente) e sequências de 6 pb
(corte raro). Avaliar como é possível, a partir dos resultados obtidos, construir um mapa
de restrição. Discutir a importância e as possíveis aplicações das enzimas de restrição.

● Materiais e Métodos
Materiais
● Amostras de DNA de fago λ (48.502 pb);
● Enzimas de restrição de corte frequente (Ex: HaeIII) e corte raro (Ex: EcoRI ou BamHI);
● Tampão específico para restrição (adquirido com as enzimas de restrição);
● Agarose;
● Tampão TAE (Tris 0,02M pH 8,0; EDTA 0,01M; 0,11% ácido acético) para eletroforese;
● Corante (azul de bromofenol e brometo de etídio) para eletroforese;
● Bandeja e pentes para o preparo de minigel de eletroforese;
● Cuba e fonte de eletroforese e transiluminador UV (para visualizar o DNA);
● Banho-maria para a restrição enzimática;
● Becker com solução de hipoclorito a 1% para descarte de ponteiras e microtubos;
● Microtubos de 0,5 mL, micropipetas, ponteiras de 1-10 e de 20-20 μL e água
destilada;
● Uma cópia do Quadro para simulação dos cortes e da eletroforese dos fragmentos de
restrição, disponível nos Apêndices, para cada grupo de estudantes.
Métodos
1. Preparar as reações de restrição, de acordo com a Tabela 1, em volumes de 10 μL,
utilizando um microtubo de 0,5 mL;
2. Incubar as reações a 37º C de 20 minutos até 1 hora;
3. Se forem usadas duas enzimas de restrição, identificar os microtubos;
4. Observe que as enzimas de restrição são instáveis e devem ser mantidas
sempre em recipiente com gelo;
5. Acrescentar os reagentes em cada microtubo, conforme descrito na Tabela
1, tendo sempre o cuidado de trocar a ponteira a cada substância adicionada;
6. Fechar os microtubos e misturar suavemente os reagentes;
7. Incubar as amostras em banho-maria de 20 minutos até 1 hora a 37º C;
8. Enquanto se espera a reação de restrição, preparar um mini gel de agarose a 1%,
dissolvendo 1 g de agarose em 100 mL de tampão TAE para eletroforese;
9. Aquecer a solução de agarose até a fervura e deixar em ebulição por 20 segundos;
10. Deixar a solução esfriar até atingir ± 60º C;
11. Acrescentar três gotas de brometo de etídio (cuidado, a manipulação desta substância
precisa ser realizada em capela; deve-se usar luvas, jaleco e outros materiais de proteção;
não realizar essa tarefa sem o auxílio do professor) e despejá-la em bandeja apropriada
para eletroforese;
12. Quando o gel estiver sólido, mergulhá-lo na cuba de eletroforese contendo tampão
TAE;
13. Após completar a digestão enzimática, adicionar 3 μL do corante azul de bromofenol
em cada reação de restrição e carregar no gel, obedecendo a sequência da Tabela 1;
14. Ligar a fonte de eletroforese, regulando a voltagem para ± 80 volts por 30 min;
15. Visualizar os produtos de digestão em transiluminador UV e fotografar;
16. Analisar os resultados.
● Resultados

● Discussão
As enzimas de restrição feitas em aula prática foram as HaeIII, BamHI e S/R ( sem
enzima); todos foram postos DNA de fago λ em 48.502 pb. A HaeIII faz-se cortes
frequentes de 4pb a cada 256pb pulados, nesta prática, ao se fazer a eletroforese pode ser
visto 8 bandas por fazer cortes pequenos; a BamHI faz-se cortes raros de 6pb a cada
4.096pb, nele se encontra 4 bandas, tem se cortes grandes; fazem cortes quando tem o
reconhecimento da sequência, já a S/R por não conter enzimas o DNA fica integro, sem
sofrer bandas, com grande visualização. Obtendo como componente em todas as amostras
feita o H2O como forma de controle de qualidade (FONSECA).

● Conclusão
Conclui a atividade proposta em aula prática com a o entendimento das enzimas de
restrição, os tipos de cortes e como foi feita sua produção em aula, obtendo sucesso
com resultados apresentados.

● Bibliografia

Bibliografia
Cardoso, M. (2004). Enzimas de Restrição. InfoEscola.

Ribeiro, K. D. (s.d.). Enzimas de Restrição. UOL.