UENF LBT/CBB

Uni versi dade Estadual do Norte Flumi nense Darcy Ri beiro Laboratório de Biotecnologia

Fundamentos da Extração de
Ácidos Nucléicos
(PRÁTICA 1 – Biologia Molecular)

Coordenador: Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho

Colaboradores: Luciano de Souza Vespoli
Patrícia Louzada Rangel
Suzane Ariádina de Souza
INTRODUÇÃO

Todos os cromossomos são formados de DNA, ou podemos dizer que o

cromossomo nada mais é do que uma longa fita dupla de DNA contendo proteínas, toda
enovelada e dobrada sobre si mesma, de várias formas, até atingir o aspecto de
cromossomo. Dizer que um cromossomo é feito de DNA é o mesmo que dizer que um
novelo é feito de linha. Do ponto de vista estrutural, o DNA se apresenta como uma
dupla fita dobrada em forma de hélice. As duas fitas são antiparalelas, ou seja, estão
dispostas em direções opostas. O que define a direção de cada uma das fitas é o local de
ligação entre o grupo fosfato com o anel de desoxirribose. Todas as informações
relativas à construção e ao funcionamento de nosso organismo estão embutidas em
nosso DNA.

O que faz com que tenhamos diferentes características (ou seja, por que somos
diferentes um do outro?) está no fato de termos diferentes formas de um mesmo gene, o
que é o mesmo que dizer que possuímos diferentes alelos. Pense, por exemplo, na cor
amarela. Há diferentes tons de amarelo: amarelo claro, amarelo ouro, amarelo escuro.
Todos são similares o suficiente para serem amarelos, mas são, no entanto, diferentes. O
mesmo raciocínio pode ser feito para os alelos. Todos nós temos os mesmos genes
característicos da espécie humana. Por exemplo, todos nós temos o gene amarelo, mas
isso não significa que meu amarelo é o mesmo q ue o seu. Deste modo, temos alelos
diferentes e o que faz sermos quem somos é a combinação entre todos os nossos alelos

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(genótipo) somado as influências do ambiente a nossa volta (que em conjunto determina
o fenótipo). O que difere um alelo do outro é a seqüência de DNA.
É importante observar que o DNA de um indivíduo é o mesmo em todas as
células do corpo. O que faz com que as células presentes no olho sejam diferentes de
neurônios, por exemplo, são os genes que estão ativos em cada um desses dois tipos
celulares. Dependendo do tipo celular, diferentes grupos de genes estão ativos e
produzindo determinadas proteínas, enquanto outros genes estão desligados.
Cada indivíduo possui uma combinação alélica diferente, exceção para os
gêmeos monozigóticos (gêmeos iguais) e para os organismos gerados através do
processo de clonagem. Imagine agora a quantidade de informação necessária para
formar um ser humano, por exemplo. Pois toda essa informação está armazenada no
núcleo das células. Tanta informação assim, para caber dentro do núcleo de cada célula,
deve estar arrumada de uma forma super compactada.
Nesta aula teremos a chance de ver que cara tem o DNA e de entender melhor
sua composição, estrutura e funcionamento. Iremos também entender que o DNA é uma
molécula universal, presente em todos os organismos vivos.
Durante a extração do DNA seguiremos fundamentalmente as seguintes etapas:
a) ruptura das células para liberação dos núcleos (lise); b) desmembramento dos
cromossomos em seus componentes básicos (desnaturação); c) separação do DNA dos
demais componentes celulares (purificação ou extração propriamente dita).
O tampão utilizado na extração contém detergente, cuja função é desintegrar os
núcleos e os cromossomos das células vegetais, liberando o DNA. Um dos componentes
do detergente, o SDS (dodecil sulfato de sódio) desnatura as proteínas, separando-as do
DNA cromossômico. A centrifugação é utilizada para separar as macromoléculas que
são desnaturadas pela ação do detergente, além dos tecidos vegetais, do DNA que se
mantém solúvel na fase aquosa. O álcool gelado, em ambiente salino, faz com que as
moléculas de DNA se aglutinem, formando uma massa filamentosa e esbranquiçada.

Cuidados a serem conside rados na manipulação de ácidos nucléicos:

 Cuidados comparáveis aos utilizados no trabalho com patógenos. A única diferença é
que no trabalho de pesquisa ou diagnóstico utilizando técnicas de biologia molecular o
risco é a contaminação do DNA (amostra) e não do operador (pesquisador).
 Ambiente limpo, “DNA- free”.
 Sempre usar luvas.
 Material livre de DNases e RNases (microtubos, ponteiras).
 Reagentes e buffers - usar sempre uma alíquota nova (fracionar os reagentes).

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 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 1
Extração de DNA

OBJETIVO: A extração de ácidos nucléicos (DNA e/ou RNA) geralmente é a primeira

de várias etapas para o estudo da biologia molecular de qualquer organismo. Nesta aula,
realizaremos a extração de DNA de folhas da planta modelo Arabidopsis thaliana.

MATERIAL E MÉTODOS:

MATERIAL
- Almofariz, pistilo, espátula, microtubos, ponteiras, pipetas, centrífuga
- Tecido vegetal
- Nitrogênio líquido
- Reagente Plant DNAzol
- Clorofórmio
- Etanol absoluto 100%
- Etanol 70 %
- Tampão TE RNAse (Tris-HCl p H8,0 100 mM , EDTA pH 8,0 10 mM , RNAse 20 µg/ mL)

MÉTODOLOGIA
- Macerar 0,1 g tecido vegetal em nitrogênio líquido até obter pó fino.
- Esperar que o nitrogênio evapore e transferir o macerado para um microtubo de 1,5
mL, previamente mantido no nitrogênio.
- Acrescentar 300 µL de Plant DNAzol. Agitar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Acrescentar 300 µL de clorofórmio. Agitar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Centrifugar durante 10 minutos a 10000 rpm.
- Transferir a fase aquosa para outro tubo.
- Precipitar o DNA pela adição de 2,5 volumes (aproximadamente 300 µL) de etanol
100%. Misturar por inversão.
- Incubar durante 5 minutos em temperatura ambiente.
- Centrifugar durante 4 minutos a 12000 rpm.
- Descartar o sobrenadante.
- Lavar o precipitado com 300 µL de etanol 70 % gelado.
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- Centrifugar durante 4 minutos a 10000 rpm.
- Descartar o sobrenadante.
- Secar o precipitado (pellet) e ressuspender em 50 µL de TE RNAse.
- Incubar a amostra a 37 ºC por 1 hora.
- Armazenar em freezer -20 °C.

INFORMAÇÕES ADICIONAIS SOBRE REAGENTES E

METODOLOGIAS COMUMENTE UTILIZADOS EM MÉTODOS
EXPERIMENTAIS PARA A MANIPULAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Solução de lise (NaOH - Hidróxido de Sódio e SDS – Dodecil Sulfato de
Sódio): saponificação de lipídeos e rompimento da parede bacteriana pela solubilização
da bicamada lipídica. O pH elevado do Tris-HCl inibe a ação das DNAses.
EDTA (Ácido Etilenodiaminotetracético): inibe a atividade de
desoxirribonucleases (DNases) pois atua como agente quelante de íons essenciais para a
atividade destas enzimas (Mg2+)
SDS (Dodecil Sulfato de Sódio): é um detergente aniônico que solubiliza
lipídeos. É um desnaturante de proteínas e também rompe ligações não-covalentes inter-
subunidades de proteínas oligoméricas. Também é utilizado para se certificar que
nenhuma nuclease que não depende de Mg2+ cause qualquer degradação no DNA.
NaCl (Cloreto de Sódio): íons no meio aquoso podem romper ligações iônicas
de cadeias polipeptídicas. Também auxiliam na dissociação das proteínas ligadas aos
ácidos nucléicos.
Solventes orgânicos: aqueles que têm uma porção hidrofóbica (lipofílica) e uma
porção polar são agentes de precipitação de macromoléculas. Os grupos polares
interagem com grupos polares protéicos em competição com moléculas de água. Os
grupos hidrofóbicos podem romper interações intramoleculares estabilizantes da
estrutura da proteína. Um volume elevado de solvente orgânico reduz a concentração
efetiva da água, deixando menos moléculas de água para hidratação da proteína. Isto é,
modificam a camada de solvatação das proteínas.
Fenol-clorofórmio: contaminantes protéicos são desnaturados e há partição das
mesmas na fase orgânica ou interface entre as fases orgânica e aquosa, enquanto que
ácidos nucléicos permanecem na fase aquosa. A utilização de fenol-clorofórmio é mais
eficiente do que a utilização de somente um deles. Lipídeos, grandes polissacarídeos e
proteínas complexadas ao SDS permanecem na fase fenólica.
Álcool isoamílico: reduz a formação de espuma e ajuda a separação e a
manutenção da estabilidade das camadas orgânica e aquosa após a separação por
centrifugação.

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 Etanol: É utilizado para precipitar ácidos nucléicos com mais do que 15
nucleotídeos. Sais e outros solutos tais como fenol e clorofórmio ficam em solução
enquanto que ácidos nucléicos formam um precipitado branco que pode ser coletado por
centrifugação.
Tampões contendo > 1mM fosfato ou > 10mM EDTA não devem ser utilizados
para precipitação com etanol, pois estas substâncias co-precipitam com os ácidos
nucléicos.
Acetato de sódio: utilizado para a precipitação de DNA e RNA. É mais solúvel
em etanol do que NaCl.