CENTRO UNIVERSITÁRIO DA AMAZÔNIA – UNAMA

CURSO DE BACHARELADO EM BIOMEDICINA – 5º SEMESTRE

DISCIPLINA: GENÉTICA FORENSE E PERÍCIA CRIMINAL

Santarém-PA, 04 de Março de 2024

Aula 3 – DNA:
Conceitos, Tipos
e Métodos de
Extração
Docente: Me. Antônio Júnior

Santarém-PA, 04 de Março de 2024

 DNA e Genética Forense
Os exames de DNA utilizados para identificação
humana se baseiam na comparação de amostras
coletadas de restos mortais não identificados ou de
pessoas de identidade desconhecida com amostras-
referência de pessoas desaparecidas e de familiares.

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 DNA – O que é essa molécula?
"O DNA (ácido desoxirribonucleico) é um tipo de ácido nucleico que possui destaque por
armazenar a informação genética da grande maioria dos seres vivos. Essa molécula é formada
por nucleotídeos e apresenta, geralmente, a forma de uma dupla-hélice. Nos organismos
eucarióticos, o DNA é encontrado no núcleo da célula, nas mitocôndrias e nos cloroplastos.

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DNA – Onde está essa molécula?

Nos organismos eucarióticos, o

DNA é encontrado no núcleo da
célula, nas mitocôndrias e nos
cloroplastos. Nos procariontes,
o DNA está localizado em uma
região que não é delimitada por
membrana, denominada de
nucleoide.

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Etapas da Genética Forense

GENOTIPAGEM E SEQUENCIAMENTO

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 Como extrair o DNA?
A extração de DNA inclui
basicamente dois
procedimentos principais: Lise das Células
a lise das células presentes
na amostra e a purificação
do DNA. Após a lise das Lise dos Núcleos
células, o DNA deve ser
separado dos restos
celulares e das proteínas, Precipitação das Proteínas
precipitado e suspenso em
volume adequado de água
ultrapura ou soluções-
Precipitação do DNA
tampão adequadas.
Hidratação do DNA 7
 Como extrair o DNA?
A extração e a purificação de ácidos nucléicos a partir de diversas amostras experimentais
(bactérias, fungos, tecidos vegetais e tecidos animais) é uma etapa fundamental para se obter alta
eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em cadeia da polimerase (PCR).

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 Obtenção de amostras para extração de DNA
As amostras perecíveis como sangue e tecidos devem ser acondicionadas de forma adequada, de
preferência refrigeradas até o momento de serem submetidas à extração do DNA.

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 Obtenção de amostras para extração de DNA
Para melhor conservação, as
amostras devem ser mantidas em
temperatura de –20°C a –80°C,
dependendo do tempo de
armazenamento.

Para utilização de amostras conservadas em

estoque, é interessante o fracionamento em
pequenas alíquotas, para que o material não sofra
descongelamentos sucessivos, que poderiam
contribuir para a oxidação do tecido e para a
degradação do DNA.

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 Obtenção de amostras para extração de DNA
O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que
uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados por nucleases, enzimas que
normalmente estão presentes nos fluidos corporais liberados principalmente nas mãos das
pessoas.

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 Cuidados antes e depois da extração de DNA
Com a finalidade de se obter amostras de DNA
adequadas aos protocolos de amplificação, é
importante que exista uma sala exclusiva para
esse fim.

O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro e

pode ser adsorvido na presença de alguns sais; por
isso, esse material não deve ser empregado
durante o processo de extração.

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 Cuidados antes e depois da extração de DNA
Todo o material plástico (polipropileno) utilizado
deve ser esterilizado e novo (não deve ser usado
material reciclado), para que as amostras apresentem
boa qualidade e para que se diminuam os riscos de
contaminação entre amostras no momento da análise.

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 Material necessário para extração de DNA
Para executar os protocolos de extração de DNA, é necessário que o laboratório tenha os
equipamentos básicos, o material plástico e todas as soluções utilizadas nos procedimentos.

Capelas de Banho-maria com termostato ou

Centrífuga com Exaustão com termômetro
rotor para vários
tipos de tubos
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 Material necessário para extração de DNA

Vidraria para preparo das amostras

Micropipetas automáticas

Microtubos de
Gelo e nitrogênio líquido, polipropileno
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Extração de DNA de tecidos de Mamíferos

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 Extração de DNA de tecidos de Mamíferos
➢ Digestão da amostra
As amostras de tecidos de origem animal ou vegetal que serão submetidas à extração de DNA devem sofrer
fragmentação e digestão enzimática das proteínas. Para produzir a fragmentação, as amostras podem ser
cortadas, submetidas a congelamento em nitrogênio líquido e rapidamente pulverizadas por processo manual
(utilizando um bastão) ou mecânico (utilizando equipamentos para esse fim).

Quantidades da amostra (entre 200 mg e 1 g) são

adicionadas a uma solução-tampão de digestão (na
proporção de 1,2 mL de tampão para cada 100 mg de
tecido) e colocadas em banho-maria em temperatura
próxima a 50°C, para que ocorra a digestão. O tempo
de incubação pode variar entre oito e dezesseis horas,
ou até que a amostra se apresente totalmente digerida,
ou seja, apresente aspecto viscoso.

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 Extração de DNA de tecidos de Mamíferos
➢ Extração do DNA com fenol
O método mais utilizado para purificação do DNA é a extração com fenol tamponado, que provoca a
desnaturação das proteínas de maneira eficiente. O clorofórmio também é usado como agente desnaturante das
proteínas contidas na amostra. A mistura de fenol e de clorofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua
ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos.

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 Extração de DNA de tecidos de Mamíferos
➢ Purificação do DNA por meio de precipitação com etanol
A precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma solução com alta
concentração de um sal catiônico. O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se
agregarem, com conseqüente precipitação. A precipitação com etanol absoluto, além de concentrar o DNA,
ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra.

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 Extração de DNA de amostras de sangue
O sangue é composto de plasma e de células. O plasma é constituído, em sua maioria, de água e
proteínas. As células do sangue são: os glóbulos vermelhos (eritrócitos ou hemácias), os
glóbulos brancos (leucócitos) e as plaquetas.

As hemácias medem cerca de 7,5 am de

diâmetro, 2,6 am de espessura e não
possuem núcleo nem DNA, portanto
ausentes de material genético.

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 Extração de DNA de amostras de sangue
➢ Centrifugação para separação dos glóbulos brancos

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 Extração de DNA de amostras de sangue
➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais

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 Extração de DNA de amostras de sangue
➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais

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 Extração de DNA de amostras de sangue
➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais

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 Extração de DNA de amostras de sangue
➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais
➢ Solução de precipitação de proteínas

A Proteinase K é uma serino-protease de elevada

atividade enzimática, isolada do fungo Tritirachium album.
Apresenta um tamanho molecular de 28,904 KDa.
Apresenta atividade de clivagem específica em proteínas
nativas ou desnaturadas, sendo largamente utilizada na
purificação de DNA e RNA.

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 Extração de DNA de amostras de saliva e sêmen
➢ Os Kits de extração comercial se aplicam também para amostras de saliva e
sangue.

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Extração de DNA de amostras de saliva

https://www.youtube.com/watch?v=Un2C6iTSrgk

27
Extração de DNA de amostras de saliva

https://eaulas.usp.br/portal/video?idItem=5253

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Referências Bibliográficas

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Atenção para a
FREQUÊNCIA

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 Atividade 2 – Estudo Dirigido/Pesquisa Temática
1ª - Descreva todos os aspectos básicos do DNA: função, localização, estrutura e composição.
2ª - Quais as etapas básicas para extração do DNA? Descreva o que acontece em cada uma delas.
3ª - Quais cuidados devem ser adotados com uma amostra que servirá para extração de DNA?
Como as amostras devem ser armazenadas?
4ª - Porque os tubos de armazenamento não podem ser de vidros? Justifique sua resposta.
5ª - Descreva as etapas para extração de DNA de tecidos de mamíferos.
6ª - Descreva as etapas para extração de DNA de sangue.
7ª - Qual a importância e função da enzima proteinase K?
8ª - Descreva como funciona a extração de DNA, utilizando um kit comercial.

A atividade deverá ser entregue no dia 01/04/2024

OBS: FAÇA NO CADERNO E ENTREGUE EM SALA DE AULA!

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OBRIGADO