Coleta, extração

e análise de DNA
genômico
 Coleta de materiais biológicos para extração de DNA
Tipos de amostras:
I. Pele;
II. Sangue;
III. Saliva;
IV. Músculo;
V. Osso;
VI. Folhas;
VII. Caules;
VIII. Raízes;
IX. Flores;
X. Frutos
XI. Etc.

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 Plantas
 Amostra de Referência para documentação/arquivamento: utilizada
para análises morfológicas e taxonômicas – objetivo: permitir a
identificação da planta;

 Uso da amostra arquivada para extração de DNA

I. A secagem natural é o método preferível para se obter altas

concentrações de DNA caso surja a necessidade da análise de DNA no
futuro;
II. Recomenda-se que seja feita uma subamostragem se a análise de DNA
for um objetivo certo.

Funk, V.A. et al. Guidelines for collecting vouchers and tissues intended for genomic work (Smithsonian Institution): Botany Best Practices, 2017. Disponível em:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5345056/

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 Métodos de coleta e armazenamento para fins de extração de DNA

I. Método sílica-gel;

II. Nitrogênio líquido;

III. Cartões FTA;

IV. Etanol

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 Método SÍLICA EM GEL
 Após ser coletado em embalagem adequada, o espécime é colocado em
contato com a sílica que tem uma função dessecante.

 Embalagens permeáveis para que a secagem seja facilitada;

I. Permeáveis para que a secagem seja facilitada

II. Saco para chá

III. Filtro de papel para café

 Quantidade coletada deve ser de 10 a 25cm2
IV. Envelope para moedas branco  Evitar o excesso e acúmulo em camadas, pois dificulta a secagem
 Folhas espessas e/ou oleosas devem ser cortadas em pedaços
pequenos (2cm diâmetro)

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 Wilkie, A.D., & Forrest, L.L. (2013). The collection and storage of plant material for DNA extraction: The Teabag Method. The Gardens' Bulletin, Singapore, 65, 231-234.

Vídeo recomendado: Collecting plant material in silica gel: The teabag method. https://vimeo.com/195812974

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 Método nitrogênio líquido
 As amostras são coletadas em tubo criogênico
de 1,8mL com etiqueta e embalado em papel
alumínio;
 Posteriormente são armazenadas tanque
adequado para nitrogênio líquido.

Funk, V.A. et al. Guidelines for collecting vouchers and tissues intended for genomic work
(Smithsonian Institution): Botany Best Practices, 2017. Disponível em:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5345056/

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 Etanol

 Pode ser utilizado para a coleta de amostras de

plantas, contudo recomenda-se o método sílica ou
nitrogênio para fins de extração de DNA;

 Estudos indicam elevada quantidade de DNA

recuperada mas em baixa qualidade

Funk, V.A. et al. Guidelines for collecting vouchers and tissues intended for genomic work
(Smithsonian Institution): Botany Best Practices, 2017. Disponível em:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5345056/

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 Cartões FTA
 O material coletado é transferido para uma
matriz tratada do papel de filtro FTA.
 Secagem natural por 1 hora
 Armazenamento por longos períodos – ambiente
com temperatura e umidade controlados.

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 Peixes

I. Tecido cardíaco;

II. Recorte de barbatana;

III. Suabe de pele;

IV. Sangue;

V. Tecido muscular

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 Peixes
Métodos para preservação do tecido coletado:
I. Congelamento à -20ºC;
II. Armazenamento em solução de etanol ou outra de conservação;
III. Secagem

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 Aves
Penas
Tecidos/FTA

Swabe/FTA
Sangue

Casca de ovo

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 Mamíferos
I. Ossos/dentes;
II. Saliva;
III. Sangue;
IV. Sêmen;
V. Cabelos/pelos;
VI. Impressão digital

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 Extração de DNA
É a etapa que antecede a maioria das metodologias em biologia molecular.
As principais etapas de um processo de extração de material genômico incluem:
I. Rompimento da parede celular (amostras vegetais). Ex: moagem
II. Lise da membrana
III. Remoção das proteínas e contaminantes celulares
IV. Precipitação/ recuperação do DNA

Obs: na maioria das vezes as etapas I e II

ocorrem simultaneamente

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 Lise celular e rompimento da membrana plasmática
I. Métodos físicos (ultrassom, choque térmico, trituragem);
II. Métodos químicos (sais caotrópicos, enzimas e/ou detergentes num
tampão de lise; choque osmótico);
III. Métodos enzimáticos (ex: proteinase k)
IV. Combinação de métodos

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 Remoção das proteínas e contaminantes celulares

 Adição de uma protease para

desnaturação das proteínas (ex: proteinase
k);
 Precipitação por acetato de sódio ou de
amônio;
 Fenol/clorofórmio
 Fenol: Remove proteínas e outros
contaminantes da solução aquosa do DNA;
 Clorofórmio: Ajuda a desnaturar proteínas
e a remover o fenol residual;

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 Recuperação do DNA
 Ocorre através da precipitação do DNA em etanol
frio ou isopropanol, uma vez que o dna é insolúvel
em solução alcoólica;
 Quanto mais gelado o etanol, menos solúvel o
DNA;
 Retira-se o álcool para a formação do pellet;
 Em seguida o DNA é ressuspenso em um tampão
(H2O ultra-pura ou TE) para garantir a estabilidade
e armazenamento à longo prazo (-20ºC);
 Obs: Esse tampão deve ser livre de contaminantes e
enzimas capazes de destruir o DNA (DNASE-free);

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 Fenol-clorofórmio
 As células são lisadas usando um detergente e então misturadas com fenol-clorofórmio -álcool
isoamílico.
 O DNA é recuperado da fase aquosa, geralmente por precipitação alcóolica.

 Desvantagens:
 Uso de compostos tóxicos e geração de lixo tóxico;
 O DNA isolado pode conter resíduos de fenol/clorofórmio, os quais podem inibir reações
enzimáticas posteriores;

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 Métodos sílica-based
 Baseados na adsorção seletiva dos ácidos nucléicos a uma coluna de sílica na
presença de altas concentrações de sais caotrópicos.
 Somente o DNA é adsorvido; os demais contaminantes permanecem em
solução e são “lavados”da coluna;
 O DNA é eluído da coluna de sílica a partir de um tampão com baixa
concentração de sal ou água;

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 Método Salting-out
 Proteínas e outros contaminantes são precipitados partir do lisado celular
usando altas concentrações de sais
 Os precipitados são removidos por centrifugação e o DNA é recuperado por
precipitação alcóolica.

 Desvantagens:
1) A remoção das proteínas e outros contaminantes pode ser ineficiente;
2) O rendimento e a pureza do DNA são altamente variáveis usando este
método

20 06/02/2024
 Análise do DNA genômico

 Determinação da concentração e da pureza do DNA extraído;

 Além de precisarmos de uma boa concentração de DNA, necessitamos que

este DNA esteja em boa qualidade;

 E como aferimos esses parâmetros?

 Análise qualitativa x análise quantitativa

21 06/02/2024
 Análise qualitativa
• Gel de agarose

22 06/02/2024
 Análise quantitativa - espectofotometria
• Identifica a concentração e a pureza do DNA extraído;
• A quantificação de DNA por espectrofotometria é realizada por medição da
quantidade de luz absorvida pelo DNA em solução no comprimento de onda de 260
nm. Quanto maior for a absorção de luz nesse comprimento de onda, maior a
concentração de DNA na solução.

Possíveis contaminantes:
proteínas, compostos orgânicos,
etc.

23 06/02/2024
24 06/02/2024
 Análise quantitativa - fluorimetria
 Uso de fluoróforos que se ligam especificamente
ao DNA;
 Mais preciso do que a espectrofotometria;
 Detecção: 10 pg/µL a 100 ng/µL

 Curva de calibração
Standard #1
Standard #2

25 06/02/2024
 Análise quantitativa – PCR em tempo real
• Quantificação após cada ciclo de amplificação
• Fluorescência: Sybr Green – intercalante de DNA / TaqMan probes – sequência
específica.

26
 REFERÊNCIAS
https://gendika.com/information-about-genetic-research-in-birds/?lang=en
https://www.animalgenetics.eu/Avian/DNA_Sexing/DNA_Sexing_Eggshell.asp
Maia, T.A. et al. DNA sampling from eggshells and microsatellite genotyping in rare tropical birds: Case study on Brazilian
Merganser. Animal Genetics • Genet. Mol. Biol. 40 (4) • 2017. https://doi.org/10.1590/1678-4685-GMB-2016-0297. Disponível
em: https://www.scielo.br/j/gmb/a/mdZV4Fbkq5brJnHRT3tPsCr/?lang=en

MANUAL DE COLHEITA DE AMOSTRAS E EXAMES PARA DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO LABORATORIAL (2013).

Collecting plant material in silica gel: The teabag method (SYNTHESYS, RBGE 2017). Disponível em:
https://vimeo.com/195812974

Till B.J., Jankowicz-Cieslak J., Huynh O.A., Beshir M.M., Laport R.G., Hofinger B.J. (2015) Sample Collection and Storage. In:
Low-Cost Methods for Molecular Characterization of Mutant Plants. Springer, Cham.
https://doi.org/10.1007/978-3-319-16259-1_3
Disponível em: https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-16259-1_3

Funk, V.A. et al. Guidelines for collecting vouchers and tissues intended for genomic work (Smithsonian Institution): Botany
Best Practices, 2017. Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5345056/

Celestine Uzoma Aguoru, Lucky O. Omoigui, Joseph Olalekan Olasan (2015) Comparative Optimized Protocols of DNA
Extraction and Purification Using FTA PlantSaver Card and DNAzol Methods for Eggplant (Solanum Species) Studies in
North Central Nigeria. Open Access Library Journal,02,1-5. doi: 10.4236/oalib.1101406

27
 REFERÊNCIAS
Collecting plant material in silica gel: The teabag method (SYNTHESYS, RBGE 2017). Disponível
em: https://vimeo.com/195812974

Till B.J., Jankowicz-Cieslak J., Huynh O.A., Beshir M.M., Laport R.G., Hofinger B.J. (2015) Sample
Collection and Storage. In: Low-Cost Methods for Molecular Characterization of Mutant Plants.
Springer, Cham. https://doi.org/10.1007/978-3-319-16259-1_3
Disponível em: https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-16259-1_3

Funk, V.A. et al. Guidelines for collecting vouchers and tissues intended for genomic work
(Smithsonian Institution): Botany Best Practices, 2017. Disponível em:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5345056/

Celestine Uzoma Aguoru, Lucky O. Omoigui, Joseph Olalekan Olasan (2015) Comparative
Optimized Protocols of DNA Extraction and Purification Using FTA PlantSaver Card and DNAzol
Methods for Eggplant (Solanum Species) Studies in North Central Nigeria. Open Access Library
Journal,02,1-5. doi: 10.4236/oalib.1101406

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 REFERÊNCIAS
Tilley, C.A., Carreño Gutierrez, H., Sebire, M. et al. Skin swabbing is a refined technique to collect DNA
from model fish species. Sci Rep 10, 18212 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-75304-1.
Disponível em: chrome-extension://dagcmkpagjlhakfdhnbomgmjdpkdklff/enhanced-reader.html?
openApp&pdf=https%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Farticles%2Fs41598-020-75304-1.pdf

Oosting, T. et al. DNA degradation in fish: Practical solutions and guidelines to improve DNA
preservation for genomic research. (2020) https://doi.org/10.1002/ece3.6558. Disponível em:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ece3.6558

Lawrence, M.J. et al. Best practices for non-lethal blood sampling of fish via the caudal vasculature.
(2020) https://doi.org/10.1111/jfb.14339. Disponível em:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jfb.14339

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8359303

https://npafc.org/sampling-for-dna-3/

https://genidaqs.com/wp-content/uploads/2019/12/Genetic_tissue_collection_protocol_with-Finclip-an
d-Biopsy_2016_confirmGVL.pdf
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