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FKH?<?97w°E:;:D7;HD70

a arte de manipular
ácidos nucleicos
Olá! Seja bem-vindo
ao Clube do DNA.

Eu sou o Eduardo Castan e o caderno de hoje é

sobre um tema que é determinante no sucesso de
qualquer experimento ou teste que envolva biologia
molecular:

A extração e a purificação de DNA e RNA.

Domine a arte de manipular ácidos nucleicos e

terá metade de seu caminho percorrido.

Espero que goste. Bora!

 Até este momento nós já falamos sobre
algumas das diversas técnicas de biologia
molecular. Falamos sobre como estas técnicas têm
a capacidade de traduzir a informação biológica
contida no DNA ou no RNA em informação digital.

No entanto, ainda não falamos sobre os

procedimentos que nos permitem retirar os
ácidos nucleicos de dentro das células, isolá-los
e prepará-los para serem analisados de forma
adequada por qualquer uma das técnicas de
biologia molecular.

Este caderno é sobre isso. Sobre o que acontece

com o DNA e/ou o RNA entre a coleta da amostra
até a sua análise.
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ʦʨ ˆ˂ʵ˅ʸ˂ʴˈˇ˂˅
<EDJ;:;
:D7;HD7
 Vamos começar falando sobre as fontes
dos diferentes ácidos nucleicos e sobre as
considerações para obtenção de DNA que são
diferentes das considerações para obtenção de
RNA.

São diferentes por um motivo, basicamente.

O DNA está presente em praticamente todas

as células dos organismos. Já a presença de RNA
pode estar limitada a: células, tecidos, condições
fisiológicas, fase de desenvolvimento, condições
ambientais.
<EDJ;:;:D7
A obtenção de DNA é algo bastante simples.
Principalmente porque o DNA está presente em
todos os lugares.

Salvo algumas exceções, todas as células de

todos os organismos carregam pelo menos uma
cópia de seu genoma. Ou seja, onde há células, há
DNA.

Se, por exemplo, um pesquisador tivesse como

objetivo analisar SNPs de humanos, ele poderia
coletar células a partir de qualquer tecido, já que
todas as células carregam a mesma informação
em seu genoma.
<EDJ;:;HD7
Já a fonte de RNA – dependendo do tipo de RNA
– é muito mais limitada que a fonte de DNA.

Isso porque o RNA é o produto da expressão

de uma porção específica do DNA. E tal expressão
é controlada por uma série de fatores, entre eles
estão:

- Tipo de tecido.
- Tipo de célula (ainda que do mesmo tecido).
- Condição fisiológica (ex. gravidez e lactação).
- Enfermidades.
En
- Fase de desenvolvimento do organismo.
- Interação do organismo com o meio.
- Vários outros.

Ou seja, se, por exemplo, um pesquisador

tivesse como objetivo analisar a expressão gênica
de célula hepáticas, ele deveria, necessariamente,
coletar células do fígado. Os genes expressos
em células da pele, por exemplo, não são,
necessariamente, os mesmos genes expressos nas
células do fígado.
 ;NJH7w°E;
FKH?<?97w°E:;
:D7;HD7
 Agora que você já sabe de onde
pode vir o DNA e o RNA, vamos
falar sobre os procedimentos aos
quais essas moléculas precisam ser
submetidas para serem passíveis de
análise.

Independentemente do método
utilizado para se extrair e purificar
ácido nucleicos, há sempre três passos
a serem realizados:

- Passo 1: lise ou extração.

- Passo 2: isolamento ou purificação.
- Passo 3: ressuspensão.
B?I;EK;NJH7w°E
A lise é o passo responsável pela retirada do ácido
nucleico de dentro da célula, expondo-o ao ambiente e,
consequentemente, aos reagentes utilizados no passo
seguinte (isolamento).

Durante a lise, a membrana e outras estruturas celulares

serão rompidas para que, assim, o DNA e/ou o RNA possam ser
extraídos de dentro da célula. Este processo pode ser realizado,
basicamente, por meio de quatro estratégias diferentes:

- Física
- Química
- Enzimática
- Combinação das outras estratégias (essa é a estratégia mais
comum).
;IJH7Jx=?7I:;B?I;9;BKB7H
Física:
Nesta estratégia a membrana das células é rompida
por meio de força mecânica. A extração pode ser realizada
por equipamentos como cadinho e pistilo, lâminas, beads,
maceração, sonicação, congelamento etc.

Vantagens
- Eficiente.
- Pouco tempo por amostra (o tempo da lise em si é curto).
- Indicado para amostra difíceis (folha, semente, raiz e fungo).
- Por ser rápido, pode ser interessante para extração de RNA.

Desvantagens
- Processo manual.
Muito tempo – se muitas amostras.
- Mui
- Pode gerar calor – degradação do alvo e associação do ácido
nucleico alvo com proteínas.
- Demanda equipamentos específicos.
;IJH7Jx=?7I:;B?I;9;BKB7H
Química:
Nesta estratégia, as estruturas celulares são destruídas
por meio da ação de produtos químicos, como detergentes e
sais.

- Vantagens
- Baixo
Bai custo.
- Rápido.
- Fácil.

Desvantagens
- Detergente pode romper outras organelas (não indicado
para extração de DNA de organelas específicas).

- Não é eficiente em bactérias gram-positivas, plantas e

fungos.
- Pode tornar o processo de discriminação entre DNA
plasmidial e DNA genômico mais complexo.
- Tóxico para as pessoas.
;IJH7Jx=?7I:;B?I;9;BKB7H
Enzimática:
Neste caso, a membrana celular e outras
estruturas serão destruídas por meio da ação
de enzimas, como, por exemplo, proteinase K e
lisozima.

Vantagens
- Não demanda equipamento.
- Remoção seletiva da parede celular.
- Pode ser seguida de lise química, o que evita
possíveis danos causados pela lise mecânica.

Desvantagens
- Pode ser demorado (> 1h).
- Pode ser caro.
- Não indicado para análise de expressão gênica –
enzimas podem causar viés na expressão de alguns
genes.
?IEB7C;DJEEKFKH?<?97w°E
Antes de seguirmos com o passo de isolamento,
é importante ressaltar que em algumas aplicações
com condições específicas, somente o passo da
extração pode ser suficiente.

Ou seja, a amostra não precisa estar purificada

e nem em condições ideais de processamento e
análise. Mas esses casos são específicos e limitados
a poucos tipos de aplicação.

O passo de isolamento consiste em isolar o

DNA ou RNA de todo o resto: por exemplo, debris
celulares, reagentes químicos e proteínas.

Este passo pode ser divido em dois momentos:

- Purificação.
- Lavagem.
FKH?<?97w°E
De todos os
procedimentos realizados
ao longo do processo de
extração e purificação
de ácidos nucleicos, as
estratégias de purificação
são os procedimentos que
mais
mai variam entre um
método e outro.

Podemos separar as
estratégias de purificação
em três tipos:

- Fenol e clorofórmio.
- Colunas de centrifugação.
- Beads magnéticas.
FKH?<?97w°EƤ<;DEB;9BEHE<ÏHC?E
Processo manual que é baseado na solubilidade
diferencial do ácido nucleico em relação aos outros
componentes celulares.

Neste método, as amostras já lisadas são expostas a

uma mistura de fenol e clorofórmio. Após centrifugação,
há a formação de fases – fase aquosa e fase orgânica.

As proteínas, que são solúveis em fenol/clorofórmio,

permanecem na fase inferior – orgânica. Já os ácidos
nucleicos, que são solúveis em água, permanecem na
fase superior – aquosa.

A fase aquosa é separada em um novo tubo, ou

seja, o ácido nucleico é isolado das proteínas e outros
componentes celulares e, em seguida, é precipitado em
etanol ou isopropanol absoluto por meio de centrifugação.

Por meio deste processo, também é possível separar o

DNA do RNA. Para isso, utiliza-se fenol de pH ácido.
FKH?<?97w°E Ƥ <;DEB ;
9BEHE<ÏHC?E
Vantagens
- Eficiente. Geralmente, maior
quantidade de DNA/RNA que
outros métodos.
- Compatível com extração de
DNA de grande peso molecular
(DNA genômico).
- Proteínas presentes na fase
orgânica podem ser purificadas.
- Bom desempenho com
amostras ricas em lipídios.

Desvantagens
De
- Fenol e clorofórmio podem
causar intoxicação.
- Trabalhoso e demorado.
- Resquícios de fenol e clorofórmio
na amostra podem inibir reações.
- A coleta da fase aquosa
demanda certa prática.
FKH?<?97w°EƤ9EBKD7I:;9;DJH?<K=7w°E
Processo que permite a purificação eficiente
de diferentes tipos de ácidos nucleicos: DNA, RNA,
microRNAs, plasmídeos, produtos de PCR, entre
outros.

As colunas de centrifugação contém uma

matriz sólida de sílica ou outro tipo de resina que
se associa seletivamente ao ácido nucleico de
interesse.

Neste tipo de estratégia, a solução contendo a

amostra lisada é forçada a atravessar os poros da
matriz, retendo e isolando o ácido nucleico.
FKH?<?97w°E Ƥ 9EBKD7I
:;9;DJH?<K=7w°E
Vantagens
- Não é a opção mais cara.
- Muito eficiente na
purificação.
- Confiável.
- Mais rápido que fenol /
clorofórmio.

Desvantagens
- A quantidade de DNA/RNA
purificado está limitada à
capacidade de ligação da
coluna.
- Pode entupir.
- Processo manual (menos
que o fenol/clorofórmio).
FKH?<?97w°EƤ8;7:IC7=DxJ?97I
Neste método, micro esferas magnéticas
positivamente carregadas – mais conhecidas como
beads magnéticas –, se associam ao ácido nucleico
presente nas amostras lisadas.

As beads são, então, capturadas por imãs e,

em seguida, isoladas das proteínas e dos outros
componentes celulares.

O procedimento é rápido e prático, mas requer

uma rack específica com um imã potente.
FKH?<?97w°EƤ8;7:IC7=DxJ?97I
Vantagens
- Rápido e fácil.
- Diminui risco de contaminação.
- Versátil.
- Passível de automatização.

Desvantagens
De
- Mais caro.
- Necessário ter rack magnética.
B7L7=;C
Independentemente do tipo do método de
purificação, o ácido nucleico uma vez isolado,
deverá ser lavado.

A lavagem nada mais é do que a remoção de

possíveis moléculas e componentes celulares que
não foram isoladas do ácido nucleico no processo
de purificação.

Geralmente, o DNA ou o RNA é lavado com

etanol 70% ou solução de lavagem contendo altas
concentrações de etanol.

No final desse processo, a amostra estará pura,

ou seja, livre de proteínas, lipídios, carboidratos,
componentes celulares e outras macromoléculas.
?IEB7C;DJE;FKH?<?97w°EƤH;IKCE
H;IIKIF;DI°E
O terceiro e último passo é a ressuspensão do
ácido nucleico.

Este passo consiste em recuperar e manter

o DNA ou o RNA estável em solução de volume
adequado, pH controlado e livre de nucleases e
outros contaminantes.

Veja como a solução de ressuspensão age em

cada um dos métodos de purificação:

No caso do método fenol/clorofórmio, a solução

de ressuspensão desfaz o pellet de ácido nucleico
– formado pela sua precipitação em álcool após
centrifugação.
- Nas colunas de centrifugação, a solução de
ressuspensão libera o ácido nucleico da matriz de
sílica e recuperação é realizada por centrifugação
ou vácuo.
- Nas beads magnéticas, a solução de ressuspensão
libera o ácido nucleico das beads magnéticas, que,
por continuarem presas ao imã, são isoladas da
amostra.
H;IIKF;DI°E
Geralmente, a solução utilizada na
ressuspensão é água ultra pura ou solução tampão
– normalmente TE.

TE é uma solução tampão composta de dois

ingredientes principais:
Tris – agente tamponante (faz a manutenção do
pH).
EDTA – agente quelante de cátions (evita ação
de nucleases).

A escolha entre água e TE depende de alguns

fatores. Veja nas tabelas a seguir.
Considerações
Qual Utilizar
E8I;HL7w±;I
;:?97I
9EC8?D7w°E:;CxJE:EI:;FKH?<?97w°E
Diferentes métodos de purificação podem
ser combinados para melhorar o desempenho do
processo como um todo.

Por exemplo, é possível utilizar fenol/clorofórmio

seguido de colunas de centrifugação.

O método fenol/clorofórmio irá proporcionar

bom rendimento de extração e purificação – maior
quantidade do ácido nucleico – e o método por
colunas irá proporcionar melhor nível de pureza.
<;DEB%9BEHE<ÏHC?E
- Mantenha a proporção de amostra e solução de
lise recomendada pelo protocolo.
- Proporção inadequada por diminuir o rendimento
da extração – tanto em termos de quantidade como
em termos de pureza – e favorecer a degradação da
amostra no longo prazo.
- Homogeneizar muito bem (mesmos motivos
acima).
- Não deixar a amostra esquentar para evitar
degradação.
- Centrifugar na velocidade certa e tempo
adequado para separação adequada das fases.
- Não processar muitas amostras por vez (processo
manual e cansativo).
- Não movimentar as fases.
- Deixar um pouco da fase aquosa, ainda que tenha
perda de RNA/DNA (evitar contaminação com
proteínas).
- Secar o pellet por 4 minutos (aumentar o
rendimento e evitar contaminação por álcool).
- É normal não ver o pellet após a precipitação.
- Centrifugar com o cabinho do tubo para fora (para
conhecer a posição de pellet).
- Retirar o álcool pelo lado oposto ao pellet.
- Misturar bem no momento da ressuspensão.
9EBKD7I:;9;DJH?<K=7w°E
- Mantenha a proporção de amostra e solução de
lise recomendada pelo protocolo.
- Homogeneizar muito bem.
- Centrifugar na velocidade certa e tempo
adequado.
- Manter
Man as amostras no gelo.
- Misturar bem no momento da ressuspensão.

- Pipetar no centro da coluna.

- Se tiver pouca amostra, passar duas ou três vezes
pela coluna.
- Amostras mal homogeneizadas podem entupir a
coluna.
- Centrifugação de amostras sujas após a lise para
evitar entupimento.
- Verificar compatibilidade do kit com o tipo de RNA
alvo.
8;7:IC7=DxJ?97I
- Mantenha a proporção de amostra e solução de
lise recomendada pelo protocolo.
- Misturar bem no momento da ressuspensão.

- Vortexar muito bem as beads (elas decantam

rapidamente).
- Vortexar muito bem amostra associadas às beads.
- Spin de 1-2 segundos para coletar conteúdo da
parede e tampa a cada passo de homogeneização.
- Esperar a solução clarear antes de retirar o
sobrenadante (evitar perda de amostra).
- Secar o pellet por 4 minutos.
- Usar etanol 70% fresco (feito no dia).
- Cuidado com etanol na parede do tubo.
FHÏN?CEI
F7IIEI
FHÏN?CEI
F7IIEI
- Após a extração e purificação,
o ácido nucleico deverá ser
armazenado adequadamente. Veja
as recomendações abaixo:

Armazenamento:
- DNA: -20 °C.
- RNA: -80 °C.
- Períodos longos: precipitado em
etanol.

Antes de seguir com os

próximos passos é importante
verificar a qualidade da extração e
da purificação.
- Verificar a quantidade de DNA/RNA
obtida.
- Verificar o nível de pureza de
DNA/RNA em relação a proteínas e
outros contaminantes.
- Verificar a integridade –
principalmente para amostras de
RNA.
 9EC?IIEJ;HC?D7CEI
E97:;HDE:;>E@;$

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