ALUNO: FABBIO RONNYEL RODRIGUES BALDOINO

SEMANA 7 – SOI 4

Encaminhe uma resenha com o funcionamento do Sistema CRISPR-Cas9,

incluindo os tipos possíveis de reparo no DNA.

O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta para cortar o DNA em um local

específico.Foi descoberto em um sistema imunológico bacteriano, o CRISPR
Cas9 foi adaptado a uma ferramenta poderosa para a pesquisa genômica,
existem dois componentes no sistema: uma proteína de corte de DNA
chamada Cas9 e uma molécula de RNA conhecida como RNA guia, eles
formam um complexo que pode identificar e cortar seções do DNA.Primeiro o
cas9 tem que localizar e se ligar a uma sequência comum em o genoma
chamado PAM, uma vez que o PAM é ligado, o RNA guia desenrola parte do
hélice dupla, a fita de RNA é projetada para corresponder e ligar uma
sequência específica no DNA.Uma vez que foi encontrada a sequência correta
Cas9 pode cortar o DNA no domínios nucleares levando a uma quebra de fita
dupla, embora a célula tente reparar essa interrupção o processo de fixação é
propensas a erros e frequentemente introduz inadvertidamente mutações que
desativam o gene isso torna o CRISPR uma ótima ferramenta para eliminar
genes específicos.Alguns pesquisadores estão desativando CAS9 e fundindo
novas enzimas na linha de conversão de proteínas que pode ser usada para
transportar essas enzimas para uma sequência de DNA específica,por
exemplo, o CAS9 funciona como uma enzima desaminase que sofre mutação
nas bases específicas de DNA, eventualmente substituindo citosina por timina
significa que você pode transformar uma mutação causadora de doença em um
versão saudável do gene ou introduzir um códon de parada em um local
específico.Outra forma de usar CRISPR para promover a transcrição de genes
é desativando CAS9 completamente para que não possa mais cortar o DNA,
em vez dos ativadores da transcrição CAS 9, fundindo-os diretamente ou
através de uma série de peptídeos alternativamente, os ativadores podem ser
recrutados para o RNA guia em vez disso, esses ativadores recrutam as
máquinas de transcrição da célula, trazendo Polimerase de RNA e outros
fatores para o alvo e aumento da transcrição.O mesmo princípio se aplica ao
silenciamento de genes de um domínio KRAB fundido a o CAS 9 inativa a
transcrição recrutando mais fatores que fisicamente bloquear o gene, uma idéia
mais simples de usar o CRISPR é anexar proteínas fluorescentes para o
complexo, assim pode ver onde seqüências específicas de DNA são
encontradas a célula isso pode ser útil para coisas como visualizar a
arquitetura 3D de genoma ou para pintar um cromossomo inteiro e seguir sua
posição o núcleo.
A Enzima CAS9 é uma enzima que possui dois domínios de nuclease, sendo
que cada um destes é responsável por clivar uma das fitas do DNA detectado
pelo sistema CRISPR-Cas. Com o auxílio dessa enzima é possível gerar
mutação em um dos domínios para inativa-lo e produzir proteínas que clivem
somente uma das fitas de DNA. Nesse caso a enzima funciona como uma
helicase.Cas9 possui um domínio chamado HNH que possui a função de clivar
a fita complementar a sequência do RNA guia e um domínio RuvC, necessário
para clivar a fita não complementar.Esses dois domínios serão responsáveis
pela clivagem da cadeia dupla do DNA alvo.Cas9 possui uma região rica em
arginina, altamente conservada, como função mediar a ligação de ácidos
nucléicos.
O reparo pode acontecer de duas maneiras. As enzimas podem juntar as
extremidades pendentes, o que geralmente resulta em uma ou mais bases
sendo adicionadas ou excluídas, interrompendo a função do
gene. Alternativamente, outras enzimas podem corrigir a ruptura com uma
única fita de DNA que corresponde à sequência de DNA a montante e a
jusante do corte. Uma fita de DNA complementar é criada para concluir o
reparo da fita dupla.O primeiro, chamado junção final não homóloga, parece
ser o resultado mais comum após o corte do CRISPR. O último, reparo
direcionado à homologia, ocorre com mais freqüência em alguns tipos de
células que em outros, e requer a presença de um pedaço de DNA que pode
ser usado para corrigir o rompimento. Os pesquisadores geralmente fornecem
um pedaço de DNA de fita simples e esperam que a célula o utilize para
substituir a sequência defeituosa pela nova.Ambos os processos são um pouco
misteriosos, no entanto, e ninguém sabe por que algumas células se ligam
rapidamente ao DNA, enquanto outras o fazem com pouca frequência.
 REFERENCIA

University of California - Berkeley, DNA repair after CRISPR cutting not at all
what people thought, https://phys.org/news/2018-07-dna-crispr-people-
thought.html

GISDENILTON CARLOS GONZAGA CAETANO1 , HIGOR DE OLIVEIRA

SANTOS MATOS¹, PALOMA CAROLINE RAMOS SIMÃO1 , RAYANNE
VINDILINO DUARTE1 , SABRINA ANTUNES BARRETO1 , IVAN SALES
HENRIQUES2, TÉCNICA CRISPR-CAS9 E SUA UTILIZAÇÃO NA ÁREA
LABORATORIAL,
https://www.mastereditora.com.br/periodico/20190103_214255.pdf