REPLICAO DO DNA

CAPTULO 5 Alteraes genticas ocasionais aumentam a sobrevivncia a longo prazo de uma espcie; entretanto, a sobrevivncia de um organismos requer alta estabilidade gentica. Existem vrios processos genticos para a correo de erros, mas, quando algum desses mecanismos falha, resultam em uma alterao permanente no DNA, chamada genericamente de mutao. A taxa de mutao a proporo na qual alteraes visveis acontecem no DNA. Como a maioria das mutaes prejudicial, espcies no conseguem viver com taxas acumuladas. As clulas de um organismo podem ser de duas formas: germinativas, que iro transferir informaes genticas do progenitor para os seus descendentes, e as somticas, que iro formar o organismo. Ambas precisam ser protegidas contra mutaes, para promover a manuteno da espcie e evitar proliferao de clulas variantes no organismo. MECANISMOS DE REPLICAO DO DNA A replicao da dupla-hlice de DNA um processo semiconservativo, uma vez que a nova molcula formada herda uma fita da molcula base e a outra fita polimerizada pela DNA polimerase a partir de nucleotdeos livres. No processo, forma-se a forquilha de replicao, que a regio onde a nova fita est sendo formada; duas forquilhas movem-se em direes opostas em um cromossomo circular. O sentido antiparalelo das duas fitas provoca um problema: nesse caso, o mecanismo necessitaria que uma fita fosse polimerizada no sentido 5-3 e a outra no sentido 3-5, o que no possvel, pois a DNA polimerase s possui atividade polimerase no sentido 5-3. Isso explica a existncia de dois tipos de fita em uma forquilha: (1) Lder: Sintetizada continuamente, na mesma direo do crescimento da cadeia de DNA; (2) Retardada: Fita de crescimento descontnuo, na direo oposta ao crescimento da cadeia de DNA; ocorre a formao dos fragmentos de Okasaki. A polimerase por si s sintetiza apenas um pequeno segmento de nucleotdeos e logo se dissociam do DNA-molde. Essa caracterstica vantajosa na sntese da fita retardada, mas, no caso da fita lder, torna-se um problema, j que ocorre a sntese de longas fitas. Para ajudar esse problema, a polimerase possui protenas acessrias que atuam como cintas reguladoras, as quais mantm a polimerase firmemente associada ao DNA enquanto est em movimento, mas a libera quando chega em uma fita dupla, alm de permitir o deslizamento da fita pela protena. Um lado do anel da cinta liga-se atrs da polimerase, e toda a cinta desliza ao longo da molcula juntamente com essa enzima. A montagem da cinta ao redor da fita de DNA acontece da seguinte forma: Um complexo protico denominado montador de cinta interagem com a cinta deslizante e, juntamente com ATP, ir interagir com os sulcos de DNA apertando em tordo da juno com o iniciador at que seu progresso bloqueado pela extremidade 3 do iniciador, ponto em que o montador hidrolisa ATP e se desliga da cinta e a polimerase se liga cinta. Em uma fita de sntese descontnua, o montador fica sempre perto da polimerase, para que possa montar um nova cinta no incio de cada fragmento de Okasaki. Na fita de sntese contnua, necessrio apenas um stio de incio, enquanto que, na fita retardada vrios so necessrios, uma vez que, quando a polimerase sintetiza um fragmento de Okasaki, ela deve iniciar a sntese em um outro stio completamente novo mais adiante na fita. A DNA polimerase, no entanto, s capaz de captar nucleotdeos livres e adicion-los a uma estrutura j existente. A DNA primase ir sintetizar pequenos iniciadores de RNA (ribonucleotdeos) que serviro de base para o incio da ao da polimerase. A medida que a nova fita vai sendo sintetizada, a dupla-hlice deve ser aberta logo frente da forquilha de replicao, para que os trifosfatos possam ser

pareados com a fita molde. As DNA helicases, utilizando sua capacidade de hidrolisar o ATP quando ligada a cadeias simples de DNA, vo se impulsionar pela fita simples, uma vez que essa hidrlise altera a conformao da molcula protica, permitindo o seu trabalho mecnico. Ao encontrarem uma regio de dupla hlice, sero capazes de separar essas fitas. Existem as helicases que movem na direo 53 e 35, devido ao antiparalelismo das fitas. As protenas ligadoras de fita simples ou protenas desestabilizadoras de hlices (SSB) ligam-se uma fita de DNA, de modo que as bases continuem expostas para o pareamento, mas estabilizando a conformao distorcida e de fita simples, alm de cobrir e evitar a formao de pequenos grampos de hlices que seriam formados e impediriam a sntese. Durante o processo, agem tambm as topoisomerases. Durante o empacotamento do DNA, eram elas as enzimas responsveis por provocar um superenrolamento da estrutura para armazenar energia, proteger o DNA e prendelo na regio perifrica do ncleo. Durante a duplicao, a sua funo oposta: ela vai aliviar a tenso da fita, atravs de uma ligao que ela faz com o fosfato para clivar a ligao fosfodister, para que a helicase consiga quebrar as ligaes de hidrognio. - Topoisomerase I Possui uma tirosina no stio ativo. Quando essa enzima faz uma ligao fosfotirosina com algum fsforo de uma simples fita, ela acaba clivando a ligao fosfodister dessa fita e, consequentemente, provoca uma ruptura da fita, fato que permite a rotao da uma das partes, aliviando a tenso. Como a ligao covalente entre a topoisomerase e o fosfato mantm a energia da clivagem da ligao fosfodister, o processo torna-se reversvel. - Topoisomerase II So ativadas por stios no cromossomo que possuem duplashlices entrelaadas. Essa enzima forma ligao covalente e reversvel s duas fitas de DNA opostas; atravs da hidrlise da ATP, a topoisomerase consegue clivar a dupla hlice de uma dessas molculas, formando uma fenda protica; atravs dessa fenda, a segunda molcula de fita dupla passa, e depois a fenda fecha; com a utilizao de ATP, as ligaes entre as duplas-hlices so refeitas, resultando em duas molculas que no possuem suas duplas-hlices entrelaadas. A sntese da fita ou do fragmento termina quando a polimerase encontra a primase da forquilha seguinte ou o fragmento de okasaki seguinte. Nesse momento, a polimerase realiza a sua funo exonuclease 53, na qual ela retira os ribonucleotdeos e os substitui por desoxirribonucleotdeos. O espao que fica entre os dois pedaos de fita insuficiente para a adio de outro nucleotdeo, e a polimerase no consegue fazer a ligao entre eles. A ligao fosfodister entre todos os espaos feita pela DNA ligase, que liga a extremidade 3 de um fragmento com a 5 do outro. INCIO E TRMINO DA REPLICAO DE DNA NOS CROMOSSOMOS Existem protenas iniciadoras especiais que se ligam molcula de DNA e separam as ligaes entre as duas fitas. O local onde a hlice inicialmente aberta chamado de origem de replicao. Seres procariotos possuem somente uma origem de replicao, fazendo com que o incio desse processo seja uma fase altamente controlada. A duplicao comea quando um complexo de protenas iniciadoras liga-se a stios especficos na origem da replicao, envolvendo o DNA em volta dessas protenas. Esse complexo atrai a DNA-helicase, inicialmente acoplada a um inibidor de helicase; a helicase colocada adjacente a uma fita simples de DNA. Esse inibidor de helicase anlogo ao montador de cinta, mas tem a funo adicional de manter a helicase na forma inativa at que ela esteja corretamente ligada na forquilha. A helicase comea a abrir o DNA at que tenha espao pra formao do primer. Os eucariontes possuem vrias origens de replicao, sendo que elas no so ativadas todas simultaneamente; regies diferentes no mesmo cromossomo so replicados em tempos distintos na fase S; a replicao da heterocromatina realizada num perodo mais tardio da fase S, enquanto que a eucromatina replicada mais precocemente, pois essa regio est mais acessvel maquinaria de replicao.

- INCIO Cada sequncia de DNA que atua como origem da replicao deve conter: (1) stio para ligao de uma protena iniciadora com mltiplas unidades chamadas de ORC (complexo de reconhecimento de origem), (2) TATA Box (3) stio de ligao para protenas que auxiliam a atrair a ORC origem de replicao. - REGULAO DAS ORIGENS Com tantas origens de replicao, necessrio um instrumento que controle a replicao nica da regio. Durante a fase G1, formado um complexo pr-replicativo, o qual inclui a helicase e suas inibidoras, alm de outras protenas. A passagem da clula da fase G1 para a fase S controlada pela ciclina (Cdks), que iro fosforilar vrias dessas protenas, provocando a dissociao do complexo pr-replicativo e o incio da replicao. Um novo complexo pr-replicativo no pode ser formado na origem at que a clula tenha progredido prxima fase G1. - DUPLICAO DOS NUCLEOSSOMOS A replicao inclui tambm a sntese de novas protenas cromossomais e a sua associao ao DNA atrs de cada forquilha. As histonas so sintetizadas principalmente na fase S, quando o nvel de mRNA aumenta; conseguem sobreviver por toda a vida da clula. medida que as forquilhas passam pelos nucleossomos sem retir-los do DNA, a maior parte das histonas originais permanecem ligadas molcula, sendo distribudas s hlicesfilhas atrs da forquilha. O tetrmero H3-H4 original permanece no DNA, e novos vo sendo adicionados (chaperonas de histona CAF1) para preencher os vazios; os dmeros H2AB metade novos e metade originais vo sendo adicionados (chaperonas de histona NAP1) aleatoriamente para preencher o vazio. Essa ordenao do octmero requer a atuao das chaperonas de histonas. Esses complexos possuem vrias unidades que se ligam s histonas, liberando-as somente onde necessrio; elas so conduzidas ao novo DNA pela interao especfica com a cinta deslizando eucaritica, que so deixadas atrs das forquilhas, permanecendo ai at que as chaperonas completem seu trabalho. - REPLICAO DO TELMERO Quando a replicao chega fase final, ocorre um problema na fita descontnua: sobra, no final do cromossomo, uma regio que no tem sequncias nucleotdicas suficientes para a produo de um primer e a formao de um novo fragmento de Okasaki; e essa regio no pode ser excluda, pois corresponde a parte do telmero, estrutura da qual a clula no pode viver sem. A sequncia telomrica da fita original reconhecida por varias protenas ligadoras de DNA que iro atrair a telomerase. Essa enzima ir reconhecer a extremidade 3 da fita original e, a partir de molde de RNA que a compe, ela ir estender essa regio, para que tenha tamanho suficiente para a produo de outro fragmento de Okasaki. Esse mecanismo faz com que a extremidade 3 de cada telmero seja sempre maior do que a 5 a qual est pareada, fazendo com que uma extremidade de fita simples fique exposta; essa extremidade forma uma ala t, as quais geram uma estrutura que protege a molcula das enzimas de degradao e diferencia as extremidade normais daquelas das molculas quebradas. REPARO DO DNA O DNA uma molcula suscetvel a alteraes espontneas, provocadas por perda de bases pricas: (a) depurinao: hidrlise das ligaes n-glicosil desoxirribose; (b) desaminao: na citosina e uracila: a amina da base trocada por um oxignio. Danificao das bases tambm podem ocorrer: (a) metablicos reativos produzido pela clula ou exposio a produtos qumicos; (b) radiao pode promover uma ligao covalente entre duas pirimidinas adjacentes no DNA, formando dmeros de pirimidinas. - REPARO POR EXCISO DE BASE Envolve as enzimas DNA-glicosilases, cada uma capaz de reconhecer um tipo especfico de base alterada e catalizar a sua remoo. Existem pelo menos 6 tipos dessa enzima, como aquelas que removem C desaminado, A desaminado, bases alquiladas ou oxidadas, bases com anis rompidos e bases nas quais a ligao dupla Carbono Carbono foi convertida em ligao simples. Como o erro reconhecido: mediado por enzimas, o nucleotdeo alterado projetado para fora da hlice, permitindo a procura da leso pela DNA-glicosilase,

que ir remover a base do acar. A poro do acar fosfato do resduo que sofreu perda da base clivada do DNA pela ao seqencial da endonuclease AP (apurnica/porque cliva internamente cadeia polinucleotdica) e de uma fosfodiesterase. O intervalo desse nucleotdeo preenchido pela polimerase e ligado pela ligase. - REPARO POR EXCISO DE NUCLEOTDEOS Pode corrigir erros produzidos pela reao covalente de bases do DNA com grandes hidrocarbonetos, bem como os vrios dmeros pirimidinas causados pela radiao. Complexo multienzimtico verifica a presena dessas distores na duplahlice. Quando encontrada, a ligao fosfodister da fita anormal clivada nos dois lados da distoro, e a DNA-helicase remove o oligonucleotdeo de fita simples contendo a leso. O intervalo produzido na hlice (30 nucleotdeos) nos humanos corrigido pela polimerase e ligase. As DNA polimerases so enzimas altamente especficas que param quando detectam algum erro na fita molde. Quando isso acontece e os outros mecanismos no funcionam, entram em ao as polimerases de apoio versteis, que, em emergncias, replicam o DNA pela leso, mas no so to especficas, so menos seletivas e no possuem atividade exonuclease, por isso no so muito confiveis. Elas reconhecem um tipo de leso e especificamente adicionam nucleotdeo necessrio para restaurar a sequncia inicial; outras adivinham, principalmente quando a base est muito danificada. Algumas vezes, ocorre das duas fitas da dupla hlice quebrarem, causada por radiao ionizante, erros na replicao, agente oxidantes e outros metablicos produzidos pela clula. Se no forem corrigidas, levaro degradao do cromossomo em fragmentos menores e na perda dos genes na diviso. Formas de correo: - LIGAO DE EXTREMIDADES NO-HOMLOGAS As extremidades da quebra so simplesmente justapostas e religadas, geralmente com a perda de um ou de mais nucleotdeos no stio de juno. - RECOMBINAO HOMLOGA Ocorre no DNA recm sintetizado, no qual o DNA reparado usando a cromtide irmo como molde. Pode acontecer a quebra da fita simples ou um espao na hlice original de DNA logo frente da forquilha de replicao. Quando a forquilha encontra essa leso, ela se quebra, resultando em um cromossomo-filho intacto e um quebrado.A exonuclease degrada a extremidade 5 da fita quebrada, gerando um extremidade 3 livre. Ocorre a transposio das fitas novas. Ocorre a quebra da fita nova no lado em que ela estava originalmente ligada, seguida por uma sntese adicional em ambos os lados para recompor a forquilha, que agora ser capaz de passar pelo stio que foi clivado no molde original, usando uma cpia no danificada do stio como molde.

PORQUE A REPLICAO OCORRE SOMENTE NO SENTIDO 5-3 Se a replicao ocorresse no sentido 3-5, no haveria disponibilidade de energia para a correo de possveis erros. Nesse tipo de sntese, a extremidade 5 que seria portadora do trifosfato ativado, ao invs do mononucleotdeo a ser ativado. Dessa forma, quando um nucleotdeo errado fosse retirado, o correto no teria energia para se ligar fita de DNA, pois no haveria ligaes trifosfato para quebrar, no havendo, dessa forma, disponibilidade de energia para a correo. Por isso a necessidade da existncia da fita de sntese descontnua: para que a direo 5-3 seja obedecida e possveis erros possam ser corrigidos.

ERROS: (I) Com pequenas alteraes na geometria da hlice, duas ligaes de hidrognio podem ser formadas entre G e T; (II) formas tautomricas raras das quatro bases do DNA podem parear erroneamente sem alterao na geometria da hlice. Nesse caso, a alternncia tautomrica rpida entre a forma anormal e a

normal destri o pareamento com o nucleotdeo da fita base, impedindo o alongamento da fita. Se esses erros no forem corrigidos, o nucleotdeo errado seria incorporado cadeia nascente de DNA, produzindo mutaes freqentes. - Polimerase exonuclease 3-5 Ocorre assim que o nucleotdeo errado incorporado fita nova. O processo de verificao ocorre das seguintes formas: (a) O nucleotdeo correto tem maior afinidade pela polimerase em movimento em comparao ao incorreto, porque o correto mais favorvel energicamente; (b) Aps a formao das pontes de hidrognio mas antes da formao da ligao fosfodister, a polimerase deve sofrer uma alterao na qual os dedos da enzima apertam a regio do stio ativo, alterao que ocorre mais prontamente quando o pareamento feito de forma correta. Quando, mesmo assim, ocorre a efetivao da ligao covalente entre os nucleotdeos, a polimerase no consegue provocar o alongamento da fita. Dessa forma, essa enzima, atravs de um stio cataltico separado, cliva, no sentido 3-5, os nucleotdeos pareados incorretamente at que fique uma ponta 3OH pela qual a polimerase possa continuar a sua atividade normal. SISTEMA DE REPARO DE PAREAMENTO INCORRETO Algumas alteraes nos genes mutadores aumentam consideravelmente a taxa de mutao espontnea. Um desses tipos de mutao produz uma forma defeituosa de exonuclease 35, fazendo com que o seu sistema de reparo no mais seja eficiente, resultando no acmulo de erros que teriam sido removidos se a enzima atuasse corretamente. Outro sistema de correo, chamado de sistema de reparo de pareamento, capaz de remover erros de replicao produzidos pela polimerase que escaparam exonuclease, atravs da deteco de distores da hlice de DNA resultante da interao incorreta entre bases no-complementares. Mas esse sistema no pode simplesmente retirar qualquer um dos nucleotdeos do pareamento errado; deve retirar da fita que foi recm sintetizada. No caso das bactrias, para que esse processo ocorra corretamente, depender da metilao de determinados resduos A no DNA. O grupo metil adicionado a todos os resduos A nas sequncias GATC, mas somente aps algum tempo aps a incorporao desse A na sequncia. Dessa forma, as nicas que no foram metiladas so aquelas recm sintetizadas atrs da forquilha de replicao. Essa identificao permite a diferenciao temporria entre a fita molde a nova fita. No caso dos eucariotos, as fitas recm sintetizadas sofrem clivagens transitrias (antes de serem ligadas pela DNA ligase), e esses stios de clivagem fornecem o sinal que direciona o sistema de correo de pareamento incorreto para a fita apropriada. Depois disso, o processo de correo acontecer em trs etapas: reconhecimento do erro, remoo do DNA contendo o pareamento incorreto na fita recm-sintetizada e a ressntese do segmento removido. Indivduos da espcie humana que herdam clulas humanas defeituosas de um gene de reparo de pareamento incorreto possuem uma predisposio para o desenvolvimento do cncer, visto que, ao ocorrer alguma mutao na clula, o sistema no ser capaz de corrigir, originando geraes de variaes celulares incompatveis com o organismo.