Pós graduação em Biologia Molecular e Genética Laboratorial

A IMPORTÂNCIA DO
SISTEMA CRISPR NA
PARASITOLOGIA
Aline Cassia
Eduarda Karolyne
Elizabeth
Larissa Silva Martins
 Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats (CRISPR)

• Emmanuelle Charpentier  e
Jennifer Doudna

•Trans-activating crispr RNA

(tracrRNA)
 CRISPR/Cas9 em Parasitologia

Sistema simples e eficiente de edição de genoma que usa a endonuclease Cas9 para gerar uma
quebra de fita dupla (DSB) em um locus de interesse no genoma.

A especificidade é alcançada através da ligação Cas9 a um único RNA guia (sgRNA), que deve
conter 20 nucleotídeos complementares a uma sequência no genoma flanqueando um motivo
adjacente ao protoespaçador (PAM).

A quebra do DSB é então reparada com reparo direcionado por homologia (HDR) usando um
modelo de reparo fornecido ou com as vias de junção final mediada por microhomologia (MMEJ)
ou junção final não homóloga (NHEJ) mais propensas a erros, dependendo do organismo.

CRISPR/Cas9 permite a deleção, inserção ou mutação do DNA com pouca ou nenhuma cicatriz
genética.
A tecnologia de edição de genoma CRISPR/Cas9 tem estudos funcionais muito avançados em
parasitas, como Leishmania, Plasmodium eTrypanosomae insetos vetores, incluindo Anopheles.

Em Plasmodium falciparum e Plasmodium yoelii, tecnologias alternativas baseadas em CRISPR,

como o CRISPRi, podem modular a expressão gênica na ausência de edição do genoma.

Em Leishmania major, Leishmania donovani, e Leishmania mexicana, um sistema

CRISPR/Cas9 simplificado e altamente eficiente possibilita telas mutantes de alto rendimento.

Em Trypanosoma brucei, CRISPR/Cas9 possibilita a edição de genes livre de marcadores

altamente eficiente.

Em Anopheles gambiae e Anopheles stephensi, os sistemas de gene drive baseados em

CRISPR/Cas9 mostram-se promissores no avanço dos esforços de supressão e substituição da
população.
 CRISPR no Plasmodium

O plasmódio não possui a via canônica NHEJ e utiliza principalmente a via HDR para reparar
DSBs de DNA, resultando em menos efeitos não intencionais ou fora do alvo.

Assim, o sistema CRISPR/Cas9 em P. falciparum depende de um sistema de um ou dois

plasmídeos que fornece a nuclease Cas9, o sgRNA e um molde de reparo de DNA.

O sistema em P. yoelii utiliza apenas um plasmídeo.

Um desafio para o uso de CRISPR/Cas9 em P. falciparumé seu genoma extremamente rico

em AT, o que pode dificultar a busca por um PAM adequado e a clonagem de modelos de
reparo.
 CRISPR no Plasmodium

• Primeiro, o local de ligação do sgRNA deve estar o mais próximo possível do local de
mutação desejado (menos de 100bp).

• Para grandes deleções, é mais eficaz usar dois sgRNAs, um em cada extremidade do
locus a ser excluído.

• Isso pode ser conseguido transfectando dois plasmídeos carregando diferentes sgRNAs
simultaneamente ou usando o sistema ribozyme-guide-ribozyme(RGR), recentemente
adaptado a P.yoelii, para gerar múltiplos sgRNAs a partir do mesmo construto ou
simplesmente levar a um comprimento de sgRNA mais definido.

• A otimização da estrutura do sgRNA com extensão duplex e mutação da timina da alça

ligada a Cas9 também pode ajudar na eficácia do sistema CRISPR/Cas9.
 CRISPR/Cas9 versátil e livre de
clonagem
• Benekeet al. desenvolveram um método CRISPR/Cas9 livre de clonagem, baseado em PCR,
para edição rápida e precisa do genoma que foi aplicado com sucesso em Leishmania
mexicana, L. major, L. donovani eTrypanosoma brucei.

• Neste sistema, parasitas transgênicos de Leishmania expressando de forma estável a

SpCas9 e RNA polimerase T7 otimizada para códons (RNAP T7) foram transfectados com
dois fragmentos de PCR codificando um sgRNA acionado por promotor de T7 e um molde de
reparo de DNA consistindo de braços de homologia de ∼30bp flanqueando um marcador
selecionável por fármaco.

• Após 1 semana de seleção da droga, 100% dos parasitas sobreviventes carregavam a

mutação genômica pretendida. Assim, esse tempo total de cultura é drasticamente reduzido
em comparação com outros métodos.

• Outra vantagem desse método é que os fragmentos de PCR são degradados em até 48h,
impedindo a edição subsequente.Este sistema tem sido usado com sucesso para atingir
genes únicos.
 CRISPR/Cas9 para Gene Drives
• A edição do genoma CRISPR/Cas9 foi implementada com sucesso em Anopheles stephensi e Anopheles
gambiae em estudos que tentam bloquear a infecção/transmissão porPlasmodium ou reduzir a população
de mosquitos.

• Uma abordagem de supressão populacional foi apresentada em um estudo recente de Hammond et al., que
desenvolveu um sistema de gene drive baseado em CRISPR/Cas9 para atingir genes de fertilidade feminina
haplosuficientes em A. gambiae.

• Um construto ladeado por regiões homólogas ao gene da fertilidade e contendo sgRNA, um marcador
fluorescente e um Cas9 impulsionado pelo promotor vasa2 (para expressão germinativa em ambos os
sexos) foi inserido no locus do gene da fertilidade.

• Este sistema de gene drive alcançou herança super-mendeliana; no entanto, a fertilidade foi bastante
reduzida em fêmeas heterozigotas devido à expressão vazada de Cas9 em tecidos somáticos envolvidos na
produção de ovos.

• Estudos de acompanhamento utilizaram o promotor zpg para restringir mais fortemente a expressão de
Cas9 à linha germinativa, o que aliviou um pouco o custo para a fertilidade feminina.

• No entanto, as fêmeas que herdaram o alelo gene drive de seus pais mostraram fertilidade reduzida, talvez
devido à deposição paterna da proteína Cas9 no zigoto fertilizado.
 CRISPR/Cas9 para Gene Drives
• Embora esse efeito reduza a contribuição feminina para a propagação do gene drive, uma forte herança
super-mendeliana ainda pode promover a propagação transgênica para uma população inteira e seu
subsequente colapso.

• No entanto, uma desvantagem do uso dessa tecnologia nos esforços de supressão e substituição
populacional é a aptidão possivelmente reduzida dos transgênicos, o que pode estar relacionado à
importância dos genes-alvo ou à imprecisão da ação/expressão da Cas9.

• Esses problemas podem ser aliviados em Anopheles através do uso de Cas9 ou expressão de sgRNA
específicos de tecidos ou de sangue fortemente regulados por refeição sanguínea.

• Outro desafio é o surgimento de alelos resistentes à unidade gênica devido ao reparo inadequado no local-
alvo de DSBs induzidos por Cas9, na maioria das vezes devido à NHEJ propensa a erros, resultando em
uma sequência refratária à futura edição CRISPR/Cas9.

• Sistemas de gene drive que utilizam múltiplos sgRNAs, endonucleases "cortantes" que clivam uma única fita
ou métodos que suprimem a via NHEJ podem ajudar a aliviar o problema da resistência ao gene drive.

• No entanto, mesmo esses sistemas podem não ser capazes de abordar a diversidade genética em
potenciais locais de edição CRISPR/Cas9 em populações naturais de mosquitos.
 Os desafios e as esperanças trazidos
pelo sistema CRISPR
Desenvolver o melhor método de entrega do sistema CRISPR. Isso porque os componentes do
sistema precisam ser de alguma maneira empacotados e enviados para as células e tecidos, que
devem especificamente ser corrigidos, e a forma de fazer isso varia de doença para doença.

Baixo custo e facilidade de uso. Isso se deve ao fato do CRISPR se basear, para o reconhecimento
da sequência de DNA a ser editada, no pareamento de nucleotídeos com uma molécula de RNA, o
que é mais barato, fácil e versátil em relação a técnicas precursoras (como TALENS ou zinc-finges),
que se baseiam na interação entre proteínas e DNA
Vários desafios ainda precisam ser superados, como a
necessidade de pré-amplificação da amostra.

Simplificar o uso de equipamentos: um desafio para o sistema CRISPR. O mecanismo do sistema

CRISPR-Cas permite que os testes moleculares baseados na técnica sejam altamente
programáveis, possibilitando fácil adaptação para diferentes alvos, inclusive em ensaios multiplex,
com uma grande especificidade, enquanto mantêm uma sensibilidade adequada,
 CRISPR/Cas9

Questão
Como funciona a técnica de CRISPR/Cas9?

VÍDEO 1 - CRISPR-Cas 9: como funciona a técnica de edição genética

https://www.youtube.com/watch?v=r_FDObNgw_I

VÍDEO 2 - CRISPR e a edição genômica

https://www.youtube.com/watch?v=fqF_spRZSG0
 REFERÊNCIAS
GLOVER, Lucy et al. CRISPR in Parasitology: Not Exactly Cut and Dried! Disponível em:
https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S1471492219300558?
token=44375514AD30B1D84FDCCA61B7BD618461FD641F575265942904F441914F0A7CF239
A8E0097FE3503E255B4A4767C76F&originRegion=us-east-1&originCreation=20221121145034

YUAN, Jing et al. Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRISPR/Cas9
System. Disponível em: https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/mbio.01414-14

VASCONSELOS, Maria José Vilaça de. et al. Tecnologia CRISPR-Cas para edição genômica.
1ª Ed. Sete Lagoas : Embrapa Milho e Sorgo, 2015.

Sanches, Cristina . Os desafios e as esperanças trazidos pelo sistema CRISPR. Disponivel

em: https://www.labnetwork.com.br/especiais/os-desafios-e-as-esperancas-trazidas-pelo-
sistema-crispr/