A técnica CRISPR/Cas9:

Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

Ana Paula Morelli

Mestranda em Ciências da Nutrição e Metabolismo
Laboratório Multidisciplinar em Alimentos e Saúde
Faculdade de Ciências Aplicadas (FCA – UNICAMP)
SUMÁRIO

Parte I
• Um breve histórico da edição gênica: CRISPR /Cas9 como divisor de águas
• Versatilidade do sistema Cas9 e vias de reparo associadas
• Aplicações biológicas e publicações

Parte II
• Obtendo um modelo de perda de função: ferramentas e desafios

1. Otimizando seu sgRNA e a entrega da Cas9

2. Validando a eficiência do construto
3. Considerando as características da linhagem e problemáticas fenotípicas da seleção clonal
4. Garantindo que o fenótipo obtido é dependente da inativação do gene de interesse

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

 “A habilidade de modificar
precisamente uma sequência genômica
e regular o padrão de expressão gênica
em sítios específicos trouxe muita
promessa para a biologia molecular,
medicina e biotecnologia.”

Mahfouz, MM; Piatek, A; Stewart Jr, CN. Plant Biotechnology Journal , 2014.
DOI: /10.1111/pbi.12256
 A técnica CRISPR /Cas9
revolucionou a “era” da
edição gênica

The 2020 Nobel Prize in Chemistry is awarded to

Emmanuelle Charpentier and Jennifer A. Doudna
“for the development of a method for genome
editing”. Since Charpentier and Doudna discovered
the CRISPR/Cas9 genetic scissors in 2012 their use
has exploded.

Jennifer A. Doudna Emmanuelle Charpentier

As técnicas utilizadas para edição gênica se
baseiam em nucleases

ZINC fingers

(TALENs)
Transcription activator‐like effectors nucleases

CRISPR/Cas systems

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

 As vantagens da técnica CRISPR abrangem desde praticidade à segurança e eficiência

Gilles, AF; Averof, M. EvoDevo, 2014.

DOI: 10.1186/2041-9139-5-43

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Como a técnica CRISPR/Cas9 revolucionou
a história da edição gênica

Doudna, JA; Charpentier, E. Sience., 2014.

DOI: 10.1126/science.1258096

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 Modificações em sítios específicos alteram a função catalítica da proteína Cas9

Doudna, JA; Charpentier, E. Sience., 2014.

DOI: 10.1126/science.1258096

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 Ortólogos de Cas9 ampliam as possibilidades de edição do sistema

Wang H; Russa, ML; Qi, LS. Annual Review of

Biochemistry, 2016.
DOI: /10.1146/annurev-biochem-060815-014607
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Ortólogos de Cas9 representados na ferramenta CRISPOR

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 O mecanismo de reparo dita a modificação obtida pelo sistema

Jiang, F; Doudna, JA. Annual Reviews., 2017.

DOI: 10.1146/annurev-biophys-062215-010822

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 Aplicações de modelos knockout

Modelos de
doença

Progressão Caracterização da
celular/tumoral e mecanística e de
sensibilidade a fármacos mutações de genes

Screening de Identificação de
fármacos/ novos alvos
fenotípico terapêuticos

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função
Generation and Characterization of Cre-Dependent and Constitutive
Cas9-Expressing Mice

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In Vivo AAV9-KPL Delivery and Mutation Analysis

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A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função
Mutational Analysis of Individual Tumors

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função
Hydrodynamic injection of CRISPR deletes Pten in a subset of
hepatocytes in mice

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A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função
TGF-β induces EMT in LS411N-TβRII cells and LS513 cells.

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TGF-β induces apoptosis in the absence of DSTYK.

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DSTYK inhibits chemotherapeutic agent-induced apoptosis

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A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função
Cellular Proliferation Profile of NRF2- Knockout A549 Cells and
Western Blot Analysis

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Proliferation Capacity of Wild-Type and NRF2-Modified A549 Cells (2-11)
in Response to Chemotherapeutic Drugs

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Restored Chemosensitivity in Mice with NRF2 Knockout in Tumors

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 Parte II

Obtendo um modelo de perda de

função: ferramentas e desafios

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1. Otimizando seu sgRNA e a
entrega da Cas9

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1. Otimizando seu sgRNA e a entrega da Cas9

1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência

2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

3. Escolher a melhor forma de entregar a Cas9 (plasmídeo único, duplo, expressão lentiviral..)

4. Otimizar a transfecção ou transdução do complexo na linhagem de interesse

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

1. Otimizando seu sgRNA e a entrega da Cas9

1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência

2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

3. Escolher a melhor forma de entregar a Cas9 (plasmídeo único, duplo, expressão lentiviral..)

4. Otimizar a transfecção ou transdução do complexo na linhagem de interesse

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1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência (Ex. CRISPOR)

Espécie
Gene de interesse

Ortólogo de Cas9 utilizado

Sequência do exon de interesse

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1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência (Ex. CRISPOR)

Scores utilizados no CRISPOR para análise de eficiência do sgRNA

MIT Score = 0-100. Quanto mais alto, mais específico é o sgRNA e menor a probabilidade de off-targets.
Recomendado >50.
CFD Score = 0-100. Mesmo princípio que MIT. Alguns autores descrevem maior especificidade desse score.
Doench Score = 0-100. Prediz a eficiência do seu sgRNA baseado nos nucleotídeos adjacentes, na
complementaridade da sequência e nos 3 nucleotídeos anteriores à sequência PAM.
Moreno-Mateos = Score baseado em regressão linear de eficiência ,normalmente utilizado para modelo de
injeção em camundongo ou embriões.
Out-of-frame = 0-100. Prediz a porcentagem de clones que vão carregar frameshift causado por deleções
Lindel = 0-100. Prediz a porcentagem de clones que vão carregar frameshift causado por deleções e inserções
Off-targets mismatches = exprime o número de clones que possui 0,1,2,3 ou 4 mismatches (incompatibilidade
de sequência)

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1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência (Ex. CRISPOR)

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência (Ex. CRISPOR)

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência (Ex. CRISPOR)

Utilização da ferramenta Benchling para alinhamento do sgRNA

44 nt de distância do início 42 rev

do exon

132 fw 60 nt de distância do final do exon

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1. Otimizando seu sgRNA e a entrega da Cas9

1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência

2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

3. Escolher a melhor forma de entregar a Cas9 (plasmídeo único, duplo, expressão lentiviral..)

4. Otimizar a transfecção ou transdução do complexo na linhagem de interesse

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

Níveis de regulação da expressão gênica em eucariotos

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2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

NMD é uma via de controle de qualidade que degrada RNAs mensageiros que possuem stop
códons prematuros por conta de mutações causadas por perda do quadro de leitura.

Porém, nem todos os stop códons prematuros desencadeiam o processo de NMD.

Por isso, o NMD determina a eficácia da edição gênica por CRISPR.

Artigo desenvolve um modelo matemático para validação do impacto do NMD.

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2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

Regrinhas de ouro:

1. Regra dos 50nt = Stop códons prematuros com menos de 50 nucleotídeos de

distância do final do exon escolhido geralmente não levam à degradação do mRNA.

2. Regra da proximidade do start códon = Stop códons prematuros com

menos de 150 nucleotídeos de distância do start códon geralmente não levam à
degradação do mRNA.

3. Regra do último exon = Stop códons prematuros no último exon muito

provavelmente não levarão à degradação do mRNA.

4. Regra do exon longo = Exons longos (~400 nucleotídeos) inibem a degradação

do mRNA.

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2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

Regrinhas de ouro:

1. Regra dos 50nt = Stop códons prematuros com menos de 50 nucleotídeos de

distância do final do exon escolhido geralmente não levam à degradação do mRNA.

2. Regra da proximidade do start códon = Stop códons prematuros com

menos de 150 nucleotídeos de distância do start códon geralmente não levam à
degradação do mRNA.

3. Regra do último exon = Stop códons prematuros no último exon muito

provavelmente não levarão à degradação do mRNA.
Não pode errar!

4. Regra do exon longo = Exons longos (~400 nucleotídeos) inibem a degradação

do mRNA.

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1. Otimizando seu sgRNA e a entrega da Cas9

1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência

2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

3. Escolher a melhor forma de entregar a Cas9 (plasmídeo único, duplo, expressão lentiviral..)

4. Otimizar a transfecção ou transdução do complexo na linhagem de interesse

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

3. Escolher a melhor forma de entregar a Cas9 (plasmídeo único, duplo, expressão lentiviral..)

*
Expressão transiente Expressão transiente Expressão estável
Único plasmídeo carregando a Dois plasmídeos, carregando Sistema de expressão lentiviral
Cas9 e sgRNA separadamente a Cas9 e sgRNA

Cas9 sgRNA
Cas9
+sgRNA

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3. Escolher a melhor forma de entregar a Cas9 (plasmídeo único, duplo, expressão lentiviral..)

A técnica CRISPR/Cas9: Aplicações biológicas e desafios em modelos de perda de função

1. Otimizando seu sgRNA e a entrega da Cas9

1. Construir a sequência do sgRNA em softwares de validação de eficiência

2. Verificar se seu sgRNA tem alta probabilidade de induzir a degradação do mRNA

3. Escolher a melhor forma de entregar a Cas9 (plasmídeo único, duplo, expressão lentiviral..)

4. Otimizar a transfecção ou transdução do complexo na linhagem de interesse

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4. Otimizar a transfecção ou transdução do complexo na linhagem de interesse

Invitrogen transfection reagent selection guide

https://www.thermofisher.com/br/

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4. Otimizar a transfecção ou transdução do complexo na linhagem de interesse

Buscar protocolo específico para otimização da transfecção na linhagem de interesse

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2. Validando a eficiência do
construto

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2. Validando a eficiência do construto

Validação do
construto e
Ensaio T7

Análise por
Sequenciamento
RTqPCR ou PCR
off target
convencional
A avaliação acontece
em diferentes níveis
utilizando técnicas
semelhantes ou
complementares

Sequenciamento
Western blotting
on target

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2. Validando a eficiência do construto Validação do
construto

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2. Validando a eficiência do construto
Ensaio T7

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2. Validando a eficiência do construto
Western blotting

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2. Validando a eficiência do construto
Aqui podemos fazer
“screening Western blotting
fenotípico”

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2. Validando a eficiência do construto
Western blotting
JARID DEMETILA STAT3
PERDA DE JARID = METILAÇÃO E INIBIÇÃO DE STAT3

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2. Validando a eficiência do construto Análise por
RTqPCR ou PCR
convencional

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2. Validando a eficiência do construto Análise por
RTqPCR ou PCR
convencional
Possibilidades:
- Identificação da perda do mRNA;

- Sequenciamento do RNA total ou parcial, identificando regiões

perdidas: produção de uma isoforma truncada e não funcional,
perda de sítios de regulação pós traducionais, etc..

Possibilidade:
- Análise quantitativa dos níveis de mRNA com relação ao WT

Limitação:
- Avalia uma pequena sequência do mRNA (~100 pb), o que
dificulta inferir perda total do mRNA.

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2. Validando a eficiência do construto
Sequenciamento
on e off target

Sequenciamento do clone
Sequenciamento do clone Região alvo da cas9 em genes inespecíficos
Região alvo da cas9 no gene de interesse

MYRIP
(NM_001284423.1)

STAT3
STAT3 sgRNA
(NM_139276.2)

DHRS2
STAT3 KO (NM_005794.3)
(SKO)

STAT3 sgRNA

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2. Validando a eficiência do construto
Sequenciamento
on e off target

Cromatograma selvagem
Compatível com a região de alinhamento

Cromatograma do clone de interesse

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2. Validando a eficiência do construto
Sequenciamento
on e off target

Indels percentage pvalue

+1 54.90 0
+2 1.60 0.0087
+3 23.50 0
+10 11.50 2.4e-89

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3. Considerando as características
da linhagem e problemáticas
fenotípicas da seleção clonal

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3. Considerando as características da linhagem

Células cancerígenas acumulam mutações e

reprogramações metabólicas de maneira distinta

HepG2 PC-3
Hepatocarcinoma Carcinoma de próstata

Linhagem A
Linhagem B
Neuro-2a A549
Neuroblastoma Adenocarc. de pulmão
Linhagem C

Linhagem D

Hanahan D. Weinberg R.A.. Cell. 2000; Linhagem E

DOI: https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81683-9

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3. Problemáticas fenotípicas da seleção clonal

A população de células da linhagem de interesse já é heterogênea por si só

A seleção clonal seleciona genótipos e fenótipos isolados que podem interferir no resultado

Giuliano et al., Curr Protoc Mol Biol., 2019.

DOI: 10.1002/cpmb.100
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 4. Garantindo que o fenótipo
obtido é dependente da inativação
do gene de interesse

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4. Garantindo que o fenótipo obtido é dependente da inativação do gene de interesse

siRNA e shRNA

Inibidor da
“Rescue” por
proteína de
expressão lentiviral
interesse

Agonista e
“Rescue”
antagonista de
(superexpressão)
receptores

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 O CRISPR é uma técnica extremamente robusta
que revolucionou a modulação da expressão
gênica

Apesar de todas as vantagens, a técnica apresenta

não só limitações, mas desafios que precisam ser
explorados para a obtenção de um modelo de
sucesso

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Um modelo sem a perda total da expressão gênica
ainda é um modelo de sucesso

É preciso cautela: se aplicações em linhagens

celulares já apresentam desafios, como extrapolar
esses efeitos em organismos humanos?

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OBRIGADA!
apm.morelli@gmail.com

http://lattes.cnpq.br/7516500460877969