JOSIANE ROCHA STOCCO DE OLIVEIRA

EDIÇÃO GENÉTICA COM CRISPR: IMPLICAÇÕES PARA A LONGEVIDADE E

ENVELHECIMENTO SAUDÁVEL
ESTUDO DOS GENES FOXO3A, APOE E CETP

PONTA GROSSA - PARANÁ

2023
 FACULESTE - FACULDADE DO LESTE MINEIRO

JOSIANE ROCHA STOCCO DE OLIVEIRA

EDIÇÃO GENÉTICA COM CRISPR: IMPLICAÇÕES PARA A LONGEVIDADE E

ENVELHECIMENTO SAUDÁVEL
ESTUDO DOS GENES FOXO3A, APOE E CETP

Monografia apresentada à FACULESTE –

Faculdade do Leste Mineiro, como parte das
exigências para a obtenção do título de Pós-
graduado em Biotecnologia (lato sensu)
Orientadora: Prof. Dra. Marieta T. de Abreu Assis

PONTA GROSSA - PARANÁ

2023
 SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................... 5
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 6
1.1 DEFINIÇÃO DE CRISPR....................................................................................... 6
1.2 HISTÓRIA DA DESCOBERTA E DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA............... 7
1.3 IMPORTÂNCIA E POTENCIAL DA CRISPR NA PESQUISA CIENTÍFICA........... 8
2. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA CRISPR ............................................................... 9
2.1 EDIÇÃO DE GENES EM CÉLULAS E ORGANISMOS........................................ 10
2.2 USO DA CRISPR EM TERAPIA GÊNICA............................................................ 12
2.3 APLICAÇÕES DA CRISPR EM PESQUISAS SOBRE LONGEVIDADE E
ENVELHECIMENTO................................................................................................. 13
3. APLICAÇÕES DA TÉCNICA CRISPR................................................................. 14
3.1 EDIÇÃO DE GENES EM CÉLULAS E ORGANISMOS.......................................14
3.2 USO DA CRISPR EM TERAPIA GÊNICA...........................................................16
3.3 APLICAÇÕES DA CRISPR EM PESQUISAS SOBRE LONGEVIDADE E
ENVELHECIMENTO..................................................................................................16
4. GENES RELACIONADOS À LONGEVIDADE......................................................17
4.1 FOXO3A, APOE E CETP: DESCRIÇÃO, FUNÇÃO E RELAÇÃO COM A
LONGEVIDADE.................................................................................................... .....18
4.2 ESTUDOS SOBRE A EXPRESSÃO DESSES GENES EM POPULAÇÕES
LONGEVAS................................................................................................................19
4.3 POSSÍVEIS APLICAÇÕES DA CRISPR NA EDIÇÃO DOS GENES FOXO3A,
APOE e CETP PARA PROMOVER O ENVELHECIMENTO
SAUDÁVEL................................................................................................................ 20
5. ÉTICA E SEGURANÇA NA APLICAÇÃO DA TÉCNICA CRISPR........................21
5.1 A TÉCNICA DE BASE EDITION, DE GAUDELLI, KOMOR E REES (2017) ...... 23
5.2 PREOCUPAÇÕES ÉTICAS EM RELAÇÃO À EDIÇÃO DE GENES EM
HUMANOS................................................................................................................ 24
5.3 QUESTÕES DE SEGURANÇA NA APLICAÇÃO DA CRISPR EM TERAPIA
GÊNICA E PESQUISA............................................................................................... 25
6. METODOLOGIAS............................................................................................... 27
6.1 METODOLOGIA UTILIZADA PARA A ESCRITA DO TRABALHO TÉCNICO ... 27
6.2 METODOLOGIA DA PRÁTICA PROFISSIONAL PARA REALIZAÇÃO DA
TÉCNICA .................................................................................................................. 29
7. RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................... 31
8. CONCLUSÃO........................................................................................................ 32
8.1 PERSPECTIVAS FUTURAS PARA A APLICAÇÃO DA CRISPR EM PESQUISAS
SOBRE LONGEVIDADE E ENVELHECIMENTO SAUDÁVEL.................................. 33
REFERÊNCIAS .................................................................................................... .. 36
RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo investigar o potencial da técnica de

edição genética CRISPR-Cas9 na promoção da longevidade humana por meio da
análise dos genes FOXO3A, APOE e CETP e demonstrar como ocorre a técnica de
base editing. Para isso, foi realizada uma revisão sistemática da literatura científica,
com a coleta de dados sobre a expressão desses genes em populações longevas e
sua relação com a longevidade, bem como sobre as técnicas de edição genética,
incluindo a CRISPR, e sua aplicação em pesquisas sobre longevidade e
envelhecimento saudável. Os resultados indicam que a técnica CRISPR-Cas9 e a
técnica de base editing apresenta um grande potencial na edição de genes
relacionados à longevidade, entretanto, ainda há muito a ser estudado para garantir a
segurança e eficácia do seu uso em humanos. Além disso, foram discutidas questões
éticas e de segurança relacionadas à aplicação da técnica CRISPR em humanos.
Destaca-se a importância de aprofundar a análise das perspectivas futuras para a
aplicação da CRISPR em pesquisas sobre longevidade e envelhecimento saudável.
Conclui-se que a edição de genes pode ser uma ferramenta poderosa para a
promoção da longevidade, mas que é necessário um estudo mais aprofundado sobre
seus efeitos e possíveis limitações. A técnica de edição genética CRISPR e a técnica
de base editing tem revolucionado a pesquisa científica e prometem impactar a saúde
humana de diversas formas, tanto para a edição de genes, quanto para a polêmica
melhoria genética de bebês.

Palavras-chave: CRISPR, edição genética, longevidade, envelhecimento saudável,

gene FOXO3A, gene APOE, gene CETP, técnica de base editing, ética, segurança.
1. INTRODUÇÃO

O envelhecimento populacional é um fenômeno mundial e a busca por uma

vida saudável e longeva é crescente. A edição de genes surge como uma
possibilidade de modificar a genética humana para a prevenção e tratamento de
doenças genéticas, incluindo retardar o envelhecimento.
Dessa forma, o presente estudo visa demonstrar o uso da técnica CRISPR-
Cas9, mais especificamente com relação à edição dos genes FOXO3A, APOE e CETP
em relação à longevidade.
Para tanto, foi realizada uma revisão de literatura sobre a técnica CRISPR-
Cas9 com os genes que mais se destacaram, até o presente momento, na relação
com a longevidade.
Foram comparados os estudos já existentes, de diferentes autores, sobre a
expressão desses genes em populações longevas e sua relação com a longevidade,
assim como apresentadas, resumidamente, as técnicas de edição genética, incluindo
a CRISPR-Cas9 e sua aplicação em pesquisas sobre longevidade e envelhecimento
saudável.
Ressalta-se que o objetivo central deste estudo foi apresentar as contribuições
teóricas e práticas mais recentes sobre o uso da técnica CRISPR-Cas9 na edição dos
genes FOXO3A, APOE e CETP com relação à longevidade com o objetivo de
contribuir para o conhecimento acadêmico nessa área de pesquisa.

1.1 DEFINIÇÃO DE CRISPR

A técnica CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic

Repeats) é um sistema de edição de genes revolucionário que tem despertado grande
interesse na comunidade científica. Ela se baseia em um mecanismo de defesa
natural presente em bactérias que utilizam sequências repetitivas de DNA e
espaçadores para armazenar fragmentos de DNA de invasores virais. A partir desse
mecanismo inicial, essas sequências CRISPR são transcritas em RNA guia (sgRNA),
que se ligam à enzima Cas9, formando um complexo que é capaz de reconhecer e
cortar o DNA em locais específicos.

6
 A técnica CRISPR permite a inserção, remoção ou substituição de genes em
uma variedade de organismos, incluindo os seres humanos. Dessa forma, é possível
corrigir defeitos genéticos que causariam doenças, a posteriori; desenvolver novos
tratamentos para enfermidades genéticas e, num futuro bem próximo, se conseguirá
melhorar as características físicas ou mentais de indivíduos.
Assim, pode-se afirmar que a técnica CRISPR, dentro do âmbito da ciência, é
uma área relativamente nova e ainda há muito a ser aprendido sobre seu uso seguro
e eficaz em seres humanos. Outra questão de suma importância a que os
pesquisadores e geneticistas deverão considerar será as implicações éticas e sociais
da edição genética, garantindo sempre que ela seja usada de maneira responsável e
benéfica para toda humanidade.
Partindo dessas definições iniciais, pode-se afirmar que a técnica CRISPR é
uma ferramenta poderosa que promete revolucionar a medicina e a biotecnologia, mas
é essencial que sejam realizados estudos cuidadosos tanto para garantir sua
segurança com a efetividade no uso em seres humanos.

1.2 HISTÓRIA DA DESCOBERTA E DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA

A história da descoberta e desenvolvimento da técnica CRISPR foi marcada

por uma série de avanços e descobertas em diferentes áreas da biologia. Em 1987,
um grupo de cientistas identificou pela primeira vez sequências repetitivas de DNA em
bactérias, que ficaram conhecidas como CRISPR (Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats).
No entanto, somente em 2005, pesquisadores descobriram que essas
sequências eram utilizadas pelas bactérias para se defender contra a invasão de
vírus. A partir dessa descoberta, cientistas começaram a investigar a possibilidade de
adaptar a técnica CRISPR para a edição genética em células de mamíferos.
No ano de 2012, Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier publicaram um
estudo na revista Science demonstrando que a técnica poderia ser usada para editar
genes em células humanas. Esse estudo abriu caminho para uma série de avanços
em pesquisas de diferentes campos da biologia, incluindo a investigação da
longevidade e do envelhecimento saudável.

7
 Desde então, a técnica CRISPR tem sido amplamente utilizada em pesquisas
de diversas áreas da biologia, permitindo a edição de genes em plantas, animais e,
até mesmo, em seres humanos. Sua capacidade de cortar o DNA em locais
específicos e inserir, remover ou substituir genes tem o potencial de revolucionar a
medicina, permitindo a correção de mutações genéticas que causam doenças e
abrindo caminho para tratamentos mais precisos e personalizados.
Assim, a história da CRISPR é marcada por descobertas e avanços em
diferentes áreas da biologia, que permitiram o desenvolvimento de uma técnica
revolucionária capaz de editar genes de forma precisa e eficiente.

1.3 IMPORTÂNCIA E POTENCIAL DA CRISPR NA PESQUISA CIENTÍFICA

A técnica CRISPR tem sido amplamente utilizada em pesquisas de diversos

campos da biologia, incluindo a investigação da longevidade e do envelhecimento
saudável. A técnica permite a edição precisa de genes em células e organismos,
permitindo a investigação de suas funções e o desenvolvimento de terapias gênicas
para diversas doenças genéticas. Além disso, a CRISPR também tem potencial para
a modificação de características em plantas e animais, permitindo o desenvolvimento
de culturas mais resistentes e animais mais saudáveis. O potencial da técnica CRISPR
é enorme, sabe-se que pode transformar a pesquisa científica e a saúde humana.
Esta técnica tem se mostrado de grande importância para a pesquisa científica
devido à sua capacidade de editar genes de forma precisa e eficiente. Isso permite a
investigação de diversas funções genéticas em células e organismos, além de ser
uma ferramenta promissora no desenvolvimento de terapias gênicas para diversas
doenças genéticas. A precisão da técnica permite a correção de mutações genéticas
específicas, evitando efeitos colaterais indesejados.
Além disso, a CRISPR tem um grande potencial na modificação de
características em plantas e animais. A edição genética em plantas pode permitir o
desenvolvimento de culturas mais resistentes e adaptadas a condições adversas,
contribuindo para a segurança alimentar e a sustentabilidade ambiental. Já a edição
genética em animais pode levar ao desenvolvimento de animais mais saudáveis e

8
resistentes a doenças, além de melhorar a qualidade de produtos derivados desses
animais, como a carne e o leite.
O potencial da técnica CRISPR é enorme e pode transformar a pesquisa
científica e a saúde humana. No entanto, o uso da técnica também deve ser
acompanhado de ética e precaução, a fim de garantir que os benefícios superem os
riscos, tema que será abordado com maior aprofundamento em item específico.

2. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA CRISPR

"A edição de genes com a tecnologia CRISPR é uma área de pesquisa em

rápida expansão e promete uma nova era de tratamento de doenças
genéticas" (LIANG & ZHANG, 2018)”.

A técnica CRISPR foi baseada em um sistema imunológico encontrado em

bactérias, sistema este que as ajuda a se defender contra invasores estranhos, como
os vírus. Esse sistema é composto por duas moléculas: RNA guia (sgRNA) e a enzima
Cas9. O RNA guia é responsável por localizar o trecho específico do DNA a ser
editado, enquanto a enzima Cas9 corta o DNA nesse local. A partir daí, as células
podem reparar o DNA de duas maneiras: a primeira é a junção imprecisa, que leva à
inativação do gene, e a segunda é a substituição do gene defeituoso por uma versão
saudável.
A técnica CRISPR tem sido utilizada em estudos sobre longevidade e
envelhecimento, em particular para investigar genes específicos associados a esses
processos. Entre os genes estudados estão o FOXO3A, que está associado à
longevidade saudável em humanos, o APOE, que está relacionado à doença de
Alzheimer, e o CETP, que está ligado à doença cardiovascular. A edição desses genes
com a técnica CRISPR pode fornecer informações importantes sobre a função desses
genes e sua relação com o envelhecimento e doenças relacionadas. Além disso, a
técnica CRISPR tem o potencial de ser utilizada para desenvolver terapias para
doenças relacionadas ao envelhecimento, como a doença de Alzheimer e doenças
cardiovasculares.
A técnica CRISPR utiliza um sistema de RNA-guiado para reconhecer e cortar
o DNA em locais específicos. O processo começa com a criação de um RNA-guia que

9
contém uma sequência complementar ao DNA que se deseja editar. Em seguida, o
RNA-guia se liga à enzima Cas9, formando um complexo RNA-Cas9 que reconhece
e corta o DNA em locais específicos.
Após o corte do DNA, a célula pode utilizar mecanismos de reparo para corrigir
o material genético ou introduzir alterações específicas na sequência de DNA. A
técnica CRISPR tem a vantagem de ser altamente precisa e eficiente, permitindo a
edição de genes em uma ampla variedade de organismos.
A técnica tem sido utilizada para estudar a função de genes em modelos
animais, bem como para o desenvolvimento de terapias gênicas para doenças
genéticas humanas. A CRISPR também tem potencial para a criação de plantas e
animais mais resistentes e saudáveis, contribuindo para a segurança alimentar e o
bem-estar animal.
Embora a técnica CRISPR apresente um grande potencial, também existem
preocupações com relação à sua segurança e possíveis efeitos colaterais. Por esse
motivo, a técnica deve ser utilizada com cuidado e com atenção aos riscos envolvidos.

2.1 EDIÇÃO DE GENES EM CÉLULAS E ORGANISMOS

A técnica CRISPR utiliza a enzima Cas9 para cortar o DNA em locais

específicos e permitir a inserção, remoção ou substituição de genes. A Cas9 é
direcionada para o local desejado por meio de uma sequência de RNA guia (sgRNA)
que se liga ao DNA complementar. Quando a Cas9 se liga ao DNA, ocorre um corte
duplo que pode levar à inserção ou deleção de nucleotídeos, ou à substituição de um
gene inteiro.
Ela é realizada no laboratório de biotecnologia por meio de algumas etapas
principais:
I- ESCOLHA DO ALVO - a primeira etapa é a escolha do alvo a ser editado no
genoma. Isso pode ser feito por meio do uso de sequências de guia RNA (sgRNA),
que se ligam a regiões específicas do DNA que devem ser editadas.

II- MODIFICAÇÃO DAS CÉLULAS-ALVO: em seguida, as células-alvo são

modificadas para expressar a enzima Cas9, que é a responsável por cortar o DNA no
local específico determinado pela sgRNA.

10
 Após a expressão de Cas9, as células são expostas ao sgRNA e a Cas9,
permitindo que a enzima se ligue ao DNA e corte-o no local específico.

III- INSERÇÃO, REMOÇÃO OU SUBSTITUIÇÃO DE SEQUÊNCIAS NO DNA:

em seguida, a célula é capaz de reparar o corte de várias maneiras, que podem ser
aproveitadas para inserir, remover ou substituir sequências de DNA. Lembrando que
a Cas9 é programada para reconhecer uma sequência específica de DNA em um
genoma e cortar a fita de DNA nesse local. O objetivo é introduzir uma modificação
no DNA, seja adicionando, removendo ou substituindo um gene, por exemplo.
A técnica CRISPR utiliza a enzima Cas9 para cortar o DNA em locais
específicos e permitir a inserção, remoção ou substituição de genes. A Cas9 é
direcionada para o local desejado por meio de uma sequência de RNA guia (sgRNA)
que se liga ao DNA complementar. Quando a Cas9 se liga ao DNA, ocorre um corte
duplo que pode levar à inserção ou deleção de nucleotídeos, ou à substituição de um
gene inteiro.
Existem diferentes maneiras de realizar a técnica CRISPR em laboratório, e o
profissional deve escolher a melhor abordagem de acordo com a finalidade da edição
genética. Algumas das opções incluem o uso de vetores de entrega de RNA guia e
Cas9, a edição genética em células-tronco e o uso de Cas9 modificada para controlar
a expressão de genes.
Independentemente da abordagem escolhida, é importante que o profissional
tenha um amplo conhecimento da técnica CRISPR e da biologia molecular para
garantir que a edição genética seja realizada com segurança e eficiência. Além disso,
é necessário tomar cuidado com a possibilidade de efeitos indesejados no genoma,
uma vez que a edição de um gene pode afetar a expressão de outros genes próximos.
A técnica CRISPR representa um grande avanço na biotecnologia e tem sido
utilizada em diversas áreas da pesquisa científica, como na identificação e tratamento
de doenças genéticas. A capacidade de editar o genoma com precisão permite a
compreensão da função de genes específicos e a possibilidade de desenvolvimento
de terapias gênicas para diversas doenças. No entanto, é importante que a técnica
seja utilizada com cautela e ética, considerando os possíveis impactos a longo prazo.

11
2.2 USO DA CRISPR EM TERAPIA GÊNICA

A terapia gênica utilizando a técnica CRISPR envolve a entrega da enzima

Cas9 e do RNA guia diretamente nas células afetadas pela doença. Isso pode ser feito
por meio de vetores virais ou outras técnicas de entrega de genes. Quando a enzima
Cas9 se liga ao DNA, ocorre um corte no local desejado, permitindo a substituição ou
correção do gene defeituoso.
A terapia gênica com a técnica CRISPR tem sido utilizada em modelos animais
com sucesso e os resultados têm sido promissores para o tratamento de diversas
doenças genéticas humanas. No entanto, ainda há muitos desafios a serem
enfrentados antes que a técnica possa ser utilizada com segurança e eficácia em
seres humanos. É necessário entender completamente os efeitos da edição genética
no organismo, garantir que as células-alvo sejam tratadas com segurança e avaliar os
riscos potenciais da terapia.
A técnica CRISPR/Cas9 também tem sido amplamente utilizada em pesquisas
relacionadas a diversas doenças, incluindo o câncer de mama, como demonstrado
por FAGUNDES, CASTRO, ANDRADE E MILLEN (2021).
Em relação à terapia gênica, GOMES E MOURA (2020) apontam que “a técnica
CRISPR/Cas9 possui grande potencial para o tratamento de doenças genéticas”.
Sabe-se que a técnica CRISPR tem o potencial de revolucionar a terapia gênica
e o tratamento de doenças genéticas, atualmente incuráveis. No entanto, é necessário
realizar mais pesquisas para garantir a segurança e a efetividade (eficiência + eficácia)
da técnica em seres humanos, lembrando sempre de considerar as implicações éticas
e sociais do uso da técnica.

2.3 APLICAÇÕES DA CRISPR EM PESQUISAS SOBRE LONGEVIDADE E

ENVELHECIMENTO

A técnica CRISPR também tem sido utilizada em pesquisas sobre longevidade

e envelhecimento saudável, objeto principal deste estudo.
Verificou-se, a partir do estudo de alguns autores de renome internacional, que
a edição de genes pode ser usada para alterar a expressão de genes específicos,
relacionados à longevidade como: FOXO3A, APOE e CETP, bem como investigar seu
papel na regulação do envelhecimento. Além disso, a técnica pode ser utilizada para
12
o desenvolvimento de terapias para tratamento de doenças relacionadas ao
envelhecimento, como a doença de Alzheimer e a "doença arterial coronariana" (DAC)
ou "aterosclerose", muito descrita na área médica utilizando-se um termo mais antigo
denominado de “arteriosclerose”.
Importante ressaltar, aqui, que a técnica CRISPR também tem sido utilizada
em pesquisas sobre como ter um envelhecimento saudável se aprofundando nas
doenças associadas a ele. Lembrando que o envelhecimento saudável pode ser
influenciado por vários fatores, incluindo fatores genéticos e ambientais, e a técnica
CRISPR pode ser utilizada para investigar o papel desses fatores na regulação da
longevidade.
Uma das aplicações mais recentes da técnica CRISPR em pesquisas sobre
envelhecimento foi a edição de genes relacionados à “senescência celular”. A
senescência celular é um processo pelo qual as células deixam de se dividir e se
tornam inativas, tendo sido associada a vários efeitos negativos do envelhecimento,
como a perda de massa muscular e a diminuição da capacidade de cicatrização de
feridas.
Já verificou-se que a técnica CRISPR pode ser utilizada para interromper o
processo de senescência celular e promover um envelhecimento saudável, bem como
ela tem sido utilizada para estudar o papel dos telômeros na regulação do
envelhecimento. Os telômeros são sequências repetitivas de DNA que protegem as
extremidades dos cromossomos.
À medida que as células se dividem, os telômeros se encurtam e essa redução
tem sido associada ao envelhecimento e às doenças relacionadas à idade. A técnica
CRISPR pode ser utilizada para estudar o papel dos telômeros na regulação da
longevidade, aprofundar os estudos de como eles se comportam e também, proceder
com uma análise mais aprofundada destes, como que procedendo com uma
“engenharia reversa”, analisando como eles encurtam e tentar reverter este processo
com o objetivo de alterar o comprimento dos telômeros, investigando seus efeitos
sobre o envelhecimento.
Em resumo, a técnica CRISPR tem várias aplicações em pesquisas sobre
longevidade e envelhecimento saudável, incluindo a edição de genes relacionados à
longevidade, a terapia gênica para doenças relacionadas à idade, a interrupção da
senescência celular e a investigação do papel dos telômeros na regulação da
longevidade.

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3. APLICAÇÕES DA TÉCNICA CRISPR

O potencial da técnica CRISPR para a pesquisa sobre o envelhecimento

saudável é enorme e pode levar a avanços significativos na compreensão e
tratamento das doenças relacionadas à idade.
A técnica CRISPR é uma das mais revolucionárias descobertas da
biotecnologia nos últimos anos. Sua capacidade de editar, precisamente, o DNA de
células e organismos tem um enorme potencial para a cura de doenças genéticas e a
melhoria da qualidade de vida das pessoas. Além disso, a técnica tem sido utilizada
em pesquisas em diversos campos da biologia, incluindo a investigação da
longevidade e do envelhecimento saudável.
Este estudo apresentará uma visão geral dos fundamentos da técnica CRISPR,
bem como suas aplicações em terapia gênica e pesquisas sobre longevidade e
envelhecimento. As seções seguintes se concentrarão, especificamente, na edição de
genes em células e organismos, explorando como a técnica é realizada em laboratório
e os possíveis impactos dessa edição genética.

3.1 EDIÇÃO DE GENES EM CÉLULAS E ORGANISMOS

“A CRISPR é uma ferramenta poderosa e versátil que pode ser usada para
editar genes e explorar a biologia dos sistemas vivos" (Doudna & Charpentier,
2014).”

A técnica CRISPR-Cas9 tem sido amplamente utilizada na edição de genes em

células e organismos. A edição genética envolve a introdução de mudanças no DNA
de um organismo incluindo a correção de mutações, a introdução de novos genes ou
a remoção de genes defeituosos. Ela permite a edição precisa de genes em células e
organismos, tornando-se uma ferramenta valiosa para pesquisadores, em diversas
áreas.
Sabe-se que a mesma é capaz de gerar alterações precisas no DNA, tornando
possível corrigir mutações em pacientes com doenças genéticas. Por exemplo, a
técnica tem sido utilizada, também, para tratar doenças como a anemia falciforme e a
doença de Huntington, que são causadas por mutações específicas em genes.
Nesses casos, a edição genética permite a correção dessas mutações, oferecendo a

14
possibilidade de cura para tais doenças que, anteriormente, eram tidas como
incuráveis.
A técnica CRISPR tem sido utilizada em pesquisas para investigar o papel de
genes específicos em diversas doenças e características. Isso inclui a investigação
de genes relacionados a doenças cardiovasculares, doenças neurológicas e doenças
metabólicas. A edição de genes também pode ser usada para estudar as vias
moleculares envolvidas em processos biológicos, permitindo a compreensão de como
os genes funcionam e como eles são regulados.
Também tem sido aplicada no estudo de diversos organismos, incluindo
bactérias, plantas, animais e humanos. Quanto à edição de genes em plantas e
animais, mostrou-se com um potencial de aumentar a produção de alimentos,
melhorar a resistência de plantas e animais a doenças e aumentar a produtividade
agrícola.
Em seres humanos, a técnica tem o potencial de curar doenças genéticas e
melhorar a saúde de indivíduos portadores de mutações genéticas, bem como, num
futuro próximo, definir características físicas e mentais na geração de bebês mais
sadios o que, neste caso, fez com que a sociedade, em geral, firmasse um discurso
ético mais acirrado e, quase polêmico, junto aos pesquisadores da área devido à
possibilidade da escolha de características diferenciadas como: cor dos olhos, tipo e
cor de cabelos, estatura, padrões elevados de QI, etc, estes definidos como “edição
de genes germinativos”, pois afetam a linhagem celular de um indivíduo e podem ser
transmitidos para as gerações futuras.

3.2 USO DA CRISPR EM TERAPIA GÊNICA

A terapia gênica é uma área da biotecnologia que tem como objetivo tratar
doenças genéticas através da manipulação do material genético do paciente utilizando
a CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) permitindo a
substituição de um gene defeituoso por um gene funcional, a correção de mutações
específicas ou a alteração da expressão de genes relacionados a doenças.
No caso da substituição de um gene defeituoso por um gene funcional, ela corta
a sequência de DNA que contém a mutação responsável pela doença e, em seguida,
insere uma sequência de DNA saudável no local. Esse processo pode ser realizado

15
em células do paciente fora do corpo (ex vivo), como em células da medula óssea, ou
diretamente no corpo (in vivo), como em tecidos do fígado.
Por exemplo, na hemofilia, uma doença hereditária que causa sangramento
excessivo devido à deficiência de fatores de coagulação sanguínea, a técnica CRISPR
pode ser usada para corrigir a mutação que causa a deficiência de fatores de
coagulação. Dessa forma, é possível restaurar a produção normal de fatores de
coagulação no sangue, o que pode levar à cura da doença.
No entanto, há desafios a serem enfrentados na aplicação da técnica CRISPR
em terapia gênica. Um dos maiores desafios é a entrega eficiente da enzima Cas9 e
do RNA guia na célula-alvo. Isso requer a utilização de vetores de entrega eficazes
que possam levar a enzima e o RNA guia para o local desejado no genoma. Além
disso, a possibilidade de efeitos indesejados no genoma deve ser considerada com
cuidado para garantir a segurança do paciente.

3.3 APLICAÇÕES DA CRISPR EM PESQUISAS SOBRE LONGEVIDADE E

ENVELHECIMENTO

A técnica CRISPR tem sido utilizada em pesquisas sobre longevidade e

envelhecimento saudável para investigar o papel de genes específicos na regulação
do envelhecimento e para o desenvolvimento de terapias para doenças relacionadas
ao envelhecimento.
Ela pode ser usada para alterar a expressão de genes relacionados à
longevidade como FOXO3A, APOE e CETP e investigar seu papel na regulação do
envelhecimento.
Importante ressaltar que a pesquisa na área de longevidade e envelhecimento
saudável ainda é um campo em desenvolvimento e há muitos desafios a serem
enfrentados. Um dos principais é a compreensão das interações complexas entre
diferentes genes e os processos biológicos envolvidos no processo de
envelhecimento. Ainda há muito a ser descoberto e explorado para que a técnica
CRISPR possa ser efetivamente utilizada na pesquisa sobre longevidade e
envelhecimento saudável.
Nos tópicos posteriores abordar-se-ão, com maior profundidade, os três genes
escolhidos neste estudo sobre longevidade utilizando a técnica CRISPR.

16
4. GENES RELACIONADOS À LONGEVIDADE

O processo de envelhecimento é um fenômeno complexo e multifatorial,

envolvendo diversos fatores genéticos e ambientais. A longevidade, por sua vez, é
influenciada por diversos genes que atuam em diferentes processos biológicos como
o metabolismo, a reparação celular e a resposta ao estresse oxidativo.
Estudos têm demonstrado que a manipulação de genes específicos pode
prolongar a vida útil de diversos organismos, incluindo pesquisas a partir de
camundongos e moscas da fruta.
Camundongos e moscas da fruta são frequentemente utilizados como modelos
de estudo em pesquisas científicas porque possuem características biológicas
semelhantes às dos seres humanos, além de apresentarem vantagens em relação à
ética e ao custo envolvidos em pesquisas com humanos.
Os camundongos são frequentemente usados como modelos em pesquisas
biomédicas porque possuem um genoma semelhante ao dos seres humanos e uma
fisiologia comparável. Além disso, é possível manipular geneticamente os
camundongos para que desenvolvam doenças específicas, o que permite o estudo de
doenças humanas em um ambiente controlado. Os camundongos também têm um
ciclo de vida relativamente curto, o que permite que os pesquisadores estudem as
doenças ao longo do tempo de uma forma mais rápida e eficiente. Outra vantagem
dos camundongos é que eles podem ser mantidos em ambientes controlados e sua
reprodução pode ser facilmente controlada, o que torna os estudos mais confiáveis.
As moscas da fruta também são amplamente utilizadas em pesquisas
científicas, especialmente na área da genética, porque compartilham muitos dos
genes e vias metabólicas dos seres humanos. A vantagem das moscas da fruta em
relação aos camundongos é que elas são organismos muito mais simples e mais
fáceis de manipular geneticamente. Além disso, as moscas da fruta têm um ciclo de
vida muito curto, o que permite que os pesquisadores estudem os efeitos de
determinadas mutações genéticas de forma mais eficaz.
Embora os camundongos e as moscas da fruta sejam modelos animais valiosos
em pesquisas científicas, eles não são seres humanos e, portanto, nem todas as
descobertas feitas nesses modelos podem ser diretamente aplicadas aos seres
humanos. Portanto, nesta área, será necessário continuar a pesquisa em seres
humanos para validar e confirmar as descobertas feitas em modelos animais.

17
 Neste estudo proposto, que teve como base os genes relacionados à
longevidade, concentrando-se nos genes FOXO3A, APOE e CETP, pois estes
apresentam papel importante na regulação do metabolismo lipídico, inflamação e
estresse oxidativo.
A análise dos genes associados à longevidade é um tema de grande interesse
na atualidade, uma vez que a busca por estratégias para promover um
envelhecimento saudável tem sido objeto de estudo de diversos pesquisadores.
O gene FOXO3A está envolvido em diversos processos celulares, como a
regulação da resposta inflamatória e do estresse oxidativo, além de ser associado à
longevidade em diversos organismos. Já o gene APOE é conhecido por estar
relacionado à metabolização do colesterol e ao risco de doenças cardiovasculares,
mas também tem sido associado à longevidade em estudos epidemiológicos. Por fim,
o gene CETP tem papel importante na regulação do metabolismo lipídico e do
transporte do colesterol, sendo também objeto de estudo em pesquisas sobre
longevidade.
Diante da importância desses três genes no contexto da longevidade e do
envelhecimento saudável, é fundamental compreender suas funções e como estão
relacionados com os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. A
descrição desses genes e de suas funções, assim como a compreensão de sua
relação com a longevidade será o foco deste capítulo.

4.1 FOXO3A, APOE E CETP: DESCRIÇÃO, FUNÇÃO E RELAÇÃO COM A

LONGEVIDADE
"Os genes FOXO3A, APOE e CETP têm sido amplamente estudados em
relação à longevidade e envelhecimento saudável" (García-Lozano et al.,
2019).”

Como já dito, os genes FOXO3A, APOE e CETP são genes que apresentam
uma relação com a longevidade e têm sido amplamente estudados em pesquisas
sobre envelhecimento saudável. Esses estudos incluem a análise da expressão
desses genes em populações longevas, a fim de investigar a relação entre a
expressão dos genes e a longevidade. Além disso, a investigação da função desses
genes e sua relação com o envelhecimento tem sido objeto de muitas pesquisas.
Com base nas referências deste estudo, é possível extrair citações que
abordam diversos aspectos relacionados à técnica de edição genômica

18
CRISPR/Cas9, bem como quanto aos genes FOXO3A, APOE e CETP e as questões
éticas e de segurança envolvidas nessa tecnologia.
No livro "The hallmarks of aging", de GREY (2015), o autor destaca a
importância da identificação dos processos moleculares que contribui para o
envelhecimento, sendo que a utilização de tecnologias de edição genômica, como a
CRISPR/Cas9, pode contribuir para a compreensão desses processos.
Em relação ao gene FOXO3A, estudos realizados por ZHANG, WANG E
WANG (2018) mostraram que a regulação desse gene está relacionada ao processo
de envelhecimento, sendo que sua expressão pode influenciar a longevidade das
células. Já em relação ao gene APOE, diversos estudos têm abordado sua relação
com a doença de Alzheimer, como destacado por DI CARLO E GIACOMAZZA (2018),
que ressaltam o papel do APOE como fator de risco para a doença.
O gene FOXO3A, por exemplo, tem sido associado a uma maior longevidade
em várias espécies, incluindo humanos. Estudos mostraram que a expressão do gene
FOXO3A é maior em populações longevas, sugerindo que sua atividade pode
desempenhar um papel na regulação do envelhecimento. Além disso, a variação
genética no gene FOXO3A tem sido associada a diferenças na expectativa de vida
em humanos.
O gene APOE também tem sido amplamente estudado em relação à
longevidade e envelhecimento saudável. Estudos mostraram que as pessoas com a
variante APOE ε4 têm um risco aumentado de desenvolver doença de Alzheimer,
enquanto que as pessoas com a variante APOE ε2 têm um risco reduzido. Além disso,
a variação genética no gene APOE tem sido associada a diferenças na expectativa
de vida em humanos.
O gene CETP, por sua vez, tem sido associado a um risco reduzido de doenças
cardiovasculares e uma maior longevidade. Estudos mostraram que as pessoas com
a variante CETP TaqIB têm um risco reduzido de doenças cardiovasculares e uma
maior longevidade. Além disso, a variação genética no gene CETP tem sido associada
a diferenças na expectativa de vida em humanos.
Em resumo, os genes FOXO3A, APOE e CETP apresentam uma relação com
a longevidade e têm sido amplamente estudados em pesquisas sobre envelhecimento
saudável. A análise da expressão desses genes em populações longevas tem
fornecido informações valiosas sobre sua relação com a longevidade e a regulação
do envelhecimento.

19
4.2 ESTUDOS SOBRE A EXPRESSÃO DESSES GENES EM POPULAÇÕES
LONGEVAS

Estudos têm demonstrado que a expressão desses genes é diferente em

populações longevas em comparação com populações mais jovens, o que sugere que
a expressão desses genes pode estar relacionada com o envelhecimento saudável.
Por exemplo, a expressão do gene FOXO3A é significativamente maior em indivíduos
que vivem mais de 100 anos em comparação com indivíduos mais jovens, indicando
que o gene pode estar envolvido na regulação do envelhecimento e na prevenção de
doenças relacionadas à idade.
Ainda, estudos recentes têm mostrado que variantes genéticas no gene APOE
estão associadas a uma maior longevidade em algumas populações. Indivíduos com
a variante APOE4, por exemplo, apresentam uma menor mortalidade por doença
cardiovascular e por câncer. Esses estudos sugerem que a expressão desses genes
pode ser um fator importante na regulação do envelhecimento saudável.
Outros estudos têm investigado a relação entre a expressão desses genes e
fatores de estilo de vida que podem influenciar a longevidade. Por exemplo, um estudo
realizado com indivíduos com mais de 100 anos mostrou que a expressão do gene
FOXO3A é influenciada por fatores como dieta e atividade física. Indivíduos que
seguiam uma dieta saudável e praticavam exercícios físicos regularmente
apresentavam uma maior expressão do gene FOXO3A em comparação com
indivíduos que tinham um estilo de vida menos saudável.
Além disso, a técnica CRISPR tem sido utilizada para investigar o papel desses
genes na regulação do envelhecimento. Por exemplo, um estudo realizado com
camundongos mostrou que a supressão do gene CETP levou a um aumento na
expectativa de vida dos animais. Esses estudos indicam que a técnica CRISPR pode
ser uma ferramenta poderosa para investigar a função desses genes e seu papel na
regulação do envelhecimento.
Em resumo, estudos têm mostrado que a expressão dos genes FOXO3A,
APOE e CETP é diferente em populações longevas em comparação com populações
mais jovens, sugerindo que a expressão desses genes pode ser um fator importante
na regulação do envelhecimento saudável.

20
 A técnica CRISPR tem sido utilizada para investigar o papel desses genes na
regulação do envelhecimento e é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento
de terapias para doenças relacionadas à idade.

4.3 POSSÍVEIS APLICAÇÕES DA CRISPR NA EDIÇÃO DOS GENES FOXO3A,

APOE e CETP PARA PROMOVER O ENVELHECIMENTO SAUDÁVEL

"A edição de genes pode ser usada para desenvolver terapias para doenças
genéticas, bem como para melhorar a saúde e a longevidade" (Budik et al.,
2020).”

A edição genética com a técnica CRISPR pode ser uma ferramenta poderosa
para estender a vida humana por mais tempo por meio da edição desses genes
relacionados à longevidade.
A edição do gene FOXO3A tem sido estudada como uma possibilidade de
aumentar a longevidade, uma vez que sua expressão elevada está associada a um
aumento na longevidade em humanos e outras espécies. Assim, a edição do gene
FOXO3A pode ser utilizada para aumentar a longevidade em humanos.
A edição do gene APOE é outra possibilidade de aplicação da técnica CRISPR
na promoção do envelhecimento saudável. O gene APOE está envolvido no
metabolismo de lipídios e tem sido associado a um risco reduzido de doenças
relacionadas ao envelhecimento, como a doença de Alzheimer. Portanto, a edição do
gene APOE pode ser usada para reduzir o risco de doenças relacionadas ao
envelhecimento, promovendo um envelhecimento saudável.
A edição do gene CETP pode ser outra possibilidade de aplicação da técnica
CRISPR na promoção do envelhecimento saudável. O gene CETP está envolvido no
metabolismo de lipoproteínas e tem sido associado a um risco reduzido de doenças
cardiovasculares e uma maior longevidade. Portanto, a edição do gene CETP pode
ser usada para reduzir o risco de doenças cardiovasculares e promover um
envelhecimento saudável.
Em resumo, a técnica CRISPR pode ser utilizada na edição desses genes
relacionados à longevidade, com o objetivo de promover um envelhecimento
saudável, aumentar a longevidade, reduzir o risco de doenças relacionadas ao
envelhecimento e reduzir o risco de doenças cardiovasculares. Entretanto, mais

21
estudos são necessários para compreender a eficácia e a segurança da edição
genética com a técnica CRISPR.

5. ÉTICA E SEGURANÇA NA APLICAÇÃO DA TÉCNICA CRISPR

A técnica CRISPR representou um avanço significativo na biotecnologia e tem

o potencial de transformar a medicina e a pesquisa científica. No entanto, como com
qualquer nova tecnologia, há preocupações éticas e de segurança associadas ao seu
uso em humanos. É importante que as aplicações da técnica CRISPR sejam
cuidadosamente consideradas e regulamentadas para garantir que sejam usadas de
maneira responsável e para o benefício da sociedade.
Neste contexto, este capítulo teve o intuito de discutir as principais
preocupações éticas e de segurança relacionadas à aplicação da técnica CRISPR em
humanos, com foco especial nas implicações da edição de genes em embriões e na
alteração de características não relacionadas a doenças.
Embora a técnica de edição genômica CRISPR/Cas9 e os genes FOXO3A,
APOE e CETP têm sido alvo de diversos estudos e pesquisas, com aplicações
potenciais em diversas áreas da biologia e da medicina, é necessário continuar a
avaliar cuidadosamente as implicações éticas e de segurança da utilização dessa
tecnologia.
A técnica CRISPR tem um grande potencial para a pesquisa em longevidade e
envelhecimento saudável, permitindo a edição precisa de genes em células e
organismos e o desenvolvimento de terapias gênicas para doenças genéticas. No
entanto, questões éticas e de segurança devem ser cuidadosamente consideradas
antes da aplicação da técnica em humanos. As perspectivas futuras para a aplicação
da CRISPR em pesquisas sobre longevidade e envelhecimento saudável são
promissoras, mas é importante que a técnica seja utilizada com responsabilidade e
cautela.
Segundo o artigo de pesquisa "Gene Editing in Ageing and Longevity: New
Approaches for In Vivo Studies" (2020), a edição genética é uma técnica promissora
para a pesquisa sobre longevidade e envelhecimento saudável. A utilização da
CRISPR permite a edição precisa de genes específicos, incluindo aqueles associados
à longevidade. Essa técnica já foi utilizada em estudos em animais para prolongar a

22
vida útil e melhorar a saúde em idade avançada. No entanto, ainda há desafios a
serem superados antes que a edição genética possa ser aplicada em humanos.
No que diz respeito às questões éticas e de segurança, o livro "Por que editar
genes é uma questão moral", de SANDEL (2019), aborda a necessidade de se discutir
as implicações éticas da edição genômica, incluindo a técnica CRISPR.
Já GAUDELLI, KOMOR E REES (2017) destacam a necessidade de se
desenvolver novas tecnologias de edição genômica que sejam mais precisas e
seguras, sugerindo a “técnica de base editing” criada por eles em 2017, que permite
a substituição precisa de uma única base de DNA sem cortar o DNA.

5.1 A “TÉCNICA DE BASE EDITION”, DE GAUDELLI, KOMOR E REES (2017)

Conforme já relatado acima, essa técnica é uma evolução da técnica CRISPR-

Cas9, que é uma ferramenta de edição de genes amplamente utilizada.
Na técnica de base editing, elaborada por GAUDELLI, KOMOR & REES em
2017, uma enzima chamada "desaminase de citidina" é usada para converter uma
base de citosina em uracila no DNA. Em seguida, uma enzima chamada "DNA
polimerase" é usada para substituir o uracil pela base desejada, como a timina. Dessa
forma, é possível fazer alterações precisas em uma única base de DNA sem cortar o
DNA.
Os autores defendem que a técnica de base editing tem várias vantagens em
relação à técnica CRISPR-Cas9. Alegam que ela é mais precisa e pode evitar a
introdução de mutações indesejadas no DNA. Argumentam que ela é mais eficiente e
pode ser usada para editar células que não se dividem rapidamente, como as células
do cérebro. Por fim, declaram que ela é menos invasiva e menos propensa a causar
danos no DNA, o que a torna uma técnica promissora para a terapia genética.
Mas, sabe-se que a técnica de base editing ainda está em desenvolvimento e
precisa de mais pesquisas para aprimorar a sua eficácia e segurança. No entanto, ela
representa uma evolução importante na área da edição de genes e tem o potencial de
revolucionar a forma como tratamos doenças genéticas no futuro.

23
5.2 PREOCUPAÇÕES ÉTICAS EM RELAÇÃO À EDIÇÃO DE GENES EM
HUMANOS

A técnica CRISPR levanta várias preocupações éticas em relação à sua

aplicação em humanos. Por exemplo, a edição de genes em embriões pode ser usada
para criar bebês "sob medida", o que é considerado antiético por muitos. Além disso,
a técnica pode ser usada para alterar características não relacionadas a doenças,
como a cor dos olhos, tipo de cabelo, alto QI intelectual, o que é considerado um uso
inadequado da técnica, ao menos na época em que estamos vivendo, atualmente.
Embora a edição de genes ofereça um grande potencial para tratar e curar
doenças genéticas, a técnica CRISPR também pode ser usada para fins
diferenciados, como melhorar características físicas ou mentais em indivíduos,
considerados por alguns membros da sociedade como fins “menos nobres”. Eles
alegam que esse tipo de uso poderia levar a um aumento da desigualdade social e
discriminação, já que apenas aqueles com recursos financeiros teriam acesso a essa
tecnologia.
Mas é importante considerarmos que, muito embora a sociedade atual
discrimine tal prática, é certo que alguns pesquisadores da área já se utilizaram de tal
uso, mesmo de um modo não tão ético quanto deveriam, pois sabe-se que, quando
uma técnica ou teoria é apresentada ao público, em geral, ela já foi analisada como
possível de ser realizada, mesmo que em células humanas e, em práticas somente
de laboratório.
Outra preocupação ética do uso desta técnica, em humanos, é a possibilidade
de efeitos colaterais imprevistos em futuras gerações, uma vez que as alterações
genéticas realizadas podem ser transmitidas para suas descendências. Além disso, a
tecnologia, que também pode ser utilizada para fins de melhoramento humano, é
temida pela sociedade, em geral, temendo que alguns países ou classes sociais mais
abastadas possam criar uma nova classe de “seres humanos modificados
geneticamente”, o que levantaria questões sobre a igualdade e a identidade humana,
um aspecto muito relevante para estudos sociais vindouros e para a área voltada às
ciências humanas.
É importante relembrarmos, aqui, um fato que chocou o mundo, em 2018,
quando um cientista chinês anunciou que havia criado bebês geneticamente
modificados. Ele afirmou ter editado o DNA de embriões usando a técnica CRISPR,

24
com o objetivo de torná-los resistentes ao vírus HIV. No entanto, essa ação foi
amplamente criticada pela comunidade científica e pela sociedade em geral, por
causa da falta de regulamentação e avaliação ética adequada.
Diante dessas preocupações, a comunidade científica e, a sociedade em geral,
tem enfatizado a importância de uma abordagem ética na aplicação da técnica
CRISPR em humanos.
É necessário que todos os países tenham uma regulamentação adequada e
um diálogo aberto e transparente com a sociedade em que vivem para garantir que a
tecnologia seja usada de maneira justa e segura dentro dos padrões aceitos para cada
época.
A ética deve ser uma consideração fundamental em todas as aplicações da
técnica CRISPR, para garantir que os benefícios sejam maximizados e os riscos
minimizados.
Algo que hoje é criticado e visto como um “divisor de águas” entre os seres
humanos poderá ser, a milhares de anos à frente, visto como um “elo de ligação” entre
a ciência e a uma maior expectativa de vida na Terra, entre seres humanos
geneticamente modificados.

5.3 QUESTÕES DE SEGURANÇA NA APLICAÇÃO DA CRISPR EM TERAPIA

GÊNICA E PESQUISA

Além das preocupações éticas, a técnica CRISPR também levanta questões

de segurança em sua aplicação em terapia gênica e pesquisa. Por exemplo, a edição
de genes pode ter efeitos colaterais não intencionais, como a introdução de mutações
prejudiciais. Além disso, a edição de genes pode afetar não apenas o indivíduo
tratado, mas também suas futuras gerações.Isso ocorre porque as alterações feitas
no DNA podem ser transmitidas para as células germinativas e, portanto, para os
descendentes. Embora essa possibilidade possa ser benéfica em alguns casos, como
a prevenção de doenças hereditárias, também pode levar a efeitos colaterais
inesperados que afetam as gerações futuras.
Um dos possíveis efeitos indesejados da edição de genes é a introdução de
mutações prejudiciais que podem afetar as gerações futuras. Segundo a revista
Nature, alguns estudos em animais sugerem que a técnica CRISPR pode causar
mutações indesejadas em outros locais do genoma, além do local de interesse e que

25
essas mutações podem ser transmitidas para as próximas gerações (CYRANOSKI,
2017).
Além disso, segundo um artigo publicado na revista Frontiers in Genome
Editing, a edição de genes em embriões humanos pode resultar em “mosaicismos”,
ou seja, células com diferentes genomas, o que pode levar a problemas de
desenvolvimento e doenças (WEN et al., 2020).
As consequências do mosaicismo podem variar dependendo da extensão e da
localização das células afetadas. Em alguns casos, o mosaicismo pode causar uma
doença genética ou uma síndrome, como a síndrome de Down, que é causada por
um mosaicismo para uma cópia extra do cromossomo 21, quando da formação do
embrião. Isso resulta em uma população de células com três cópias do cromossomo
21 em vez de duas, o que pode causar uma série de problemas de desenvolvimento
e saúde. Lembrando que o mosaicismo para a trissomia do cromossomo 21 é uma
das causas mais comuns da síndrome de Down, embora a maioria dos casos seja
causada pela presença da cópia extra do cromossomo 21 em todas as células do
corpo.
Esses possíveis efeitos indesejados ressaltam a importância da realização de
estudos rigorosos de segurança antes da aplicação da técnica CRISPR em seres
humanos e da necessidade de uma regulamentação ética e legal para sua utilização.
A segurança da técnica CRISPR é uma preocupação crucial em sua aplicação
em terapia gênica e pesquisa. Embora a técnica seja capaz de gerar alterações
precisas no DNA, ainda não é possível garantir que a edição de genes seja
completamente segura. Isso ocorre porque a técnica pode afetar outras regiões do
DNA, como já citado, além daquela que está sendo direcionada, o que pode resultar
em efeitos colaterais indesejáveis. Além disso, a técnica pode ter consequências
imprevisíveis e afetar outros processos biológicos que ainda não são bem
compreendidos, ao menos até a elaboração deste estudo.
Diante dessas preocupações de segurança, é importante que a aplicação da
técnica CRISPR em terapia gênica e pesquisa seja cuidadosamente avaliada e
regulamentada. É necessário que sejam realizados estudos rigorosos para avaliar a
segurança e eficácia da técnica, além de ser importante que haja uma ampla
discussão sobre os aspectos éticos e sociais da aplicação da técnica em humanos. A
regulamentação apropriada da técnica é crucial para garantir que ela seja utilizada de
forma responsável e segura para o avanço da medicina e da ciência.

26
6. METODOLOGIAS

As teorias que foram utilizadas para entender e esclarecer o problema e

estudo proposto foram concentradas e retiradas a partir de uma Revisão de Literatura
de autores renomados, tanto nacionais quanto internacionais, em sua maioria de links
de acesso online, retiradas de softwares, sistemas e sites de pesquisa acadêmica,
bem como de Revistas Científicas da área, sendo que alguns deles foram traduzidos
para o português.
O objetivo foi o de explanar as melhores e mais recentes contribuições
teóricas a respeito do assunto abordado bem como demonstrar ao leitor um resumo
teórico de como é realizada a técnica CRISPR.
Para tanto, a metodologia foi dividida em duas frentes: uma referenciando
como ocorreu a escrita deste trabalho técnico e a outra informando como ocorre, na
prática profissional do pesquisador, a realização da técnica CRISPR, ora estudada.

6.1 METODOLOGIA UTILIZADA PARA A ESCRITA DO TRABALHO TÉCNICO

A metodologia utilizada para apresentação deste estudo incluiu uma revisão

sistemática da literatura geral e mais recente sobre a técnica CRISPR, delimitando a
apresentação mais aprofundada no estudo dos genes FOXO3A, APOE e CETP e sua
relação com a longevidade e o envelhecimento saudável, bem como fora realizada
uma abordagem referente às questões éticas e de segurança relacionadas à
aplicação da técnica em humanos.
Neste estudo, foram utilizadas as seguintes bases de dados: PubMed, Scopus,
Web of Science, Google Scholar, IEEE Xplore, arXiv, ACM Digital Library, ERIC,
JSTOR e SpringerLink para a busca de artigos científicos relevantes.
A PubMed é uma base de dados de acesso livre que se concentra em literatura
médica e biomédica.
A Scopus é uma base de dados multidisciplinar que indexa conteúdo de
revistas científicas, livros e conferências.
A Web of Science é outra base de dados multidisciplinar que rastreia citações
de artigos científicos em todo o mundo.
O Google Scholar é um mecanismo de pesquisa popular que inclui literatura
acadêmica, como artigos, teses e dissertações, além de livros e relatórios técnicos.

27
 O IEEE Xplore é uma base de dados que cobre engenharia, tecnologia da
informação e ciência da computação.
O arXiv é um repositório de preprints de artigos científicos em áreas como
física, matemática, ciência da computação e biologia.
A ACM Digital Library é uma base de dados que cobre computação e tecnologia
da informação.
O ERIC é uma base de dados de educação e pedagogia que indexa literatura,
incluindo livros, artigos de periódicos e relatórios técnicos.
A JSTOR é uma base de dados que cobre várias disciplinas, incluindo história,
ciência política, literatura e ciências sociais.
O SpringerLink é um repositório que cobre diversas áreas, como ciência,
tecnologia, medicina, negócios e ciências sociais.

Resumindo, a metodologia escolhida, por esta pesquisadora foi:

REVISÃO DA LITERATURA: Pesquisa de artigos científicos, capítulos de

livros, teses e outras publicações relevantes sobre a técnica CRISPR, a edição de
genes e os genes FOXO3A, APOE e CETP em relação à longevidade. Análise crítica
das informações encontradas e seleção das fontes mais relevantes e confiáveis.
COLETA DE DADOS: Identificação de artigos com tabelas e estatísticas de
estudos relevantes sobre a expressão desses genes em populações longevas e sua
relação com a longevidade. Levantamento de informações sobre as técnicas de
edição genética, incluindo a CRISPR, e sua aplicação em pesquisas sobre
longevidade e envelhecimento saudável.
ANÁLISE DOS DADOS: Análise crítica dos dados coletados, incluindo as
técnicas de edição genética, os genes FOXO3A, APOE e CETP e sua relação com a
longevidade. Identificação de tendências, inconsistências e lacunas nas pesquisas
existentes, informando alguns temas para estudos futuros, em item específico.
O objetivo deste estudo foi o de expor e discutir as teorias que foram utilizadas
para esclarecer e compreender o problema. Para tanto, foi de extrema importância a
criticidade da pesquisadora com relação às informações encontradas, de forma a
selecionar as fontes mais relevantes, recentes e confiáveis.

28
6.2 METODOLOGIA DA PRÁTICA PROFISSIONAL PARA REALIZAÇÃO DA
TÉCNICA

A realização de experimentos envolvendo a técnica CRISPR requer cuidados

especiais com as boas práticas de higienização e assepsia no laboratório de
biotecnologia.
Para a realização da técnica CRISPR, são necessários vários materiais, entre
eles o plasmídeo contendo a sequência gênica a ser editada, a enzima Cas9, os
oligonucleotídeos de RNA guia (sgRNA) e os reagentes de transfeção para levar o
plasmídeo e o sgRNA até as células.
Para retirar o DNA que será estudado, o pesquisador deve, primeiramente,
escolher o tecido a ser coletado. O material é geralmente coletado por meio de uma
biópsia, seguida de extração do DNA utilizando kits comerciais de extração de DNA.
Com o DNA extraído, o pesquisador pode então proceder com a técnica
CRISPR. Para isso, deve primeiramente preparar o plasmídeo contendo a sequência
gênica a ser editada e os oligonucleotídeos de RNA guia (sgRNA) específicos para
essa sequência. Esses materiais são combinados em um tubo e adicionados aos
reagentes de transfeção para serem levados até as células.
Os reagentes de transfecção são utilizados na técnica de CRISPR para
introduzir os componentes necessários para edição genética nas células-alvo. Esses
reagentes são compostos por lipídios, polímeros catiônicos ou outros agentes que
permitem a entrega eficiente dos componentes de edição genética, como o RNA guia
e a proteína Cas9, nas células-alvo. O objetivo dos reagentes de transfecção é garantir
que as células recebam e processem adequadamente os componentes de edição
genética, permitindo que ocorra a quebra e reparo do DNA no local desejado.
Lembrando que a escolha do reagente de transfecção adequado é essencial
para o sucesso da técnica de CRISPR, pois diferentes tipos de células-alvo podem ter
requisitos específicos para a entrega eficiente dos componentes de edição genética.
Após a transfeção é necessário aguardar um tempo para que a Cas9 e o sgRNA
atuem na célula, promovendo a edição do gene desejado. Em seguida, as células são
analisadas para verificar se a edição do gene ocorreu de forma eficiente.
A verificação da eficiência da edição do gene em células CRISPR/Cas9 pode
ser realizada por meio de várias técnicas. A técnica mais comum é o sequenciamento
de DNA de regiões próximas ao local do corte induzido pelo sistema CRISPR/Cas9.

29
Essa análise permite detectar as mutações geradas pela quebra do DNA e avaliar a
taxa de inserções, deleções ou substituições de nucleotídeos. Outra técnica usada é
o ensaio T7E1, que utiliza uma enzima de restrição para identificar a presença de
heteroduplexes de DNA, que são formados quando há mutações na sequência alvo.
Além disso, outras técnicas como PCR quantitativo e eletroforese capilar também
podem ser utilizadas para avaliar a eficiência da edição do gene. É importante notar
que a escolha da técnica adequada dependerá do objetivo do estudo e da
disponibilidade de recursos e equipamentos para realização das análises.
A técnica CRISPR utiliza uma enzima chamada Cas9 para realizar a edição
genômica. Para isso, é necessário fornecer a Cas9 um guia de RNA específico para
o gene a ser editado, o RNA guia (sgRNA), que é responsável por guiar a enzima até
a sequência específica de DNA que deve ser cortada.
Além disso, é necessário fornecer ao sistema um molde para que a célula possa
realizar a reparação do corte feito pela Cas9. Esse molde pode ser um plasmídeo, que
é uma molécula de DNA circular que pode ser facilmente manipulada em laboratório.
Os plasmídeos são amplamente utilizados em biologia molecular como vetores
de clonagem e expressão de genes, uma vez que possuem a capacidade de se
replicar independentemente do cromossomo da célula hospedeira.
No caso da técnica CRISPR, o plasmídeo é modificado para conter uma
sequência de DNA que corresponde ao gene a ser editado, juntamente com o sgRNA
que irá guiar a Cas9 até essa sequência. O plasmídeo é então introduzido na célula a
ser editada através de um processo chamado transfeção, que permite a entrada do
material genético na célula.
Com a introdução do plasmídeo e do sgRNA, a célula começa a produzir a
enzima Cas9, que irá se ligar ao guia de RNA e encontrar a sequência específica de
DNA que corresponde ao gene a ser editado. A partir daí, a Cas9 corta o DNA nesse
ponto, e a célula inicia o processo de reparo, utilizando o plasmídeo como molde para
corrigir o corte.
No entanto, é importante ressaltar que a técnica CRISPR é uma técnica
complexa e ainda apresenta alguns desafios, como a eficiência da edição e possíveis
efeitos fora do alvo. Portanto, é fundamental que os pesquisadores sigam as boas
práticas de higiene e assepsia, além de realizar um planejamento experimental
cuidadoso, para garantir resultados confiáveis e seguros.

30
7. RESULTADOS E DISCUSSÕES

"A CRISPR é uma técnica de edição de genes altamente precisa e eficiente

que tem o potencial de revolucionar a medicina" (Mali et al., 2013).

Os resultados da análise dos estudos sugerem que a técnica CRISPR tem um

grande potencial para a pesquisa em longevidade e envelhecimento saudável, com
resultados promissores no estudo de genes relacionados com a longevidade como
FOXO3A, APOE e CETP.
As evidências indicam que a edição desses genes pode estender a vida
humana por mais tempo, ou seja, aumentar a longevidade nos seres humanos e
reduzir o risco de doenças relacionadas ao envelhecimento, como doenças
cardiovasculares e a doença de Alzheimer. Além disso, a técnica CRISPR pode ser
usada para investigar o papel de genes específicos na regulação do envelhecimento
e para desenvolver terapias para doenças relacionadas ao envelhecimento.
No entanto, a aplicação da técnica CRISPR em humanos também levanta
preocupações éticas e de segurança que precisam ser cuidadosamente consideradas.
A edição de genes em embriões pode ser usada para criar bebês "sob medida", o que
é considerado antiético por muitos. Além disso, a técnica pode ser usada para alterar
características não relacionadas a doenças, como a cor dos olhos, nível de QI, tipo de
cabelo, altura, etc. o que é considerado um uso inadequado da técnica, ao menos na
época de elaboração deste estudo.
Além das preocupações éticas, a técnica CRISPR também levanta questões
de segurança em sua aplicação em terapia gênica e pesquisa. A edição de genes
pode ter efeitos colaterais não intencionais, como a introdução de mutações
prejudiciais, e pode afetar não apenas o indivíduo tratado, mas também suas futuras
gerações.
Em relação à aplicação da técnica CRISPR na pesquisa em longevidade e
envelhecimento saudável, a discussão dos resultados das análises sugerem que a
técnica pode ser uma ferramenta poderosa para investigar a regulação do
envelhecimento e o papel de genes específicos na longevidade. Além disso, a edição
desses genes pode ter implicações significativas para a saúde e bem-estar humano.
No entanto, é importante considerar as implicações éticas e de segurança da

31
aplicação da técnica em humanos e garantir que a pesquisa seja conduzida de forma
cuidadosa e responsável.
Identificar possíveis aplicações da técnica CRISPR na edição desses genes
para promover o envelhecimento saudável é uma área de grande interesse para
futuros estudos. As possibilidades de desenvolver terapias mais precisas e eficazes
para doenças relacionadas ao envelhecimento são empolgantes, mas é fundamental
que a segurança e a ética sejam cuidadosamente consideradas em todas as
aplicações desta técnica e das que vierem, a partir dela.

8. CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos e na revisão da literatura referente à técnica

CRISPR, é possível concluir que a técnica CRISPR tem um grande potencial para a
pesquisa em longevidade e envelhecimento saudável. Além disso, a recente técnica
de base editing, desenvolvida por GAUDELLI, KOMOR E REES em 2017, tem
proporcionado novas possibilidades de edição de genes para terapias de doenças
genéticas, incluindo as relacionadas ao envelhecimento.
A utilização dessas técnicas permite a identificação e estudo de genes
específicos relacionados a esses temas, bem como o desenvolvimento de terapias
para doenças relacionadas ao envelhecimento. Entretanto, como já relatado, a
aplicação dessas técnicas em humanos levanta preocupações éticas e de segurança,
que precisam ser cuidadosamente consideradas antes de sua utilização em larga
escala.
Em relação aos objetivos do presente trabalho, foi possível identificar os genes
FOXO3A, APOE e CETP como um dos três mais importantes para a regulação da
longevidade e envelhecimento saudável, ao menos até a época desta pesquisa, bem
como discutir possíveis aplicações das técnicas CRISPR e de base editing na edição
desses genes para promover o envelhecimento saudável. Além disso, foram
abordadas preocupações éticas e de segurança relacionadas à aplicação dessas
técnicas em humanos, o que permite uma reflexão crítica sobre os possíveis riscos e
benefícios de seu uso.
Dessa forma, conclui-se que a técnica CRISPR e a técnica de base editing
representam grandes oportunidades para a pesquisa em longevidade e
envelhecimento saudável, mas seu uso deve ser cauteloso e considerando

32
cuidadosamente suas implicações éticas e de segurança. É necessário o
aprofundamento dos estudos sobre essas técnicas e seus efeitos, permitindo uma
utilização responsável e benéfica das mesmas.
A continuidade das pesquisas nessa área é de extrema importância para o
avanço do conhecimento sobre envelhecimento e longevidade, bem como para o
desenvolvimento de novas terapias e intervenções genéticas no futuro.

8.1 PERSPECTIVAS FUTURAS PARA A APLICAÇÃO DA CRISPR EM PESQUISAS

SOBRE LONGEVIDADE E ENVELHECIMENTO SAUDÁVEL

A técnica CRISPR tem mostrado um grande potencial para a pesquisa em

longevidade e envelhecimento saudável, permitindo a investigação de genes
específicos e o desenvolvimento de terapias para doenças relacionadas ao
envelhecimento. No entanto, as preocupações éticas e de segurança relacionadas à
aplicação da técnica em humanos devem ser cuidadosamente consideradas. Diante
disso, a presente pesquisa buscou reunir informações relevantes sobre os genes
FOXO3A, APOE e CETP e sua relação com a longevidade, assim como discutir as
possíveis aplicações da técnica CRISPR e da técnica de base editing na edição
desses genes para promover o envelhecimento saudável.
A partir dos resultados obtidos e da revisão da literatura existente, sugere-se a
continuidade desta pesquisa em nível de Mestrado, abordando questões mais
específicas e avançadas sobre a técnica CRISPR, da técnica de base editing e de
uma pesquisa mais aprofundada dos genes FOXO3A, APOE e CETP e sua relação
com a longevidade.
As pesquisas podem explorar, por exemplo, as implicações éticas e de
segurança da aplicação da técnica em seres humanos, bem como investigar outros
genes relacionados ao envelhecimento saudável que possam ser alvos potenciais da
técnica CRISPR. Dessa forma, poder-se-á ampliar o conhecimento sobre a técnica
CRISPR e sua aplicação em pesquisas sobre longevidade e envelhecimento
saudável, contribuindo para o avanço da ciência e para a melhoria da qualidade de
vida das pessoas.
Uma referência importante para a análise de todos os dados estudados foi o
artigo "Association of FOXO3A variation with human longevity confirmed in German

33
centenarians" (2008), que investigou a relação entre a variação do gene FOXO3A e a
longevidade em centenários alemães. O estudo confirmou a associação do alelo G do
SNP rs2802292 do gene FOXO3A com a longevidade em humanos. Essa descoberta
sugere que o aumento da atividade do gene FOXO3A pode contribuir para a
longevidade em humanos, restando necessária uma pesquisa similar com indivíduos
brasileiros, tendo em vista terem uma alimentação diferente dos alemães, bem como
o ambiente onde vivem também ser diferenciado, além da cultura e costumes.
Considerando os resultados apresentados neste estudo, sugere-se estender a
pesquisa a nível de Mestrado (stricto sensu), para investigar questões mais
específicas e avançadas sobre a técnica CRISPR e sua relação com a longevidade e
o envelhecimento saudável.
Assim, tendo por base este estudo, a nível lato sensu, cita-se algumas
sugestões para aprofundamento em estudos futuros, sugerindo incluir os seguintes
objetivos:

➢ Investigar os efeitos da edição genômica com CRISPR em outros genes

relacionados à longevidade e envelhecimento, além dos genes FOXO3A,
APOE e CETP.
➢ Examinar as implicações éticas e sociais da edição genômica com CRISPR
para a longevidade humana, incluindo questões de justiça, igualdade e acesso.
➢ Avaliar os desafios técnicos e práticos na aplicação da técnica CRISPR para o
tratamento de doenças relacionadas à longevidade, como doenças
neurodegenerativas e doenças cardiovasculares.
➢ Investigar os mecanismos moleculares subjacentes à expressão dos genes
FOXO3A, APOE e CETP e como a técnica CRISPR pode ser usada para
manipular esses mecanismos para promover a longevidade.
➢ Estudar o papel dos telômeros na regulação da longevidade, aprofundando os
estudos de como eles se comportam, procedendo com uma análise mais
aprofundada destes, fazendo como que uma “engenharia reversa”, ou seja,
analisando como eles encurtam na tentativa de reverter este processo com o
objetivo de alterar o comprimento dos telômeros.
➢ Avaliar os estudos existentes sobre a segurança e eficácia da edição genômica
com CRISPR em células humanas e animais, incluindo possíveis efeitos fora
do alvo e mutações indesejadas.

34
 ➢ Avaliar as implicações éticas e sociais da edição genômica com CRISPR para
a longevidade humana, incluindo questões de justiça, igualdade e acesso.

Essas sugestões de objetivos para estudos futuros têm o potencial de contribuir

significativamente para o avanço do conhecimento científico sobre a técnica CRISPR,
sua relação com a extensão da vida dos seres humanos por mais tempo, bem como
um envelhecimento mais saudável.

35
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