UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS CULTIVADAS

COM DESFERROXAMINE (DFO) E INTERFERON GAMMA,
MIMETIZANDO CONDIÇÕES DE HIPÓXIA E INFLAMAÇÃO

PABLO EDUARDO OCAMPO ORTIZ

Botucatu, SP
2021
 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS CULTIVADAS

COM DESFERROXAMINE (DFO) E INTERFERON GAMMA,
MIMETIZANDO CONDIÇÕES DE HIPÓXIA E INFLAMAÇÃO

PABLO EDUARDO OCAMPO ORTIZ

Tese apresentada junto ao Programa

de Pós-Graduação em Biotecnologia
Animal para obtenção do título de
Doutor

Orientador: Profa. Titular. Fernanda

da Cruz Landim e Alvarenga

Botucatu, SP
2021
iii
 iv

Nome do autor: Pablo Eduardo Ocampo Ortiz

TÍTULO: CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS CULTIVADAS COM

DESFERROXAMINE (DFO) E INTERFERON GAMMA (IFN-GAMMA),
MIMETIZANDO CONDIÇÕES DE HIPÓXIA E INFLAMAÇÃO

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Titular Fernanda da Cruz Landim

Presidente e orientadora
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. DRARV
FMVZ – UNESP – BOTUCATU

Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza

Membro
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. DRARV
FMVZ – UNESP - BOTUCATU

Profa. Dra. Ana Liz Garcia Alves

Membro
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. DRARV
FMVZ – UNESP – BOTUCATU

Dr. Leandro Maia

Membro
Autônomo

Dra. Fabiana Fernandes Bressan

Membro
FZEA-USP

Data da defesa: 01 de julho de 2021.

 v

Dedico este triunfo a minha mãe, sem ela não seria quem sou
Minha família, apoio incondicional
Minha esposa e filho, meu todo
 vi

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de
Financiamento 001
 vii

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 .................................................................................................... 15
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA.............................................................. 2
2. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 5
2.1. Células tronco mesenquimais ou células estromais mesenquimais ........ 5
2.2. Mecanismos de ação das MSCs .................................................................. 6
2.3. Hipóxia........................................................................................................... 8
2.4. HIF-1 ........................................................................................................... 9
2.5. Indução da hipóxia in vitro ......................................................................... 11
2.6. Hipóxia e MSC .......................................................................................... 12
2.7. Inflamação................................................................................................. 13
2.8. MSC e a modulação imune ....................................................................... 14
3. HIPOTESE ................................................................................................. 17
4. OBJETIVO ................................................................................................. 17
5. REFERENCIAS ......................................................................................... 18
CAPÍTULO 2 .................................................................................................... 37
ARTIGO CIENTÍFICO ...................................................................................... 38
Abstract .................................................................................................................. 38
1. Introdução ................................................................................................... 41
2. Material e Métodos...................................................................................... 42
3. Resultados .................................................................................................. 48
4. Discussão .................................................................................................... 53
5. Conclusão ................................................................................................... 60
6. Referencias ................................................................................................. 61
 viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Desenho experimental mostrando a distribuição dos

grupos……….....................................................................................................43

Figura 2. Curva de crescimento de células-tronco mesenquimais após 48, 96 e

144 horas em diferentes condições de cultivo celular. Dados representam
medias de células colhidas de 3
animais...............................................................................................................48

Figura 3. Porcentagem de células vivas, em apoptose ou necrose após o cultivo

de células tronco mesenquimais em diferentes
condições...........................................................................................................48

Figura 4. Expressão de genes pró-apoptóticos (A, B e C) relacionados com

sobrevivência celular (D, E e F), imunomodulação (G, H, I e J), proliferação e
diferenciação (K), angiogênese (L e M), reguladores do ciclo celular (N e O) e
regulador celular de resposta adaptativa a hipoxia (P) nas células tronco
mesenquimais caninas derivadas de tecido adiposo cultivadas por 48 horas em
diferentes condições. Barras representam valores da média relativa
normalizados com o gene de referência GAPDH e erro padrão da média (┬ e ┴).
Médias denotadas por uma letra diferente indicam diferenças estatísticas
significativas entre os tratamentos (P < 0.05)...............................................49-51
 ix

LISTA DE ABREVIATURAS

Bcl2 Linfoma de células B antiapoptótico 2

Casp3 Caspase 3
Casp8 Caspase 8
Casp9 Caspase 9
cAT-MSCs Células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo canino
Cyclin D1 Ciclina D1
Cyclin D2 Ciclina D2
DFO Desferroxiamine
DKC1 Disquerina 1
DNMT1 ADN-metiltransferase 1
EGF Fator de crescimento epidérmico
EPO Eritropoyetina
FGF-2 Fator de crescimento fibroblástico 2
GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato desidrogenase
HDAC1 histona deacetilase 1
HGF Fator de crescimento de hepatócitos
Hif1α Fator induzível por hipoxia 1 alpha
HRE Elemento responsivo a hipóxia atuando em CIS
IDO Indoleamina-pirrol 2,3-dioxigenase
IL-10 Interleucina 10
IL-6 Interleucina 6
IFN-g Interferon gamma
iNOS Oxido nítrico sintase
MM Meio de manutenção
MMP2 Metaloproteinase de matriz 2
MSCs Células tronco mesenquimais
NO Oxido nítrico
P53 Supressor tumoral 53
RT- qPCR Análise Quantitativa PCR em Tempo Real
PGE-2 Prostaglandina E2
VEGFA Fator de crescimento endotelial vascular
 x

TERT Telomerase transcriptase inversa

TNF-a Fator de necrose tumoral alpha
 xi

OCAMPO, P.E. Células tronco mesenquimais caninas cultivadas com

desferroxamine (dfo) e interferon gamma, mimetizando condições de
hipóxia e inflamação Botucatu, 2021. 84 p. Tese (PhD). Biotecnologia Animal
– Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
As células tronco mesenquimais (MSC) tem se destacado como candidatas ao
uso em terapias regenerativas. Porém, foi demonstrado que nem todas as
condições clínicas podem ser favorecidas pela presença das MSCs, já que suas
propriedades são influenciadas pelas condições do microambiente onde serão
aplicadas, que normalmente estão acompanhadas da presença de fatores
inflamatórios e isquêmicos. Devido a isto, este estudo teve por objetivo avaliar
os efeitos in vitro da adição de DFO e/ou ao IFN-g no meio de cultivo de células
tronco mesenquimais (MSCs do inglês Mesenchymal Stem Cells) de tecido
adiposo canino (cAT-MSCs). Foram utilizadas MSCs originadas de 6 cadelas e
pertencentes a um banco celular em terceira passagem. As amostras foram
divididas em 4 grupos, controle (MSCs em condições normais de cultivo em meio
de manutenção), grupo DFO (50 µmol de DFO no meio de manutenção), grupo
IFN-g (50 ng/mL de IFN-g no meio de manutenção) e grupo IFN-g/DFO (50 µmol
de DFO e 50 ng/mL IFN-g no meio de manutenção). O teste de proliferação foi
feito por 144 horas de cultivo e, viabilidade, apoptose e expressão gênica foram
avaliadas após 48 horas de cultivo. Na expressão genica foram analisados
transcritos relacionados com apoptose (BCL2, CASP8 e CASP9), sobrevivência
celular (DKC1, HDAC1 e DNMT1), imunomodulação (HGF, IDO, PGE2 e IL-6),
proliferação e diferenciação (FGF2), angiogênese (MMP2 e VEGFA),
reguladores do ciclo celular (Cyclin-D1 e TP53) e regulador celular de resposta
adaptativa a hipóxia (HIF1-a). As cAT-MSCs mostraram durante e ao final do
cultivo morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico. No entanto, os grupos
tratados apresentaram maior distanciamento entre as células aderidas. Após 144
horas de cultivo, todos os grupos tiveram comportamento similar quanto a curva
de proliferação celular, com diminuição da concentração nas primeiras 48 horas,
seguido por uma fase de manutenção e finalizando com um ligeiro crescimento.
A expressão gênica revelou que as cAT-MSCs tratadas com IFN-g apresentaram
 xii

um incremento na expressão do gene pró-apoptótico Casp9 quando comparado

com o grupo IFN-g/DFO; o gene FGF2 importante para os processos de
proliferação e diferenciação celular foi aumentado no grupo IFN-g quando
comparado aos outros grupos tratados; os genes DKC1 e TP53 envolvidos com
a sobrevida celular e supressão tumoral respectivamente, tiveram um
incremento no grupo IFN-g quando comparado com o grupo DFO; a expressão
do gene relacionado com os processos de angiogênese, o VEGFA, foi maior nos
grupos onde o DFO foi usado. Concluímos que condicionar as cAT-MSCs com
a citocina pro-inflamatória IFN-g estimulou um aumento na sobrevivência,
proliferação celular e angiogênese mediada por MMP2. Já a mimetização de
hipóxia, levou a uma diminuição da expressão de genes relacionados a estas
propriedades associadas a um estímulo para a angiogênese dependente de
VEGF. Apesar disso, os genes relacionados a imunomodulação não foram
influenciados pelas condições de cultivo. Os resultados obtidos indicam que as
propriedades de indução da regeneração tecidual foram mais afetadas pelas
condições de cultivo, em comparação às propriedades imunomodulados das
cAT-MSC.
Palavras-chave: imunomodulação, inflamação, expressão genica.
 xiii

OCAMPO, P.E. Canine mesenchymal stem cells cultured with deferoxamine

(dfo) and interferon gamma, mimicking conditions of hypoxia and
inflammation Botucatu, 2021. 84 p. Thesis (PhD). Animal biotechnology –
Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science. São Paulo State University.
SUMMARY
Mesenchymal stem cells (MSC) have been highlighted as candidates for use in
regenerative therapies. However, it has been shown that not all clinical conditions
can be favored by the presence of MSCs, as their properties are influenced by
the conditions of the microenvironment where it will be applied, conditions that
are usually accompanied by the presence of inflammatory and ischemic factors.
So, this study aimed to evaluate the in vitro effects of the addition of DFO and/or
IFN-g in the culture medium of mesenchymal stem cells (MSCs Mesenchymal
Stem Cells) from canine adipose tissue (cAT-MSCs). MSCs from 6 bitches and
belonging to a cell bank in the third passage were used. Samples were divided in
4 groups: Control (MSCs under standard culture conditions in maintenance
medium); DFO group (50 µM of DFO in maintenance medium), IFN-g Group (50
ng/mL of IFN-g in maintenance medium) and IFN-g/DFO group (50 µM of DFO
and 50 ng/mL IFN-g in maintenance medium). Proliferation test was performed
for 144 hours of culture and viability, apoptosis and gene expression were
evaluated after 48 hours of culture. In gene expression, transcripts related to
apoptosis (BCL2, CASP8 and CASP9), cell survival (DKC1, HDAC1 and
DNMT1), immunomodulation (HGF, IDO, PGE2 and IL-6), proliferation and
differentiation (FGF2), angiogenesis (MMP2 and VEGFA), cell cycle regulators
(Cyclin-D1 and TP53) and cellular regulator of adaptive response to hypoxia
(HIF1-g) were analyzed. The cAT-MSCs showed fibroblastoid morphology and
plastic adherence during and at the end of the culture. However, the treated
groups showed greater distance between adhered cells. After 144 hours of
culture, all groups had a similar behavior regarding the cell proliferation curve,
with a decrease in concentration in the first 48 hours, followed by a maintenance
phase and ending with a slight growth. Gene expression revealed that cAT-MSCs
treated with IFN-g showed an increase in the expression of the pro-apoptotic
Casp9 gene when compared to the IFN-g/DFO group; the FGF2 gene important
for cell proliferation and differentiation processes was increased in the IFN-g
 xiv

group when compared to the other treated groups; the DKC1 and TP53 genes
involved with cell survival and tumor suppression respectively, had an increase
in the IFN-g group when compared to the DFO group; the expression of the gene
related to the angiogenesis processes, VEGFA, was higher in the groups where
DFO was used. We conclude that conditioning cAT-MSCs with the pro-
inflammatory cytokine IFN-g stimulated an increase in survival, cell proliferation
and MMP2-mediated angiogenesis. The mimicry of hypoxia, on the other hand,
led to a decrease in the expression of genes related to these properties
associated with a stimulus for VEGF-dependent angiogenesis. Despite this,
genes related to immunomodulation were not influenced by culture conditions.
The results obtained indicate that tissue regeneration induction properties were
more affected by culture conditions, compared to the immunomodulated
properties of cAT-MSC.
Key words: immunomodulation, inflammation, gene expression.
CAPÍTULO 1
 2

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
As células tronco mesenquimais (MSC) tem se destacado como
candidatas ao uso em terapias regenerativas por serem células com duas
principais características, sendo a segunda atualmente a mais importante, 1) se
diferenciar em várias linhagens celulares e portanto, serem usadas na
engenharia de tecidos (DA SILVA MEIRELLES, 2009; DA SILVA MEIRELLES
2006; ZAGO, 2004), e 2) atividade parácrina, secretando moléculas bioativas
que propiciam um ambiente adequado para a reparação tecidual (CAPLAN,
2007; MONTEIRO E NETO; DEL CARLO, 2010).
A principal fonte de MSCs não hematopoiéticas estudada foi a medula
óssea (MO) (NARDI E DA SILVA MEIRELLES, 2008), cujas MSCs tem um
potencial terapêutico e de diferenciação diminuído em doadores de idade
avançada (MUELLER E GLOWACKI, 2001). Para contrabalancear esta limitação
outras fontes alternativas de MSCs começaram a ser pesquisadas, entre elas, o
tecido adiposo (BAJADA et al., 2008; MINGUELL; et al., 2001) e tecidos de
origem fetal (BAJADA et al., 2008; CREMONESI; et al., 2011; LANGE-
CONSIGLIO et al., 2013; LOVATI et al., 2011; MIKI et al., 2005; TSAI et al.,
2004), sendo as de origem adiposo as mais utilizadas na atualidade.
Indistintamente da origem, inúmeros trabalhos em animais e humanos
confirmam os benefícios terapêuticos das MSCs (BAJADA et al., 2008; ORLIC
et al., 2001; TABBARA et al., 2002). MASON e MANZOTTI relatam o tratamento
de 675.000 pacientes com diversas doenças entre os anos 80 até o ano 2010
(MASON E MANZOTTI, 2010). De fato, hoje a terapia com CTMs é bem
estabelecida em medicina veterinária no Brasil e estas células tem sido utilizadas
no tratamento de diversos tipos de doenças. Porém, a evolução da terapia celular
com MSCs tem demostrado que nem todas as condições clínicas ou
experimentais podem ser favorecidas pela presença das células (SEIFERT et
al., 2012), já que as propriedades das MSCs são influenciadas pelo status clínico
do organismo e/ou tecido alvo onde serão aplicadas, bem como pelo
microambiente onde estas são cultivadas quando expandidas in vitro (CERON
et al., 2016).
Durante a lesão tecidual a capacidade regenerativa depende da
proximidade e sinergismo entre as células do sistema imune e das MSCs
 3

residentes (do próprio tecido), mantendo a homeostase do microambiente e

sugerindo uma regulação recíproca entre ambas (AURORA; OLSON, 2014;
BERNARDO; FIBBE, 2013). De fato, hoje é bem evidente que a as MSCs
possuem funções imunomoduladoras relacionadas ao ambiente de lesão no qual
as células se encontram e que quando entram em contato com o local lesionado,
atuam modificando o microambiente através da secreção de moléculas bioativas
que modulam a reação inflamatória e a reparação tecidual (AURORA; OLSON,
2014).
As condições patológicas normalmente são acompanhadas da presença
de fatores inflamatórios e isquêmicos com carência ou ausência de oxigênio e
de nutrientes (BURAVKOVA et al., 2014), condições que impactam diretamente
na sobrevivência e propriedades das MSCs. Alguns artigos afirmam que em
condições com baixa tensão de oxigênio e suprimento nutricional as MSCs
podem sofrer apoptose e autofagia (BURAVKOVA et al., 2014; ZHANG et al.,
2009; ZHU et al., 2006), já outros demostram viabilidade aumentada, melhor
capacidade proliferativa, migratória, de diferenciação e de produção parácrina
em condições de hipóxia (CRISOSTOMO et al., 2008; ROSOVÁ et al., 2008;
SICCO et al., 2017).
Embora o pré condicionamento de MSCs em condições de hipóxia seja
uma metodologia conhecida, o cultivo em hipóxia é geralmente caro e difícil de
padronizar, sendo que mesmo pequenas mudanças no ambiente de cultivo
podem levar a variações nos resultados experimentais (FUJISAWA et al., 2018).
Desta forma, o uso de agentes que mimetizam os efeitos da hipóxia como o
desferroxamine (DFO), um agente quelante de íons, tem sido investigado
(FUJISAWA et al., 2018).
A desferroxiamina é um sideroforo hexadentado secretado pelo
Streptomyces pilosus. Em cultivo de células tronco, o uso da DFO é utilizado
para mimetizar uma condição de hipóxia nas células interferindo com a
hidroxilação do HIF-1, o qual é um regulador chave da resposta celular as
mudanças na concentração de oxigênio, uma vez que é uma proteína instável
que se degradada em normóxia devido a hidroxilação. Em condições de hipóxia
ou na presença de DFO, sua degradação não acontece, havendo seu acúmulo
e translocação para o núcleo das células.
 4

Diversos artigos têm demonstrado que o condicionamento das MSC em

condições de baixa oxigenação antes do transplante faz com que estas
produzam uma maior quantidade de moléculas necessárias para a redução das
lesões isquêmicas, combatendo os agentes oxigênio reativos e estimulando a
secreção de fatores pró angiogênicos e antiapoptóticos (CARRIERE et al, 2009;
CHACKO et al., 2010; LIU et al., 2013).
Trabalhos tem reportado resultados benéficos no tratamento de lesões
teciduais acompanhadas de isquemia como infarto do miocárdio, falha renal,
lesão medular, doença discal, defeito periodontal e feridas cutâneas (AL-KHALDI
et al., 2003; HU et al., 2008; IWASE et al., 2005; JUN et al., 2014; KIM et al.,
2015, 2016; KINNAIRD et al., 2004; LEE et al., 2017; MOON et al., 2006;
NAKAGAMI et al., 2005; PITTENGER E MARTIN, 2004; TSUMANUMA et al.,
2016). Ainda assim, poucos são os estudos realizados em situações controladas
sob condições de hipóxia e inflamação em animais domésticos e particularmente
em cães.
A baixa imunogenecidade das MSCs e suas funções na modulação do
sistema imune fazem destas células candidatas promissórias para uso em
terapia celular. As MSCs têm a capacidade de promover ou restringir a
inflamação quando o sistema está imunossuprimido ou superativado,
respetivamente. Estas funções são controladas em grande parte pela atividade
parácrina, produzindo fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e vesículas
extracelulares (GOMZIKOVA et al., 2019) que trabalham de uma maneira
sinérgica com mecanismos dependentes de contato celular.
O IFN-g é produzido pelos linfócitos T, algumas células T CD8+, e células
NK. De forma geral, sua atividade biológica pode ser dividida em três: defesa do
hospedeiro regulando a expressão de proteínas do MHC I e II da maioria de
células imunes, com a exceção de inibir a expressão de MHC II nas células B; é
o principal ativador de macrófagos e é a principal citocina responsável pela
indução de mecanismos mediados por células NO especificas. Resumidamente
as MSCs são ativadas pelo IFN-g e passam a modular direta ou indiretamente
as respostas das células T. Fatores que diminuem a ativação, melhoram a
sinalização negativa e modificam as células T para um fenótipo anti-inflamatório,
 5

além disso também interatuam com células apresentadoras de antígeno

incrementando ou induzindo o aparecimento de células reguladoras.
Sendo assim, é importante entender o impacto do microambiente nas
MSCs visando sua adaptação a condições terapêuticas. Desta forma, a hipótese
do presente trabalho é que a utilização do quelante de íons DFO irá influenciar
a sobrevivência, proliferação, a expressão genica das cAT-MSCs. Os resultados
encontrados serão comparados aos obtidos com células cultivadas na presença
de agentes indutores da inflamação (IFN-g) e sob condições controle.

2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Células tronco mesenquimais ou células estromais mesenquimais
As células tronco mesenquimais (MSCs) (do inglês, mesenchymal stem
cells) ou células estromais mesenquimais são células de origem adulto não
hematopoietico que possuem ampla plasticidade fenotípica e aderência ao
plástico (NARDI E DA SILVA MEIRELLES, 2008). A propriedade plástico-
aderentes permite que adotem morfologia fibroblastóide e sob condições
especiais, diferenciem-se em várias linhagens de células mesenquimais
(DOMINICI et al., 2006).
As MSCs Inicialmente foram isoladas de medula óssea (MO), porém
devido à sua ampla distribuição no organismo, outras fontes foram identificadas,
sendo possível isolar MSCs de diversos tecidos como: tecido adiposo (ZUK et
al., 2001), tecido musculoesquelético (BIANCO, et al., 2008), sangue periférico
(KUZNETSOV et al., 2001), derme (JIANG et al., 2002) e tecidos fetais como:
sangue de cordão umbilical (BIEBACK et al., 2004), líquido amniótico (LOVATI
et al., 2011), membrana amniótica (BAJADA et al., 2008; LANGE-CONSIGLIO
et al., 2013; MIKI et al., 2005; TSAI et al., 2004), matriz extra vascular do cordão
umbilical (BAJADA et al., 2008; CREMONESI, et al., 2011) entre outros.
O desempenho das MSC é mais conhecido in vitro quando comparado a
condições in vivo, sendo suas principais propriedades a autorrenovação e a
plasticidade, a capacidade quimiotática e de migração para os locais de lesão e
inflamação, a secreção de mediadores parácrinos e fatores tróficos,
propriedades imunomoduladoras, propriedade angiogênica e de regulação
 6

durante reações inflamatórias locais (DA SILVA MEIRELLES; NARDI, 2009;

MASTRI, et al., 2014).
Sua disponibilidade, facilidade de serem isoladas e purificadas, expansão
sem indução espontânea de diferenciação, bem como capacidade de
diferenciação em diversos tipos de células especializadas, faz com que estas
células tenham um valor inestimável em pesquisa, podendo servir para o estudo
e o desenvolvimento do reparo tecidual com o alvo para correção de lesões
provocadas por doenças congênitas ou degenerativas (AMORIN et al., 2012;
MATIKAINEN; LAINE, 2005). Estas últimas propriedades de diferenciação in
vitro são as responsáveis pelo nome de células tronco. Porém, com o avanço
das pesquisas e aplicações clínicas foi visto que o efeito terapêutico depende
principalmente da secreção de fatores imunomoduladores e tróficos e não de
sua diferenciação no tecido especializado, sustentando a iniciativa de mudar o
nome por ¨células de sinalização medicinal¨ (CAPLAN, 2017).
2.2. Mecanismos de ação das MSCs
Logo no início da utilização terapeutica de MSCs no tratamento de
doenças, foram observados seus efeitos terapêuticos nas doenças de enxerto
versus hospedeiro, bem como na sepse. No entanto, o entendimento de seu
complexo mecanismo de ação, que faz com que MSCs tenham efeitos benéfico
na terapia regenerativa, ainda está em construção (WAGNER; HENSCHLER,
2012). No início se acreditava que seus efeitos eram causados pela inserção das
MSCs no tecido e sua diferenciação em células especializadas no local da lesão.
No entanto, hoje é conhecido que menos de 1% das MSCs sobrevivem no
hospedeiro por mais de uma semana após a administração (MONTEIRO et al.,
2010; CROVACE et al., 2007) sugerindo que seu principal efeito é mediado pela
secreção de fatores paracrinos bioativos (McILWRAITH et al., 2011; LOVE et al.,
1994; CHENIER, 2007).
No entanto, o modus operandi das MSCs ainda não foi completamente
elucidado, sendo as principais hipóteses as de que estas células I) compõe o
nicho de células progenitoras, II) se diferenciam e reparam tecidos lesados, e III)
enxertando-se temporariamente em tecidos lesados e comunicando-se com eles
por meio de fatores bioativos visando deter a progressão da lesão e melhorar a
 7

reparação através da formação de ambientes que estimulam a diferenciação e

propagação de células endógenas (PROCKOP; REGER, 2013).
Apesar de algumas MSCs poderem se diferenciar em células do tecido
lesado (WANG et al., 2014), hoje em dia é bem conhecido que as principais
propriedades terapêuticas destas células são atribuídas a atividade parácrina
(BAGLIO, et al., 2012). Esta afirmação é sustentada pelo fato de que as MSCs
desaparecem rapidamente depois de sua administração, secretando produtos
solúveis encarregados por gerar o efeito terapêutico imunoregulador (GNECCHI,
et al., 2016; MA et al., 2014). Entre os produtos secretados pelas MSCs,
encontramos fatores solúveis, microvesículas e exosomos (THÉRY, et al., 2009)
que são liberadas no espaço extracelular. Desta forma as MSCs transferem para
as células vizinhas miRNA, mRNA, proteínas, lipídeos e até mitocôndrias,
controlando a função parácrina antinflamatória e antimicrobiana (BAGLIO, et al.,
2012; JACKSON et al., 2016; RANI et al., 2015).
As MSCs têm a capacidade de modular o efeito anti-inflamatório mediante
várias vias, influenciadas pelos diferentes microambientes nas diferentes
afecções. Segundo (PROCKOP; YOUN OH, 2012), estas células são
consideradas os guardiães da inflamação, e apresentam diferentes modos de
ação; I) São ativadas para expressar o antagonista do receptor para interleucina
1 (IL -1) (ORTIZ et al., 2007); II) São ativadas pelo microambiente lesado para
secretar o fator de necrose tumoral induzível pela proteína 6 (TSG-6), modulando
a cascata de citocinas pró-inflamatórias (LIN et al., 2013; OH et al., 2010); III)
São ativadas para secretar prostaglandina E2 (PGE2) um dos principais
mediadores da inflamação (BOUFFI et al., 2010; CHEN et al., 2010; HARTING
et al., 2018).
Existem ainda outras sugestões de mecanismos de ação anti-inflamatório
das MSCs, incluindo ativação para expressar a proteína antireativa de espécies
de oxigênio, a stanniocalcin-1 (PROCKOP; YOUN OH, 2012), fator de
crescimento transformante-β1 (TGFβ1), fator de crescimento de hepatócito
(HGF) (DI NICOLA et al., 2002), indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) (MEISEL et
al., 2004) e óxido nítrico (NO) (BOUFFI et al., 2010; SATO et al., 2007). Com
tudo, pode se resumir que as MSCs regulam o sistema imune inato e adaptativo
por meio do contato célula-célula suprimindo células T, madurando células
 8

dendríticas, reduzindo a ativação e proliferação de células B, inibindo

proliferação e citotoxicidade de células NK e promovendo a geração de células
T reguladoras (GAO et al., 2016).
Devido à grande quantidade de artigos científicos que relata o efeito
parácrino das MSCs, Caplan propôs a alteração do nome mesenchymal stem
cells para medicinal signaling cells o qual reflete com maior precisão o fato de
que as células se concentram em locais lesados para secretar fatores solúveis
que trabalham em prol da regeneração e imunorregulação, inferindo que essas
células produzem in vitro drogas medicinais (CAPLAN, 2017).

2.3. Hipóxia
Desde o surgimento do primeiro organismo capaz de liberar oxigênio (O2)
na atmosfera, (cerca de 4 biliões de anos atrás) a concentração deste gás
aumentou drasticamente tornando-se um fator indispensável a vida. No começo
o O2 era tóxico para seres vivos, porém, com o passar dos anos mecanismos
adaptativos de detoxificação foram surgindo. Um exemplo disso, são os
eucariotas, cuja fisiologia se tornou oxigênio-dependente, porém com
concentrações de oxigênio metabolismo-dependente (IVANOVIC, 2009). No
corpo humano, as concentrações de O2 são tecido-dependente variando de um
estado de hipóxia até anóxia, quando comparadas com as encontradas na
atmosfera. No parênquima pulmonar e na circulação (JOHNSON et al., 2005;
WILD et al., 2005), assim como em órgãos com parênquima bem irrigado como
fígado, rins e coração (DAVILA et al., 2004; MIK et al., 2004; ROY et al., 2003;
WELCH et al., 2001) as concentrações de oxigênio oscilam entre 4% e 14%. Em
tecidos menos irrigados e com consequente tensão de O2 relativamente mais
baixa, como o cérebro, esta concentração varia entre 0,5% a 7% (HEMPHILL et
al., 2005), no olho 1% a 5% (YU; CRINGLE, 2005), e na medula óssea de 0% a
4% devido a heterogeneidade celular (CHOW et al., 2001; SPENCER et al.,
2014).
Desta forma fica evidente que, a normóxia in situ é na verdade uma
“hipóxia fisiológica” (BURAVKOVA et al., 2014; GUZY E SCHUMACKER, 2006;
IVANOVIC, 2009) na qual, os requisitos de O2 são dependentes das
necessidades energéticas de cada célula, tecido e organismo (LENIHAN E
 9

TAYLOR, 2013). Já a hipóxia tecidual surge quando as demandas de O2 não

suprem as necessidades fisiológicas de cada órgão tornando-se indesejada e,
dependendo da severidade podendo causar debilidade muscular, hipertensão,
depressão mental, coma e até a morte celular (PRABHAKAR, 2001). A hipóxia
tecidual pode ser classificada como aguda ou crônica. As mudanças agudas
(segundos a minutos) acontecem como resultado de alterações de proteínas
preexistentes ou outras macromoléculas através de reações redox, fosforilação,
defosforilação, entre outras, enquanto mudanças crônicas (minutos a horas)
ocorre como resultado de alterações genéticas (SEMENZA, 1999, 2000).
Essa hipóxia tecidual é diferente da hipóxia fisiológica, que ocorre quando
existe um processo inflamatório que leva a uma isquemia ou a uma lesão por
reperfusão, na qual se expressam mediadores inflamatórios regulados por
hipóxia. A reperfusão é mediada pelo acúmulo de hipoxantina e xantina oxidase
durante os episódios de isquemia. Em presença de oxigênio a hipoxantina é
metabolizada em xantina. No entanto esta metabolização está impedida em
condições isquêmicas. Quando a reperfusão e tensão de oxigênio é retomada,
a xantina oxidase converte a hipoxantina acumulada em xantina com a geração
de grandes quantidades de íons superóxido, H2O2 e outros radicais livres. Estes
iniciam a peroxidação lipídica da membrana e a subsequente liberação de
agentes quimiotáticos, que participam na migração, adesão e ativação de
neutrófilos, os quais são chave no processo inflamatório e tem sido implicado no
resultante dano tecidual (AIRLEY, et al., 2000). A síndrome da doença crítica é
um processo estressante fisiológico complexo disparado por diversas patologias
onde a disfunção ou morte do órgão acontecem por uma falha bioenergética
gerada por um suprimento de oxigênio celular inadequado (MCKENNA et al.,
2020).

2.4. HIF-1
A homeostase de oxigênio é um princípio organizacional importante para a
compreensão da evolução, biologia e medicina (SEMENZA 2014) e é
indispensável para sobrevivência do organismo, mesmo em condições de
anemia ou em altas altitudes, uma vez que a produção de eritropoetina (EPO) é
rapidamente ativada no rim (WEIDEMANN E JOHNSON 2008). A EPO estimula
 10

a produção de células vermelhas e, por conseguinte, determina a concentração

de oxigênio no sangue. A indução da transcrição de EPO requer que o gene
tenha um elemento responsivo a hipóxia atuando em CIS (HRE) na região do
extremo 3` do gene. O HIF-1 (hypoxia inducible factors) se liga ao HRE em
condições de hipóxia e é acumulado no núcleo (SADEK E SEMENZA, 2019)
enquanto em condições com alto O2 o HIF-1 é degradado. Quando existe hipóxia
ele se acumula servindo como fator de transcrição para vários componentes que
podem ser deletérios aos tecidos (D’IGNAZIO, et al., 2016; ELTZSCHIG E
CARMELIET, 2011; TAYLOR E COLGAN, 2017).
Os organismos são capazes de responder com mudanças adaptativas na
expressão genica a variações nas concentrações de oxigênio. Existem vários
sistemas fisiológicos complexos no corpo dos mamíferos que garantem o
fornecimento de oxigênio às células. O regulador transcripcional HIF-1 é um
mediador essencial da homeostase deste elemento (SEMENZA G. 2000). O HIF-
1 foi descoberto pela identificação de um elemento de resposta à hipóxia, uma
região de 50 pares de bases na porção 3´do gene eritropoietina humana (EPO)
e foi visto por ligar-se a quatro ou mais fatores nucleares diferentes, pelo menos
dois dos quais são induzidos por anemia no fígado e nos rins (GOLBERG 1988;
SEMENZA, et al., 1991; SEMENZA E WANG, 1992).
O HIF-1 é um heterodímero composto por subunidades alpha e beta que
são estabilizadas por enzimas dependentes de oxigênio e ferro chamadas
enzimas de domínio HIF-prolil hidrolase (PHD). A subunidade a é a responsável
pela atividade biológica do HIF-1, participando na expressão de mRNA,
proteínas, localização nuclear e trans-ativação, enquanto a subunidade b é
expressada constitutivamente (SEMENZA G., 2001). Em normóxia, PHDs
hidroxilam 2 resíduos prolil da subunidade a, unindo-se à proteína de supressão
tumoral von Hipple-Lindau (VHL) com subsequente ubiquitinação e degradação
por proteossomas. Por outro lado, em condições de hipóxia dependente de
oxigênio ou em presença de quelantes de ferro, os PHDs são suprimidos e a
subunidade HIF-a é translocada ao núcleo para se unir à subunidade HIF-1b e
formar o complexo fator de transcrição heterodimérico HIF-a:HIF-1b que se
localizara nos elementos responsivos à hipóxia (HREs) de seus genes alvo,
resultando na sua regulação transcripcional positiva (VITO, et al., 2020; SADEK;
 11

SEMENZA, 2019; SEMENZA, 2000). Segundo Sadek e Semenza (2019) existem

atualmente mais de 4000 genes alvos diretamente regulados pelo HIF cuja
regulação também se dá pela hidroxilação, ubiquitinação e degradação
dependente de oxigênio.

2.5. Indução da hipóxia in vitro

Existem no mercado incubadoras com capacidade para controlar a
concentração de oxigênio fornecida às células. Porém o custo destas as vezes
impossibilita sua aquisição. Por outro lado, existem protocolos onde se
introduzem garrafas de cultivo dentro de sacolas plásticas fechadas contendo
uma concentração baixa de oxigênio para mimetizar a hipóxia, conseguindo
acomodar níveis variáveis de oxigênio em cada uma das sacolas, ainda assim
são pouco uteis em pesquisas com repetições experimentais de cultivos
individuais (BAKMIWEWA, 2015).
Tentando compensar esta desvantagem, vem se utilizando substâncias
químicas com o fim de induzir hipóxia sem a necessidade de diminuir o oxigênio
na incubadora de cultivo os quais são chamados de agentes miméticos de
hipóxia. Estas substâncias são classificadas como quelantes de ferro,
concorrentes pelo ferro e análogos de oxoglutarato 2 (DAVIS, 2019). Dentre elas
temos a dimetiloxalil glicina, desferroxiamina, L-mimosina (MULLER E JANJIC,
2018), e o cloreto de cobalto (ZENG, 2011).

2.5.1. Desferroxiamina
A desferroxiamina é um sideroforo hexadentado secretado pelo
Streptomyces pilosus amplamente utilizado como tratamento de intoxicações
crônicas por ferro como a beta-talassemia. Se caracteriza por ter uma alta
afinidade pelo ferro e muito baixa pelos outros íons metais presentes nos fluidos
biológicos, impedindo a produção de ROS e por consequente a diminuição de
estresse oxidativo nas células sobrecarregadas com ferro, aliviando assim os
sintomas causados pela intoxicação (AOUAD, 2002; LIU E HIDER 2002;
KALINOWSKI E RICHARDSON, 2005).
No que diz respeito ao seu uso no cultivo celular, propriedades
anticancerígenas têm sido demostradas. Inibição de células tronco
 12

cancerígenas, melhoria da resistência à quimioterapia, sinergismo com

medicamentos quimioterápicos mediante a promoção da apoptose, entre outros,
são alguns dos benefícios na oncologia experimental (LI, 2019; WANG, 2019).
Em cultivo de células tronco, o uso da DFO é utilizado para mimetizar uma
condição de hipóxia nas células interferindo com a hidroxilação do HIF-1. O fator
induzido pela hipóxia (HIF-1) é um regulador chave da resposta celular as
mudanças na concentração de oxigênio, uma vez que é uma proteína instável
que se degradada em normóxia devido a hidroxilação. Em condições de hipóxia
ou na presença de DFO, sua degradação não acontece, havendo seu acúmulo
e translocação para o núcleo das células. O DFO captura ions importantes para
a hidroxilação do HIF-1, impedindo assim a sua degradação e mimetizando os
efeitos causados pela hipóxia (JAAKKOLA et al., 2001). Independentemente de
ser causado por hipóxia ou pela presença do DFO, o HIF-1 acumulado, após sua
translocação para o núcleo, atua como promotor da expressão de diversos genes
envolvidos na sobrevivência celular, apoptose, angiogênese e neurogênese (LIU
et al., 2016).

O uso do DFO foi pouco explorado no cultivo de MSCs, mas um estudo

demostrou que BMSCs aplicadas junto com DFO reforçam o efeito homing de
migração em direção à área de hipóxia em feridas cutâneas, aceleram a
diferenciação das células tronco e melhora a neovascularização do tecido
isquêmico (ZHENG, 2019).

2.6. Hipóxia e MSC

O uso das MSCs tem atraído a atenção como uma ferramenta promissora
na medicina regenerativa e terapia celular, porém sua aplicação é limitada devido
à perda de viabilidade celular induzida pelo microambiente, quase sempre hostil,
durante o transplante (BURAVKOVA et al., 2014). Dentre os diversos fatores que
influenciam as condições do microambiente de injúria, é conhecido que a hipóxia
afeta o potencial de auto renovação e diferenciação de MSCs (ROSOVÁ et al.,
2008). Por um lado, acredita-se que a morte das MSC após transferência, e por
consequente a falha da terapia é causada por condições isquêmicas no foco de
lesão (ZHU et al., 2006). Por outro lado, sabe-se que os depósitos endógenos
 13

de MSC no organismo apresentam uma pressão parcial de O2 relativamente

baixa, demostrando a resistência das MSCs a condições de hipóxia
(BURAVKOVA et al., 2014), a qual promove um aumento de sua capacidade de
renovação e diferenciação (GRAYSON et al., 2007; LENNON, et al., 2001).
Em condições com tempo de exposição in vitro a hipóxia entre 0 e 72
horas e concentrações de O2 entre 0,5 e 5%, um aumento no número de células
apoptóticas aparece entre 3 e 24 horas de exposição (CHACKO et al., 2010;
PETERSON et al., 2011; ZHU et al., 2006). No entanto, nestas condições,
geralmente a hipóxia é combinada com a privação de soro, o que dificulta
comparações diretas (NIE et al., 2011; ZHANG et al., 2009). Apesar do aumento
da morte celular e da inibição da proliferação de MSCs submetidas a hipóxia in
vitro por curtos períodos, a sua atividade de migração, tanto na cicatrização de
feridas como em testes com câmara de Boyden foi aumentada após 6 a 20 horas
de incubação em condições de baixo O2 (BUSLETTA et al., 2011; LEE et al.,
2010).
Vários trabalhos têm descrito as vantagens ou desvantagens do cultivo de
MSC em condições de hipóxia, no entanto ainda não existe um consenso sobre
estes efeitos visando sua aplicação futura em protocolos de terapia celular. O
cultivo de MSCs em condições de hipóxia tem sido utilizado para pré-condicionar
células antes do transplante terapêutico em casos de doenças hepáticas (YU et
al, 2013), neurológicas (WEI et al., 2012), ósseas (FAN et al., 2015) e vários tipos
de doenças isquêmicas (LUO et al., 2019). No entanto, a manutenção de um
ambiente estável de hipóxia necessita de equipamento especializado e tem
custo elevado para a manutenção da atmosfera adequada. Além disso, a
exposição não constante a condição de hipóxia durante o cultivo leva a variações
no metabolismo celular que dificultam a interpretação dos resultados obtidos
(FUJISAWA et al., 2018).

2.7. Inflamação
A imunidade inata se refere a capacidade do organismo de concentrar
rapidamente células e moléculas de defesa no local de invasão para se proteger
de danos e invasão microbiana. Este processo ativa células como neutrófilos e
macrófagos e direciona seu caminho no fluxo sanguíneo para o local de invasão.
 14

Quando a imunidade adaptativa é ativada, outras moléculas como anticorpos e

componentes do complemento são produzidos, auxiliando como protetores. Do
mesmo modo que os neutrófilos, estes componentes estão restritos ao fluxo
sanguíneo, ingressando unicamente nos tecidos quando houver inflamação
tecidual (TIZARD, 2017).
As células do sistema imune secretam uma quantidade de proteínas cuja
função é regular a resposta imune mediante comunicação intercelular para
garantir uma reação sincronizada das células dos diferentes tecidos.
Diferentemente dos hormônios, as citocinas afetam uma ampla variedade de
células e órgãos, uma só célula normalmente secreta mais de uma citocina de
uma vez, e muitas citocinas diferentes podem gerar a mesma resposta. Com
toda esta complexidade, o conceito de rede de citocinas foi criado para explicar
a forma em que o sistema imune é regulado. Dentre as principais citocinas estão
as interleucinas 1 até 18 (IL 1-18), interferon a, b, e g, (IFN a, b, e g) o fator de
necrose tumoral a e b (TNF a e b) fatores estimuladores de colônias-granulócito
(G-CSF), macrófago (M-CSF) e granulócito-macrófago (GM-CSF), fator de
crescimento fibroblastico ácido e básico (aFGF e bFGF respectivamente), entre
outros. Normalmente estas proteínas são sintetizadas em minutos e são
liberadas pelo efeito específico de estímulos locais exercendo seu efeito unindo-
se a receptores altamente específicos na superfície das células onde irão atuar
(TSANEV E IVANOV, 2001; TIZARD, 2017).

2.8. MSC e a modulação imune

Sua baixa imunogenecidade e suas funções na modulação do sistema
imune fazem das MSCs candidatas promissórias para uso em terapia celular. As
MSCs têm a capacidade de promover ou restringir a inflamação quando o
sistema está imunossuprimido ou superativado, respetivamente (JIANG E XU,
2019). Estas funções são controladas em grande parte pela atividade parácrina,
produzindo fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e vesículas
extracelulares (GOMZIKOVA et al., 2019) que trabalham de uma maneira
sinérgica com mecanismos dependentes de contato celular. No entanto, os
mecanismos moleculares envolvidos na imunomodulação mediada por MSCs
continuam sendo um desafio sendo, portanto, pouco claros, já que as diferentes
 15

fontes de obtenção e as variações nos protocolos de cultivo fazem que as MSCs

tenham variações na expressão de marcadores de superfície, perfis de secreção
de citocinas e expressão genica (WEISS; DAHLKE 2019).
Mesmo assim existem padrões e caminhos que parecem ser consistentes
e foram repetidamente demonstrados. É bem sabido que as MSCs sentem os
sinais de perigo por meio de receptores tipo TROL (TLRs) os quais reconhecem
a célula lesada ou o patógeno e estimulam tanto as células imunes como as
MSCs, para que, estas últimas, liberem os fatores anti-inflamatórios. Porém,
dependendo do tipo de TLRs ativado pode ocorrer a indução de um fenótipo pro
ou anti-inflamatório nas MSCs. O TLR3 induz o fenótipo anti-inflamatório
(fenótipo MSC2) com secreção de IL-6, IL-8 ou TGF-β, e TLR4 o fenótipo pro-
inflamatório (fenótipo MSC1) com uma alta produção de IL-10, iNOS (rato),
indoleamine 2,3-dioxigenase (IDO) (humano), e prostaglandina E (PGE2)
(AYALA-CUELLAR et al., 2019). Acredita-se que a iNOS nos ratos e a IDO nos
humanos, secretada pelas células T secretoras sob influência de citocinas pro-
inflamatórias, são a chave entre os efeitos imunomoduladores das MSCs e seu
respetivo fenótipo (JIANG E XU 2019). Além de disso, o microambiente, também
pode influenciar e mudar o fenótipo das MSCs (WANG et al., 2014).
Adicionalmente, existem citocinas pro-inflamatórias capazes de ativar a
função imunossupressora das MSCs, entre eles estão a IL-1β, TNF-α e o IFN-g.
A ação imunossupressora das MSCs se dá pela regulação das células
dentriticas, natural killers, macrófagos, células B e T (CD4+ e CD8+), polarizando
os monócitos/macrófagos em direção a um fenótipo tipo 2 e por conseguinte a
inibição da diferenciação para tipo 1 (WEISS E DAHLKE 2019). Dentre eles, o
IFN-g é considerado crítico para que as MSCs cumpram essa função (JIANG E
XU 2019).

2.8.1. Interferon g
Único interferon tipo II e chamado assim pela sua atividade antiviral,
interferindo na síntese proteica e de RNA dos vírus. No entanto, sua atividade
antiviral é mínima e secundaria quando comparada com os outros interferons,
sendo a molécula destacada pela atividade imunomoduladora. O IFN-g é
produzido pelos linfócitos T, algumas células T CD8+, e células NK. De forma
 16

geral, sua atividade biológica pode ser dividida em três: defesa do hospedeiro
regulando a expressão de proteínas do MHC I e II da maioria de células imunes,
com a exceção de inibir a expressão de MHC II nas células B; é o principal
ativador de macrófagos e é a principal citocina responsável pela indução de
mecanismos mediados por células NO especificas.
Existe certeza de que a resposta inflamatória é mediada em grande parte
pelo IFN-g, devido ao seu sinergismo com o TNF. Diversos estudos afirmam que
o IFN-g tem muito a ver no desenvolvimento e severidade de autoinmunidade
sistêmica, principalmente no lúpus eritematoso. O IFN-g atua de diferentes
maneiras e por diferentes mecanismos no desenvolvimento de várias respostas
autoimunes, e sua natureza multifacetária na imunidade adaptativa evidencia
possíveis alvos terapêuticos com benefícios promissores. No entanto seu papel
neste processo ainda está sujeito a investigação (FARRAR E SCHREIBER,
1993; POLLAR et al., 2013).

2.8.2. Interferon g e MSCs

As MSCs têm ganhado um lugar importante como ferramenta para a
terapia celular devido ao seu amplo controle do sistema imune. Diversas afeções
vêm sendo tratadas com MSCs, entre elas a diabetes, artrite reumática, doença
de Crohn, Lúpus eritematoso sistêmico e enfermidade de implante vs
hospedeiro, porém com resultados heterogêneos e com a necessidade de
aplicar uma quantidade muito alta de células para atingir um resultado
terapêutico (SILVA-CARVALHO et al., 2019). Uma alternativa para suprir estas
desvantagens é o uso de IFN g para incrementar o potencial imunossupressor
das MSCs e resolver os conflitos halogênicos produzidos pelos transplantes de
órgãos (KIM et al., 2018). Resumidamente as MSCs ativadas com IFN-g
poderiam modular direta ou indiretamente as respostas das células T mediante
a indução de fatores inibidores de MSCs. Fatores que diminuem a ativação,
melhoram a sinalização negativa e modificam as células T para um fenótipo anti-
inflamatório, além disso também interatuam com células apresentadoras de
antígeno e incrementam ou induzem células reguladoras. No entanto estudos in
vivo mostram opiniões contraditórias sobre o seu uso, alegando um aumento da
 17

imunogenecidade com o uso do IFN-g e afetando assim negativamente a

sobrevida do implante (SIVANATHAN et al., 2014).
Frente ao exposto, a hipótese do presente experimento é de que MSC
caninas expostas ao DFO irão apresentar capacidade imunomodulatória e
produção de proteínas relacionadas a resistência ao estresse oxidativo
semelhante ao de células estimuladas com agentes promotores de inflamação.
Sendo assim, o presente experimento visa estudar os efeitos do cultivo de MSC
obtidas de tecido adiposo canino em presença de DFO avaliando seu potencial
de proliferação, índice de apoptose e secretoma, bem como o padrão de
expressão de genes associados ao estresse oxidativo, morte celular,
angiogenese e imunomodulação.

3. HIPOTESE
Hipotetizamos que a adição da desferroxamina (DFO) e do IFN-g, durante a
cultura, será capaz de mimetizar as condições de hipóxia e inflamação
observada nos tecidos lesados, criando um ambiente de modulação da função
das MSCs. Este ambiente de modulação in vitro irá influenciar a sobrevivência,
proliferação e a expressão de transcritos produzidos por MSCs favorecendo a
adaptação destas as condições terapêuticas.

4. OBJETIVO
O objetivo geral é estudar a resposta das MSCs obtidas de tecido adiposo
canino ao ambiente de cultivo com desferroxamina (DFO), como mimético de
hipóxia, e na presença do agente pró-inflamatório IFN-g, bem como a associação
dos dois, por 48 horas, avaliando sua influencia na sobrevivência, proliferação e
a expressão genica de MSCs caninas.

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar a taxa de proliferação e índice de apoptose mediante curva

de crescimento e analise por citometria de fluxo de MSCs de tecido
adiposo canino submetido às diferentes condições de cultivo.

• Avaliar a expressão dos genes CASP8, CASP9, HDAC1, DKC1,

 18

DNMT1, HGF, PGE2, IDO, FGF2, VEGFA, MMP2, IL-6, BCL2, TP53,
Cyclin-D1 e GADPH pelas MSCs submetidas às diferentes condições
de cultivo, focando nas mudanças de modulação da resposta imune,
angiogênese, resistência ao estresse oxidativo e atividade anti-
apoptótica.

Agradecimento. - À CAPES pela concessão da bolsa de doutorado.

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 37

CAPÍTULO 2
 38

ARTIGO CIENTÍFICO
Artigo redigido segundo as normas da Regenerative Therapy
https://www.journals.elsevier.com/regenerative-therapy

CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS CULTIVADAS COM

DESFERROXAMINE (DFO) E INTERFERON GAMMA, MIMETIZANDO
CONDIÇÕES DE HIPÓXIA E INFLAMAÇÃO

Canine mesenchymal stem cells cultivated with desferroxiamine (DFO)

and interferon gamma, mimetizing hypoxia and inflammation conditions

Pablo Eduardo Ocampo Ortiz1, Viviana Helena Vallejo Aristizabal1, Joshua

Benjamín Andrés Polanco Stuart1, Thaisy Tino Dellaqua2, Fernanda da Cruz
Landim-Alvarenga1

1
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária - Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP - Botucatu, 18618-681 SP, Brasil.
2
Departamento de Fisiologia - IBB - UNESP - Botucatu, 18618-689 SP, Brasil.

Corresponding author: Fernanda da Cruz Landim - Rua Prof. Doutor Walter

Mauricio Correa, s/n. Bairro: Unesp Campus de Botucatu - Departamento de
Cirurgia e Anestesiologia Veterinária- FMVZ - UNESP - Botucatu, SP, Brasil. Tel:
+5514997611964. E-mail: fernanda.landim@unesp.br

Abstract
Introduction: The immunomodulatory properties of exogenous mesenchymal
stem cells (MSCs) have been the target of research in immune-mediated
diseases and organ transplants. However, the altered microenvironment
(hypoxia, inflammation, increased reactive oxygen species) in these conditions
decrease MSCs capabilities and survival post-transplantation. The purpose of
this study was to assess the viability, proliferation, and gene expression of canine
adipose tissue-derived MSCs (cAT-MSCs) cultured in hypoxia (deferroxyamine
 39

[DFO]) or inflammation (interferon g [IFN-g] conditions and both. Methods: Since

hypoxia and inflammation coexist in the settings of injury and Graft-Versus-Host
Disease, we sought to explore how the gene expression of MSCs changes when
cells were exposed to 48 h of desferroxiamine (DFO), interferon gamma (IFN-g),
or both cues together. For this, transcripts related to apoptosis, cell survival,
immunomodulation, proliferation and differentiation, angiogenesis, cell cycle
regulators and cellular regulator of adaptive response to hypoxia were analyzed.
Additionally, cell proliferation (144 hours of cultivation) and viability analyzes were
performed Results: In all groups, the cultured cAT-MSCs showed fibroblastoid
morphology and adherence to plastic at 24 hours, but the treated groups present
a greater distance between the adhered cells. At 144 hours of cultivation, all
groups had a similar behavior in the cell proliferation curve with decreased
concentration in the first 48 hours, followed by a maintenance phase and a slight
growth at the ending. All treatment groups exhibited a higher cell concentration
than the control group at 144 hours. The gene expression revealed increased
expression of pro-apoptotic gene Casp9 in group IFN g than IFN g + DFO group;
the FGF2 gene related with the cell proliferation and differentiation was increased
in the IFN g group in contrast to other treated groups; The DKC1 and PT53 genes
related to cell survival and tumor suppression, respectively, had an increased
expression in IFN g group than the DFO group; and the VEGFA expression, gene
involved in the angiogenesis, was higher in the groups where DFO was used.
Conclusion: Although genes associated with the increase in survival and cell
proliferation were stimulated by IFN-g, immunomodulatory genes were not
affected by the culture conditions tested. The mimicry of hypoxia, on the other
hand, led to a decrease in the expression of genes related to these factors
associated with a stimulus for angiogenesis. These results indicate that
regenerative properties of cAT-MSC were more affected by the culture conditions
used in this experiment.

Highlights:

• Cell preconditioning with pro-inflammatory agents increased genes

associated with their survival and proliferation capacities.

• Hypoxic environment decreases the expression of genes related to

 40

survival and proliferation and increases an angiogenesis-stimulating

transcript.

• Immunomodulatory genes were not influenced by hypoxic and

inflammatory conditions

Keywords: immunomodulation, inflammation, gene expression.

List of abbreviations:
Bcl2 B cell lymphoma 2
Casp3 Caspase 3
Casp8 Caspase 8
Casp9 Caspase 9
cAT-MSCs canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
DFO Desferroxiamine
DKC1 Dyskerin 1
DNMT1 DNA methyltransferase 1
EGF Epidermal growht factor
FGF-2 Fibroblastic growht factor 2
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
hBM-MSCs Human bone marrow mesenchymal stem cells
HDAC1 Histone deacetylase 1
HGF Hepatocyte growth factor
Hif1α Hypoxia-inducible factor 1 alpha
IDO Indoleamine 2, 3-dioxygenase
IL-10 Interleukin 10
IL-6 Interleukin 6
IFN g Interferon gamma
iNOS inducible nitric oxide synthase
ISCT International Society for Cellular Therapy
MM Maintenance medium
MMP2 matrix metalloproteinase 2
MSCs Mesenchymal stem cells
NK Natural killer
 41

RT- qPCR quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction

PGE-2 Prostaglandin E2
VEGFA Vascular endothelial growth factor A
TERT Telomerase reverse transcriptase
TNFα Tumor necrosis factor alpha
TP53 Tumor protein 53

1. Introdução

As MSCs tem sido alvo de investigação devido as suas propriedades biológicas,

como proliferação, multipotencialidade, tropismo, imunossupressão, e homing
e/ou migração [1–5]. Até 2020, 1.138 testes clínicos, utilizando MSCs, foram
registrados na clinicaltrials.gov [6], com resultados que as posicionam como uma
alternativa para o tratamento de diferentes condições clínicas em animais e
humanos [7–10]. Porém, nem todas as condições clínicas ou experimentais são
favorecidas pela aplicação de MSCs [11] devido à influência do microambiente
de cultivo in vitro e o status clínico do organismo no qual serão aplicadas [12].
As MSCs possuem função imunomoduladora no microambiente da lesão,
modificando-o via fatores bioativos que modulam a reação inflamatória e a
reparação tecidual [13]. No entanto, as condições clínicas quase sempre estão
acompanhadas de uma reação inflamatória e isquêmica [14] e impactam
diretamente na sobrevivência e funções biológicas das MSCs. Estudos afirmam
que MSCs em condições de hipóxia e baixo suprimento nutricional, podem sofrer
apoptose e autofagia [14–16], resultando no insucesso do tratamento. Por outro
lado, outros estudos reportam viabilidade aumentada, maior capacidade
proliferativa, migratória, de diferenciação celular e de liberação parácrina [17–
19].
Algumas alternativas têm sido mencionadas para aumentar a produção de
moléculas necessárias para a recuperação de lesões isquêmicas, como o
condicionamento das MSCs em ambientes de baixa oxigenação antes do
transplante, o que inibe espécies reativas de oxigênio e estimula a secreção de
fatores pró-angiogênicos e antiapoptóticos [20–22]. O tratamento das células,
durante o cultivo, com citocinas pró-inflamatórias como IFN-g também foi citado
como uma maneira de prevenir a rejeição após transplante [19,23–25].
 42

Embora o pré-condicionamento de MSCs em condições de hipóxia seja uma

metodologia conhecida, o cultivo nestas condições é de custo elevado e difícil
de ser padronizado, já que mínimas alterações no ambiente de cultivo podem
modificar os resultados experimentais. Desta forma, o uso de agentes que
mimetizam os efeitos da hipóxia e inflamação como a desferroxamina (DFO), um
agente quelante de íons, e o IFN-g, respetivamente, tem sido sugerido como
alternativa para garantir estabilidade de condições no ambiente de cultivo
[26,27].
Apesar de diversos estudos demonstrarem o efeito do IFN-g sobre a capacidade
inmunomoduladora das MSCs e reportarem resultados benéficos com o
condicionamento por hipóxia para o tratamento de lesões teciduais
acompanhadas de isquemia como infarto do miocárdio, falha renal, lesão
medular, doença discal, defeito periodontal e feridas cutâneas [23,24,27–38]
poucos são os estudos realizados em situações controladas sob condições de
hipóxia e inflamação em animais domésticos e particularmente em cães.
Com tudo, a finalidade deste trabalho é melhor compreender as habilidades
imunossupressoras e regenerativas das MSCs obtidas de tecido adiposo canino
ao ambiente de cultivo com desferroxamina (DFO) e na presença de IFN-g,
associados ou não, mediante testes de proliferação celular, viabilidade e
expressão genica.
Sendo assim, é importante entender o impacto das diferentes condições in vitro
no microambiente das MSCs visando sua adaptação a estas condições in vivo.
Desta forma, a hipótese do presente trabalho é que a utilização do quelante de
íons DFO como mimético de hipóxia, associado ou não ao IFN-g, irá influenciar
a sobrevivência, proliferação e a expressão genica de MSCs caninas. Os
resultados encontrados serão comparados aos obtidos com células cultivadas
na presença de agentes inflamatórios sozinhos (IFN-g) e sob condições controle.

2. Material e Métodos

2.1. Reagentes e protocolos

 43

Todos os reagentes utilizados no estudo foram de alto grau de pureza e

adquiridos da empresa Thermofisher. Casos contrários foram citados. Os
protocolos citados no estudo foram elaborados pelo Laboratório de Terapia
Celular e Reprodução Avançada (LANÇA, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, da UNESP, Botucatu, Brasil).

2.2. Aspectos éticos

O estudo foi conduzido pelos princípios éticos na experimentação animal, de
acordo com a Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório
(SBCAL) e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética no
Uso de Animais (CEUA), da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, da
UNESP, Botucatu, Brasil, sob o protocolo 0026/2020.

2.3. Obtenção e caracterização das MSCs

Foram utilizadas amostras de tecido adiposo obtidas de 6 cadelas hígidas de
raça não definida, com menos de 3 anos de idade e histórico médico sem
doenças previas, submetidas a ovariohisterectomia eletiva. Como critério de
inclusão no estudo, as cadelas apresentaram PCR negativo para Adenovirus
canino tipo I, Babesia spp., Ehrlichia spp., Leptospira spp., Toxoplasma gondii,
vírus da Cinomose e Mycoplasma spp. As MSCs foram mantidas em nitrogênio
líquido à -196°C no banco celular do Laboratório de Terapia Celular e
Reprodução Avançada (LANÇA, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
da UNESP, Botucatu, Brasil). Todas as amostras foram previamente
caracterizadas de acordo com as normas da Sociedade Internacional de Terapia
Celular, apresentando aderência ao plástico durante o cultivo, morfologia
fibroblastoide, marcação positiva para os marcadores de membrana CD44 (abD
Serotec, USA) e CD90 (Becton Dickinson  and Company, USA), e negativa para
o marcador de membrana CD34 (abD Serotec, USA) e baixa marcação (< 5%)
do marcador MHCII (abD Serotec, USA).
As amostras foram descongeladas de acordo com Chaytor [39]. As células foram
rapidamente descongeladas a 37 °C sob leve agitação, até permanecer uma
pequena porção de gelo. Então, as amostras foram transferidas para tubos de
centrifugas previamente preparados com 3 mL de meio de manutenção
 44

(DMEM/F12 (code no. 31600034/21700018) acrescido de 20% de soro fetal

bovino (code no. 12657029), 1% de Pen-Strep (code no. 15140122) e 1% de
Fungizone (code no. 15290026)) a 37 °C, e mantidos na mesma temperatura por
3 minutos. A seguir, foram adicionados mais 9 mL de meio de manutenção,
totalizando 12 mL (meio de manutenção e células descongeladas). As células
foram centrifugadas a 580 g/10 minutos e avaliados quanto a viabilidade com o
Trypan Blue (Sigma-Aldrich Inc. St. Louis, MO, USA).
As células (25.000 células viáveis/cm2) foram depositadas em garrafas de cultivo
para o recultivo e mantidas em DMEM/F12 acrescido de 20% de soro fetal
bovino, 1% de Pen-Strep e 1% de Fungizone e incubadas a 37.5 °C, com 5%
CO2 em ar e 100% de humidade por 24 horas para garantir a aderência às
garrafas. Em seguida o meio foi descartado e as garrafas foram lavadas (3x) com
PBS (code no. 70011044). A seguir, os meios e condições de cultivo foram
modificados de acordo com os grupos experimentais em um delineamento
inteiramente casualizado.

2.4. Cultivo das MSCs e grupos

A condição de hipóxia e inflamação foram mimetizadas com a utilização de DFO
(code no. D9533, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) e do IFN-g (code no.
I3275, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) respectivamente, no meio de cultivo
DMEM/F12 (code no. 31600034/21700018,) sem a adição de soro fetal bovino,
vermelho fenol e HEPES, para evitar interferências nas posteriores análises.
Apenas garrafas contendo ³ 80% de confluência celular foram submetidas às
diferentes condições de cultivo in vitro. No grupo controle as células foram
mantidas em DMEM/F-12 contendo 1% de Pen-Strep e 1% de Fungizone (meio
base). O grupo DFO foi composto por células mantidas em meio base acrescido
de 50 µmol de DFO. No grupo IFN-g as células foram mantidas no meio base
contendo 50 ng/ml IFN-g. No grupo IFN-g + DFO as células foram mantidas no
meio base contendo 50 µmol de DFO e 50 ng/ml IFN-g. Em todos os grupos, os
cultivos foram conduzidos em incubadora a 37,5 oC, com 5% CO2 em ar e 100%
de humidade por 48 horas (Figura 1).
 45

Figura 1. Desenho experimental mostrando a distribuição dos grupos.

2.5. Teste de proliferação celular

A proliferação celular foi avaliada nas amostras obtidas de 6 animais. Para cada
animal um total de 1 x 104 células/poço foram cultivadas em 4 placas de 6 poços
por 144 horas. As 4 placas de cada animal representavam os 4 grupos
experimentais cultivados sob as condições mencionadas anteriormente. A cada
48 horas de cultivo foi realizada tripzinização, contagem e determinação da
viabilidade celular de um poço/grupo usando a coloração de exclusão Trypan
blue (code no. T8154, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) em câmera de
Neubauer. Os dados obtidos foram inseridos numa curva de crescimento em um
software de analises de dados.

2.6. Teste de viabilidade com anexina V

A viabilidade celular foi realizada pelo método que avalia a ligação da anexina V
(eBioscience™ Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit. Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA) aos fosfolipídeos, que em células em apoptose migram para
região externa da membrana plasmática. O iodeto de propídeo foi associado a
anexina V a fim de identificar as células em necrose. Para a análise, foram
 46

utilizadas amostras colhidas de 6 animais. Após 48 horas de cultivo nas

diferentes condições experimentais (Figura 1) e a remoção do meio
condicionado pelas MSCs, as garrafas de cultivo foram lavadas com PBS e
tratadas com enzima de dissociação TrypLE (code no. 12563029, Life
Technologies, Carlsbad, CA, USA) por 10 minutos a 37 ºC. Após este período, o
conteúdo da garrafa foi depositado em um tubo plástico de 50 mL contendo 15
mL de meio de cultivo acrescido de 20% soro fetal bovino para neutralizar o efeito
enzimático. As amostras foram lavadas 3 vezes por centrifugação por 10 minutos
a 400 g e preparadas segundo recomendações do fabricante. Resumidamente
1 x 106 células/mL foram ressuspendidas em uma solução de marcação
contendo 5 µL de anexina V e 10 µL de iodeto de propidio. Então, as amostras
foram incubadas por 15 minutos a 37 °C e analisadas em citômetro de fluxo
FACSCalibur (Becton Dickinson® and Company, USA).
Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem de população de
células vivas, em necrose ou em apoptose. Células vivas não apresentam
marcação. Células em apoptose apresentam marcação positiva para anexina V
e negativa para iodeto de propídio (apoptose inicial) ou positiva para anexina V
e positivas para iodeto de propídio (apoptose tardia). Células em necrose
apresentam marcação negativa para anexina V e positiva para iodeto de
propídio,

2.7. PCR quantitativa em tempo real (RT- qPCR)

A investigação dos padrões globais de expressão de mRNA das MSCs colhidas
após 48 horas de cultivo celular (Figura 1) foi realizada por RT-qPCR, utilizando
o sistema Sybr Green™ PCR Master Mix (Applied Biosystems™) no
equipamento StepOnePlus™ System (Applied Biosystems™). Resumidamente,
as células dos diferentes grupos foram submetidas à extração e purificação do
RNA total com TRIzolÒ (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA). As
concentrações de RNA total foram mensuradas (NanoDrop™ 2000
Spectrophotometers, Thermo Scientific™). Em seguida, o RNA total foi tratado
com DNAse (Qiagen®) conforme protocolo do fabricante para eliminação de
contaminação com DNA genômico. Posteriormente, a transcrição do RNA em
cDNA foi realizada utilizando o kit de transcrição reversa (High-Capacity cDNA
Reverse Trancription Kit, Applied Biosystemsâ Thermo Fisher Scientific)
 47

respeitando as etapas de incubação de acordo com as recomendações de tempo

e temperaturas do fabricante.
A expressão relativa de cada gene alvo foi calculada utilizando o método ΔΔCt
e foi corrigida pela eficiência de amplificação das reações utilizando-se a
equação descrita por Pfaffl [6]. Os valores médios de eficiência para cada gene
foram calculados pelo perfil de amplificação de amostras individualmente pelo
software LinRegPCR 11.0. O GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foi
usado como gene de referência endógeno. A Tabela 1 descreve o painel de
genes alvos utilizados para análise de expressão gênica nas cAT-MSCs.
Tabela 1. Genes analisados em cAT-MSCs por RT-qPCR.

Tabela 1. Sequência de oligonucleotídeos dos genes utilizados para RT-qPCR.

Gene Gene name Sequence (5'-3') Biological
abbreviatio function of the
n gene
Bcl-2 [40] B-cell lymphoma 2 F: CCTGTGGATGACTGAGTACC Apoptose
R: GAGACAGCCAGGAGAAATCA
CASP8 [40] Caspase 8 F: ACAAGGGCATCATCTATGGCTCTGA Apoptose
R: CCAGTGAAGTAAGAGGTCAGCTCA
CASP9 [40] Caspase 9 F: TCAGTGACGTCTGTGTTCAGGAGA Apoptose
R: TTGTTGATGATGAGGCAGTAGCCG
DKC1 [41] Pseudouridine F: CTGCGGTAAAGAGGCAACTC Cell survival-
synthase Dyskerin R: GAATGTAGGTACCGGCCTCA related gene

HDAC1 [41] Histone F: GCTGCACCATGCAAAGAAGT Cell survival-

deacetylase 1 R: TCGCCGTGGTGAATATCAAT related gene

DNMT1 [41] DNA F: CCCAGACCGCTTCTACTTCC Cell survival-

methyltransferase 1 R: ACTTGGCTCGCATGTTTGAG related gene

HGF [42] Hepatocyte growth F: GGCTACTGCTCCCAAATTCCA Immunomodulator

factor R: CCCACATTGAACATGTTAGTCCAGA y gene

IDO [42] Indoleamine 2,3- F: GCTGGGTCTGCCTCCTATTC Immunomodulator

dioxygenase R: GCAGTCTCCACCAGGAAACC y gene

PGE2 [42] Prostaglandin E2 F: CTGTCATCACCGGCCAAGT Immunomodulator

R: CCTGGTCACTCCGGCAATA y gene

IL-6 [43] Interleukin-6 F: ATGATCCACTTCAAATAGTCTACC Immunomodulator

R: AGATGTAGGTTATTTTCTGCCAGTG y gene

bFGF [44] Basic fibroblast F: TTCAAGCAGAAGAGAGAGGAG Proliferation and

growth factor R: TCCGTAACACATTTAGAAGCC differentation
 48

MMP2 [45] Matrix F: ACTTTGATGACGATGAGCTATGGA Angiogenesis

metalloproteinase 2 R: CCGTCGGCATTCCCATACT
VEGF [45] Vascular F: TTGCTGCTCTACCTCCACCAT Angiogenesis
endothelial growth R: TGTGCTCTCCTCCTGCCATAG
factor
Cyclin D1 Cyclin D1 F: TGAACTACCTGGACCGCT Cell cycle regulator
[40] R: CAGGTTCCACTTGAGYTTGT
P53 [40] Tumor protein 53 F: ATGGGAGGCATGAACCGGCG Cell cycle regulator
R: CGGGACAGGCACAAACGCGT
HIF1-α [46] Hypoxia-inducible F: TTACGTTCCTTCGATCAGTTGTA Regulator of
factor 1-alpha R: GAGGAGGTTCTTGCATTGGAGTC response to
hypoxia
GAPDH [45] Glyceraldehyde-3- F: GATGGGCGTGAACCATGAG Housekeeping
phosphate R: TCATGAGGCCCTCCACGAT gene
dehydrogenase

2.8. Análise dos resultados

Todas as análises foram realizadas mediante o software estatístico JMP (SAS

Institute, Cary, NC, USA). Para as diferentes variáveis os testes de Shapiro Wilk
ou kolmogorov- smirnov foram implementados para verificar a normalidade y o
teste de manchly para verificar esfericidade. A Proliferação celular nos distintos
grupos a em 4 tempos diferentes foram analisados pelo teste anova de 2 vias
com medidas repetidas, tendo como pos hot o teste sidak. Para a variável
viabilidade celular com Anexina foi realizado teste anova de 1 via sem obter
diferença estatística. As medias dos efeitos do IFN-g, IFN-g/DFO e DFO na
abundância relativa de mRNA em cAT-MSCs caninas foram comparadas com o
teste de Tukey–Kramer (dados paramétricos) ou Kruskal-Wallis (dados no
paramétricos). Os dados são apresentados em medias ± SEM e diferenças foram
consideradas significantes quando p ≤ 0.05. As gráficas foram elaboradas
usando o paquete estatístico Graphpad Prism 9.

3. Resultados
 49

3.1. Morfologia celular

As 48 horas de cultivo, as células de todos os grupos mostraram morfologia
fibroblastoide e as células estavam aderidas ao plástico.

3.2. Teste de proliferação celular

As cAT-MSCs de todos os grupos apresentaram redução da concentração

celular após o início do cultivo até as 96 horas quando ouve uma estabilização
da concentração até as 144 horas (Figura 2) sem diferença entre os grupos (p ≤
0.05).

Figura 2. Curva de crescimento de células-tronco mesenquimais após 144 horas

em diferentes condições de cultivo celular. Dados representam medias de
células colhidas de 6 animais (p ≤ 0.05).

3.3. Teste de viabilidade com Anexina V

A viabilidade celular (Figura 3) se manteve acima de 90% nos diferentes grupos.

Células em apoptose inicial, apoptose tardia e em necrose representaram menos
 50

de 10% das células avaliadas nos diferentes grupos. Não houve diferenças entre
os parâmetros avaliados quando comparados entre os grupos experimentais (p
≤ 0.05).

Figura 3. Porcentagem de células vivas, em apoptose ou necrose após o cultivo

de células tronco mesenquimais nas diferentes condições experimentais (p ≤
0.05).

3.4. Real time quantitative reverse transcriptase-PCR

O efeito do IFN-g e DFO sobre a expressão gênica das MSCs caninas estão
representados na Figura 4. A abundância de transcritos para os genes
relacionados com apoptose, sobrevida celular, proliferação e diferenciação,
angiogênese, regulação do ciclo celular e regulador de resposta a hipóxia foi
maior no grupo IFN-g (p ≤ 0.05).
51
52
 53

Figura 4. Expressão de genes pró-apoptóticos (A, B e C) relacionados com

sobrevivência celular (D, E e F), imunomodulação (G, H, I e J), proliferação e
diferenciação (K), angiogênese (L e M), reguladores do ciclo celular (N e O) e
regulador celular de resposta adaptativa a hipoxia (P) nas células tronco
mesenquimais caninas derivadas de tecido adiposo cultivadas por 48 horas em
diferentes condições. Barras representam valores da média relativa
normalizados com o gene de referência GAPDH e erro padrão da média (┬ e ┴).
Médias denotadas por uma letra diferente indicam diferenças estatísticas
significativas entre os tratamentos (p < 0.05).

4. Discussão

Inúmeras estratégias visando garantir a eficiência e sobrevida de MSCs

transplantadas vem sendo investigadas para aumentar seus efeitos terapêuticos
 54

e de seus produtos [25,26,40,47–49]. Estratégias como a indução da hipóxia,

tem sido usada no tratamento de algumas doenças [26], entre elas o câncer e o
acidente vascular cerebral isquêmico[49,50]. O condicionamento das MSCs com
citocinas pro-inflamatórias para melhorar a capacidade imunorreguladora, de
diferenciação e angiogênese [51,52] também tem sido implementada. A
desferroxiamina e o IFN-g são sustâncias que foram testadas individualmente in
vitro em MSCs para mimetizar condições de hipóxia e a inflamação,
respectivamente [52,53], entretanto o condicionamento de cAT-MSCs com a
associação destas sustâncias, ainda não foi avaliado.
Na analises de proliferação celular evidenciamos que a concentração celular em
todos os grupos diminuiu com o tempo de cultivo até às 96 horas e
posteriormente se manteve até o fim do cultivo. Outros trabalhos concordam com
esses resultados descrevendo que o uso de IFN-g teve um efeito negativo na
proliferação celular de MSCs [2]. Da mesma forma, o uso de concentrações mais
elevadas de DFO (0.1 µmol) suprimem a proliferação de hBM-MSCs [53].
No presente trabalho sugerimos que o efeito negativo na proliferação celular,
observado em todos os grupos, pode estar associado com a ausência de SFB
na composição do meio de cultivo utilizado para este teste. A recuperação da
proliferação celular observada nos grupos no final da curva, aparentemente está
relacionada com a adaptação das células às condições de cultivo mediante
seleção de células resistentes a ausência de SFB e sua posterior replicação.
Cultivo por um período maior que 6 dias seria necessário para avaliar o
comportamento a longo prazo das cAT-MSCs as condições de cultivo (ausência
de soro). No entanto cultivos longos não foram realizados em nosso estudo.
Por outro lado, a análise da viabilidade celular, realizada após tratamento por
curto prazo (48 horas), com substâncias que mimetizam a hipóxia e o ambiente
inflamatório, demonstrou que 90% das células em cultivo se apresentavam
viáveis. O índice de células em apoptose e/ou necrose foi baixo em todos os
grupos estudados, independente da ausência do SFB e do tratamento utilizado.
Este resultado foi confirmado por outro estudo, que também observou mínima
proporção de células mortas ou em apoptose após o cultivo em hipóxia ou em
condições de inflamação [54].
 55

A análise da expressão gênica das cAT-MSCs demonstrou, de maneira geral um

efeito estimulatório do tratamento com IFN-g em relação às condições com DFO.
As cAT-MSC tratadas com DFO apresentaram menor expressão de transcritos
envolvidos na apoptose (Casp9) em relação ao controle. Já em relação ao grupo
estimulado com IFN-g, o grupo tratado com DFO apresentou menor expressão
de genes relacionados a sobrevivência celular (DKC1), regulação do ciclo (p53)
e proliferação celular (FGF2). Na verdade, o gene (VEGF) relacionado a
angiogenese, foi o único que se apresentou mais expresso no grupo tratado com
DFO quando comparado ao grupo IFN-g. O transcrito regulador mestre da
resposta celular à hipoxia (HIF1-a) esteve aumentado significativamente na
condição inflamatória quando comparado ao controle, mas não quando
comparado ao IFN-g.
No nosso estudo, a expressão do transcrito de sinalização pro-apoptotica Casp9,
esteve diminuído nos grupos tratados com DFO quando comparados com o
grupo controle. Resultados similares foram obtidos em outro estudo, onde a
expressão de genes pro-apoptoticos estiveram diminuídos em condições de
hipóxia em MSCs co-cultivadas com hepatócitos. Isto demostra um efeito
potencializador do precondicionamento com hipóxia sobre as capacidades
tróficas e anti-apoptoticas de MSCs [55].
A expressão do gene envolvido com sobrevivência celular DKC1 foi aumentada
pelo tratamento com IFN-g e diminuída pela hipóxia induzida pela DFO, enquanto
os genes DNMT1 e HDAC1 não se alteraram. Segundo a GeneCards [29] a
expressão do gene DKC1 está relacionada com adesão célula – célula e célula
– substrato, e em MSCs foi relacionado com a anti-senecensia mediante a uma
melhor migração e proteção celular [56] em cAT-MSCs de doadores jovens [41].
Já o HDAC1 tem um papel importante na regulação transcripcional, progressão
do ciclo celular e eventos de desenvolvimento. Os genes DNMT1 e HDAC1 estão
envolvidos na manutenção de atividades de metilação do DNA e na
acetilação/deacetilação de histonas, respectivamente. Até o momento, nosso
estudo foi o primeiro a descrever estes genes relacionados com a sobrevivência
celular em cAT-MSCs.
 56

A expressão do mRNA regulador do ciclo celular cyclin D1, não sofreu influência
das condições de cultura em hipóxia e inflamação. Por outro lado, a via para
produção do p53, conhecida como “guardiã do genoma” se encontrou
aumentada no grupo tratado com IFN-g em relação ao DFO. Choi et al. [17]
submeteram hAT-MSCs às condições de hipóxia e normóxia e também
observaram diminuição dos transcritos de p53 nas células em condições de
hipóxia. O p53 é induzido em resposta ao estrese genotoxico e oncogenico e
funciona como ponto de controle no câncer induzindo respostas proliferativas e
antiapoptoticas [57]. Acreditamos que a diminuição no p53 nos grupos tratados
com DFO é causada pela ausência de dano ao DNA indicado pelo baixo índice
de apoptose, diminuindo assim a necessidade de eliminação de células com
genoma defeituoso.
A via do p53 também é reguladora do ciclo e sobrevivencia celular, concordando
com a menor expressão do Casp9 evidenciada em nosso estudo. Maior
expressão de p53 induzido pela hipóxia (1,5% - 0,02%) já foi descrito em várias
linhagens celulares, porém associado a acidose/privação de nutrientes. Por
outro lado, nos cultivos tratados com 100 µM DFO, a expressão de p53 foi maior
independentemente do perfil de expressão da proteína HIF1-a, que é o regulador
celular mais importante nos processos adaptativos a condições de hipóxia. Tal
fato indica relação entre a via p53 ativada por hipóxia e a via de resposta
transcripcional da hipóxia central, a HIF-a [58], sugerindo que mudanças na p53
não são consequências obrigatórias do condicionamento com hipóxia.
Estudo conduzido em MSCs de ratos de 3 meses de idade demostraram que o
transcrito p53 esteve aumentado em células submetidas a condições de hipóxia.
No entanto, em células de animais mais velhos, a expressão de p53 foi menor
quando comparado com o grupo normóxia e com as células de animais jovens
[26]. Tal achado pode justificar a diminuição da p53 no nosso estudo, no qual a
idade das doadoras esteve ao redor de 3 anos. Acreditamos que concentrações
maiores que 50 µmol são necessárias para estimular estresse oxidativo
significativo e a síntese do supressor tumoral p53, uma vez que nos estudos
onde o transcrito esteve aumentado, foram utilizadas quantidades maiores que
100 µmol de DFO.
 57

O transcrito HIF1-a reconhecido por sua presença nos diferentes mecanismos

moleculares de resposta a alterações dos níveis de oxigênio [59] e como
regulador de milhares de genes para equilibrar o suprimento e demanda de
oxigênio [60]. O HIF induz a expressão de genes que controlam eventos cruciais
como angiogenese, sobrevivência celular e metabolismo da glicose [59]. Nas
condições do presente experimento, o HIF1-a esteve aumentado no grupo IFN-
g em relação ao grupo controle. Já foi demonstrado o envolvimento deste gene
em processos inflamatórios em MSCs, funcionando como via de ativação da
angiogênese [51,61]. Da mesma forma, Meiser [62] demonstraram que a
aquisição do fenótipo pro-inflamatório por macrófagos estimulados por LPS é
mediada pela estabilização do HIF1-a e pela modificação do consumo de glicose
nestas células. Segundo nossos resultados podemos relacionar o HIF1-a a
processos de sobrevida celular, proliferação e diferenciação, os quais também
se encontravam mais expressos no grupo IFN-g. Isto difere da literatura, onde a
expressão do HIF1-a tem sido vinculada com propriedades angiogenicas
geradas em condições de hipoxia, [63]. A falta de diferença entre o controle e o
grupo DFO poderia ser explicado pelo trabalho de Oses [64] onde a quantidade
de HIF1-a aumentou diretamente com o aumento da quantidade de DFO,
permanecendo iguais a expressão de transcritos dos outros genes avaliados nas
diferentes concentrações (150 e 400 μM). De maneira geral pode-se concluir que
o HIF1-a participa tanto das diferentes vias que controlam as alterações geradas
pelas flutuações nos níveis de oxigênio como em mecanismos que controlam a
inflamação [65] de cAT-MSCs.
Os genes responsáveis pela imunomodulação nas cAT-MSCs foram avaliados
pela expressão dos transcritos HGF, IL-6, PGE2 e IDO, e não foram observadas
variações significativas entre os grupos. A presença de fatores bioativos na
imunomodulação pelas MSCs está bem documentada, no entanto sua relação e
função durante este processo não está completamente elucidada.
Aparentemente a IDO regula a expressão genica associada à inflamação,
funcionando como fator de sinalização ou mediante a geração de intermediários
bioativos através da via de metabolização do triptofano em kinurenina [66]. Um
aumento na expressão de IDO foi observado por Rhijn [27], quando AT-MSCs
foram tratadas com a associação de IFN-g e TNF-a em condições de normóxia
 58

e hipóxia quando comparado com o grupo controle. Igualmente outros estudos

mostraram aumento na IDO utilizando 20 ng/mL de IFN-g [67], 200 ng/mL IFN-g
[42][de Oliveira Pinheiro 60] e 5 ng/mL de IFN-g associado ao TNF-a [14]. De
Oliveira [42] obteve resultados similares aos nossos para os transcritos HGF e
PGE2 sem alterações significativas com a adição de IFN-g no meio de cultivo.
No entanto, a secreção dos fatores bioativos relacionados a estes genes tem
sido repetidamente reportada em MSCs [68]. Aparentemente a atividade
imunorreguladora das MSCs é governada por estes e outros transcritos
fornecendo proteção contra a citotoxicidade mediada por NK [35]. [69]Tu e
colaboradores afirmam que as MSCs inibem a ativação do complemento
mediante a produção do fator H e sua regulação é potencializada pela influência
do pré-condicionamento com IFN-g e TNF-a. Este pode ser um dos mecanismos
pelo qual as MSCs promovem a atividade imunoduladora. No entanto ainda
existe discrepância sobre os genes específicos que controlam as propriedades
inmunomoduladoras, variando significativamente pelas condições de cultivo, a
citocina utilizada para o precondicionamento, a adição ou não de SFB e o tipo
de cultivo, entre outros [35,70].
Um outro mecanismo foi proposto por Krampera [22] da ISCT (do inglês,
International Society for Cell Therapy), onde afirma que o IFN-g é a principal
citocina pro-inflamatória capaz de ativar eficientemente as atividades
imunomoduladoras das MSCs, uma vez que entram em contato com a célula
imune efetora. A ausência de diferença observada nos genes imunomoduladores
em nosso experimento possivelmente está relacionada a eliminação do SFB na
composição do meio de cultivo, o que é um fator estressante para as células.
[70] Já foi demonstrado que o uso de IFN-g e TNF-a em MSCs, aumentou a
expressão de genes para fatores imunomoduladores em presença de SFB
quando comparado a grupos livres de SFB. Segundo os autores, o sucesso da
obtenção das propriedades imunomodularas por parte das MSCs depende de
parâmetros específicos, como a composição do meio e o método de cultivo [70].

O FGF2, envolvido com proliferação e diferenciação, teve um comportamento

heterogêneo em comparação com outros estudos. O gene FGF2 foi mais
expresso no grupo IFN-g quando comparado com os demais grupos. Este fator
 59

de crescimento é um potente mitogeno para vários tipos de células e pode

promover migração, proliferação e diferenciação de MSCs, além de estimular a
produção de outros tipos de fatores de crescimento que funcionam como
coadjuvante para a reparação tecidual [44]. Existem vários estudos que reportam
um aumento deste gene quando o IFN-g ou TNF-a foram acrescentados nas
culturas de MSCs [2,15]. Por outro lado, a adição de DFO gerou resultados
discrepantes na expressão de FGF2 entre os diferentes estudos. De acordo com
Oses [64], a adição de DFO não alterou a expressão deste transcrito,
concordando com nossos resultados. Em outro estudo o FGF2 esteve diminuído
com a adição de DFO quando comparado com o controle [4], enquanto um
aumento na expressão de bFGF foi relatado em condições de hipóxia [17]. De
maneira geral, a literatura reporta opiniões diferentes sobre os mecanismos que
regulam a proliferação e diferenciação das MSCs, e a grande maioria informa
um aumento de distintos fatores de crescimento em resposta a condições
estressantes como inflamação, hipóxia e endotoxinas [15,71].
Um dos genes mais estudados, o VEGF, implicado amplamente no processo de
reparação mediante sua propriedade angiogenica [71] e de diferenciação [72],
foi o único aumentado pela aplicação de DFO e inibido pelo IFN-g. Estudos
referem resultados similares, tanto com o uso do DFO ou da hipóxia
[17,26,64,71,73,74]. Células endoteliais de veias umbilicais tiveram maior
vitalidade e baixa apoptose quando cultivadas com meio condicionado de MSCs
tratadas com hipóxia, assim como um incremento significativo de estruturas
capilares; todo isto governado por citosinas proangiogenicas, entre elas o VEGF,
uma vez que anticorpos contra estas citosinas inibiram a formação de capilares
[3]. Outros somente observaram regulação deste gene quando usaram dose de
DFO de 300 μmol [4,15]. Além de suas capacidades angiogenicas, foi
demostrado que o VEGF esteve aumentado em alguns processos de
diferenciação condrogenica de MSCs cultivadas baixo condições de hipóxia [75].
O outro transcrito pro-angiogenico MMP2 não apresentou diferenças entre os
grupos estudados. Alguns trabalhos relacionaram este gene com a habilidade de
migração, viabilidade e progressão de células tumorais [45]. No entanto, outros
pesquisadores reportam as mesmas propriedades em MSCs sem o aumento do
MMP2 e sim do VEGF [76]. Nós achamos que a carência do aumento nas cAT-
MSCs de MMP2 foi causada pelos inibidores de tecido de metaloproteinasas
 60

(TIMPs). Segundo Lozito [77] a exposição das MSCs a fatores estressantes

como hipóxia e inflamação promove proteção da matriz mediante a expressão
de TIMPs e, por conseguinte, aumentada inibição de MMPs. Existe muito por
esclarecer sobre fatores pro-angiogenicos, se estes funcionam positivamente em
condições estressantes, uma vez que tanto em células normais como tumorais
estes fatores podem estimular a formação de novos vasos sanguíneos.
No presente experimento o HGF, um fator reconhecido em processos de
reparação com função antifibrotica não foi alterado pelo pre-condicionamento
com DFO e IFN-g. No entanto, resultados diferentes foram observados em outro
trabalho [71], onde o tratamento com o TNF-a aumentou a expressão de HGF.
Ren [11] demonstrou que o HGF funciona como efetor do fator VEGF em
condições de hipóxia, porém não observou diferença na expressão deste
transcrito entre os grupos hipóxia e normóxia. Pela afirmação anterior pode-se
concluir que sua secreção pode ser tecido-dependente [78]. Um estudo afirma
que o TNF-a produz efeitos similares ao IFN-g nas MSCs, entre eles, regular a
expressão de alguns fatores como o FGF2 e o HGF [71] e a indução da
capacidade imunossupressora de células T por parte das MSCs quando usados
em conjunto [79].
Inúmeros trabalhos da literatura demonstram que as condições de cultivo afetam
as propriedades das cAT-MCSs de diversas formas. No entanto, no presente
experimento observamos que a adição de IFN-g e DFO para mimetizar condições
de inflamação e hipóxia, respectivamente, não teve influência sobre a viabilidade
celular. Da mesma forma, os genes relacionados às propriedades de
imunomodulação não foram afetados pelos tratamentos utilizados. Apesar disso,
o estimulo das células com IFN -g elevou a expressão de genes relacionados a
apoptose (Casp9), sobrevivência celular (DKC1), regulação do ciclo celular
(p53), proliferação celular (FGF2) e regulação de resposta a hipoxia (HIF1-a).
Por outro lado, como esperado, o uso do DFO estimulou a expressão do (VEGF),
relacionado à angiogenese, quando comparado ao grupo IFN-g.

5. Conclusão
 61

Foi demonstrado que o estímulo das cAT-MSC com a citocina pro-inflamatória

IFN-g induziu a um estimulo para aumentar a sobrevivência e proliferação celular.
Já a mimetização de hipóxia, levou a uma diminuição da expressão de genes
relacionados a estes fatores associada a um estímulo para a angiogenese.
Apesar disso, os genes relacionados a imunomodulação não foram influenciados
pelas condições de cultivo. Os resultados obtidos indicam que os genes
envolvidos nos processos de indução da regeneração tecidual foram mais
afetados pelas condições de cultivo, em comparação aos relacionados com
propriedades imunomoduladoras das cAT-MSC.

6. Agradecimentos
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de
Financiamento 001

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