Publico 063

KÁTIA LUCIANO PEREIRA MORAIS
A diversidade estrutural de peptídeos potenciadores da

bradicinina da Bothrops jararaca (Bj-BPPs) proporciona ações
sinérgicas no sistema cardiovascular.
Dissertação apresentada à Universidade

Federal de São Paulo para obtenção do
título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2010
KÁTIA LUCIANO PEREIRA MORAIS
A diversidade estrutural de peptídeos potenciadores da

bradicinina da Bothrops jararaca (Bj-BPPs) proporciona ações
sinérgicas no sistema cardiovascular.
Dissertação apresentada à Universidade

Federal de São Paulo para obtenção do
título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Martins de Camargo
Co-orientadora: Dra. Claudiana Lameu
São Paulo
2010
Dissertação elaborada no Laboratório
Especial de Toxinologia Aplicada (CAT-
CEPID) do Instituto Butantan, durante o
curso de Pós-Graduação em Biologia
Molecular e apresentada à Universidade
Federal de São Paulo como requisito
para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Apoio Financeiro: CNPQ / FAPESP

Dedico esse trabalho ao Dú, meu marido, pelo
amor e apoio, pelas palavras de animo, pela
paciência, pela companhia e por tudo o que ele
faz por mim.

A minha querida mãe e a minha adorada avó
que sempre acreditaram em mim.

Ao Criador graças por tudo o que Ele realizou
em minha vida durante essa etapa, o meu
coração transborda de alegria e gratidão a esse
Deus.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos de Martins de Camargo pela oportunidade,

pelos ensinamentos, pelo incentivo a uma reflexão científica.
A Dra. Claudiana Lameu por toda ajuda, pela paciência, pela amizade,
pelo respeito, pelo empenho para que esse trabalho se concretizasse.
A Dra. Daniele Ianzer e ao colega de laboratório José Rodolfo Miranda
pelos experimentos de avaliação de parâmetros cardiovasculares e potenciação
de BK.
Ao Dr. Juliano Guerreiro pela ajuda no desenvolvimento desse trabalho.
A Dra. Solange Serrano e a Dra. Vanessa Rioli pelas discussões sobre a
expressão da proteína recombinante.
A Dra. Marina Assakura pela atenção e disposição em atender a todas as
necessidades para realização desse projeto.
A Dra. Beatriz L. Fernandes pela revisão do texto.
Ao Dr. Robson Mello pela síntese e purificação dos peptídeos.
Ao Ms. Clécio F. Klitzke pelas análises no espectrômetro de massas.
Ao Mr. Gabriel Benedetti pela amizade, pela companhia, pelas caronas,
pela ajuda, pelas aulas, etc.
A todos os colegas do laboratório Bruno P, Bruno D, Joyce, Joana,
Liliane, Eduardo, Juliana F, Juliana Y, Milene, André, Priscila, Amanda, Mara,
Carlos.
A aquelas que ser tornam verdadeiras amigas Aparecida Siqueira (Cida),
Erica, Michele, Mariana, Rosi.
A, Aparecida das Dores (Dadá), Vera Lúcia, Silvia Rossí, Neusa Lima,
Maria José que mesmo com sua simplicidade se tornaram muito importantes.
À FAPESP.
Ao CNPQ pelo apoio financeiro.
Lista de Figuras e Tabelas
Figura 1 - Ação da ECA sobre os: sistema renina-angiotensina (SRA) e sistema calicreína-cinina
(SCC) e a interferência dos Bj-BPPs em ambos sistemas.......................................................... 26
Figura 2 – Representação esquemática das funções da ASS em mamíferos. .............................. 32
Figura 3 – Vasodilatação promovida pelo NO devido ao relaxamento da musculatura lisa do vaso

.......................................................................................................................................................... 44
Figura 4 – Representação esquemática da transdução de sinal induzida pelo Bj-BPP-10c. ........ 45
Figura 5 – Representação esquemática da reação catalisada pela ASS. ...................................... 59
Figura 6 – Efeito hipotensor da BK na pressão arterial de ratos Wistar anestesiados antes e após
administração de Bj-BPPs.. ............................................................................................................. 65
Figura 7 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

administração do Bj-BPP-5a ............................................................................................................ 68

administração do Bj-BPP-9a ............................................................................................................ 69

administração do Bj-BPP-10c .......................................................................................................... 70

administração do Bj-BPP-11e. ......................................................................................................... 71

administração do Bj-BPP-12b. ......................................................................................................... 72

administração do BPP-13a. ............................................................................................................. 73

administração do veículo. ................................................................................................................ 74
Figura 14 – Perfil eletroforético em gel de agarose mostrando fragmentos de DNA. .................... 77
Figura 15 – Perfil eletroforético da ASS recombinante humana em gel 10% de SDS-poliacrilamida.

.......................................................................................................................................................... 78
Figura 16 – Análise por Western blot da ASS humana recombinante obtida pela expressão em E.
coli. ................................................................................................................................................... 78
Figura 17 – Caracterização da atividade enzimática da ASS recombinante utilizando o método de

colorimetria. ...................................................................................................................................... 81
Lista de Figuras e Tabelas
Figura 18 – Efeito do MDLA na atividade enzimática da ASS recombinante. ................................ 81
Figura 19 – Efeito de concentrações crescentes dos Bj-BPPs sobre a atividade enzimática de 1 g

de ASS recombinante. ..................................................................................................................... 83
Figura 20 – Produção de NO por células HEK293 estimuladas com concentrações crescentes

(0,03 - 3 M) de BPPs ...................................................................................................................... 86
Figura 21 – Intermediação dos receptores B2 de cininas e muscarínico do subtipo M1 na

produção de NO induzida pelo Bj-BPP-5a em células HEK293. ..................................................... 87
Figura 22 – Intermediação da ASS e do receptor muscarínico do subtipo M1 na produção de NO

induzida pelo BPP-13a em células HEK293. ................................................................................... 88
Figura 23 – Interferência dos inibidores na resposta de agonistas de receptores 2-adrenérgico,

B2 de cininas, muscarínicos do subtipo M1, M2 e M3. .................................................................... 89
2+
Figura 24 – Mobilização da concentração de cálcio intracelular ([Ca ]i) em HEK293 estimuladas
com concentrações crescentes dos Bj-BPPs 5a, 9a, 11e, 12b e 13a. ............................................ 91
Tabela 1 - Peptídeos Potenciadores da Bradicinina (“Bradykinin Potentiating Peptides” - Bj-BPPs)

do veneno da serpente Bothrops jararaca. ...................................................................................... 22
Tabela 2 - Atividade biológica dos Bj-BPPs I. ................................................................................. 29
Tabela 3 - Ensaios in vivo de alguns Bj-BPPs encontrados no cérebro e veneno da Bothrops

jararaca ............................................................................................................................................ 75
Tabela 4 - Confirmação da identidade da ASS recombinante por espectrometria de massas. .... 79
Tabela 5 - Validação da atividade enzimática da ASS recombinante. ........................................... 82
Tabela 6 - Atividade biológica dos Bj-BPPs II.. ............................................................................. 110

Abreviaturas
4-DAMP 4-Diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide
ACh acetilcolina
ACN acetonitrila
AMP adenosina mono-fosfato
ASL argininosuccinato liase
ASS argininosuccinato sintase
ATP adenosina tri-fosfato
BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
Bj Bothrops jararaca
BK bradicinina
BPF fatores potenciadores da bradicinina
BPPs peptídeos potenciadores da bradicinina
BSA albumina sérica bovina
[Ca2+]i concentração de Ca2+ intracelular
CAT1 transportador de aminoácidos catiônico 1
CIRC liberação de cálcio mediada por cálcio
CNP peptídeo natriurético do tipo-C
cGMP monofosfato de guanosina cíclica
DMEN dulbecco’s modified eagle medium
ECA enzima conversora de angiotensina
EDHF fator hiperpolarizante derivado de endotélio
eNOS óxido nítrico sintase endotelial
FC freqüência cardíaca
HEK human embryonic kidney
HPLC cromatografia líquida de alta pressão

Abreviaturas
iNOS óxido nítrico sintase induzível
IP3 inositol 1,4,5-trisfosfato
LB luria bertani
MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight
MDLA ácido metil DL aspártico
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NBT nitro blue tetrazolium
NO óxido nítrico
NO2 dióxido de nitrogênio
NOS óxido nítrico sintase
nNOS óxido nítrico sintase neuronal
NOx óxido nítrico total
PAM pressão arterial média
RAS sistema renina-angiotensina
SCC Sistema calicreínas-cininas
SDS dodecil sulfato de sódio
SHR ratos espontaneamente hipertensos
SNC sistema nervoso central
TFA ácido trifluoracético

Sumário
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 19
1.1 Descrição e definição dos Peptídeos Potenciadores da Bradicinina (Bj-
BPPs) ................................................................................................................ 20
1.2 Efeitos dos Bj-BPPS sobre o sistema calicreína-cininas e reninina-
angiotensina ...................................................................................................... 23
1.3 Bj-BPPs como modelo estrutural para o desenvolvimento do captopril. ..... 26
1.4 Evidências de diferenças funcionais e de mecanismo de ação entre os
BPPs ................................................................................................................. 28
1.5 Participação da ASS em processos bioquímicos e seus impactos
fisiológicos. ........................................................................................................ 30
1.6 Produção de NO e sua participação na regulação da pressão arterial. ....... 34
1.7 Sinalização por cálcio .................................................................................. 37
1.8 Possíveis alvos e mecanismos de ação dos Bj-BPPs ................................. 41
2. OBJETIVOS...................................................................................................... 46
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 48
3.1 Síntese e purificação dos peptídeos (Bj-BPPs) ........................................... 49
3.2 Potenciação do efeito hipotensivo da bradicinina pelos Bj-BPPs em ratos
anestesiados ..................................................................................................... 50
3.3 Aquisição dos parâmetros cardiovasculares de ratos acordados tratados
com os Bj-BPPs................................................................................................. 51
3.4 Obtenção da ASS humana recombinante ................................................... 52
3.4.1. Subclonagem em vetor de expressão .................................................. 52

Sumário
3.4.2 Expressão e purificação da proteína ASS ............................................. 54
3.4.3 Eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e Western blot................... 55
3.4.4 Espectrometria de Massas .................................................................... 57
3.4.5 Determinação da atividade enzimática da ASS .................................... 58
3.5 Cultura de Células HEK 293 (human embryonic kidney 293) ...................... 59
3.6 Quantificação da concentração de NO ........................................................ 60
3.7 Medidas de variação da concentração de cálcio intracelular livre [Ca 2+]i..... 61
3.8 Análise Estatística ....................................................................................... 61
4.RESULTADOS .................................................................................................. 63
4.1 Potenciação da BK pelos Bj-BPPs sobre a pressão arterial de ratos Wistar
anestesiados. .................................................................................................... 64
4.2 Efeitos cardiovasculares da administração intravenosa de Bj-BPPs em ratos
espontaneamente hipertensos acordados ......................................................... 66
4.3 Clonagem e expressão da ASS recombinante humana .............................. 76
4.4 Efeito dos Bj-BPPs sobre a atividade catalítica da ASS .............................. 79
4.5 Efeito dos Bj-BPPs na produção de NO por células HEK293...................... 84
4.5 Mobilização de [Ca2+]i induzida pelos Bj-BPPs em células HEK 293 .......... 90
5.DISCUSSÃO ...................................................................................................... 92
5.1 Os BPPs apresentam efeitos diferenciados sobre o RAS e SCC ................ 93
5.2 ASS como alvo para os Bj-BPP-5a, Bj-BPP-10c, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a
.......................................................................................................................... 98
Sumário
5.3 A Produção de NO pode não ser o único mecanismo de ação dos Bj-BPPs
para promover vasodilatação .......................................................................... 100
5.4 Os Bj-BPPs encontrados na proteínas precursora dos BPPs e do CNP no
cérebro de serpentes são capazes de mobilizar de [Ca2+]i.............................. 103
6.CONCLUSÃO .................................................................................................. 106
7.REFERÊNCIAS ............................................................................................... 111
8.ANEXOS .......................................................................................................... 127

RESUMO
Morais, KLP. A diversidade estrutural de peptideos potenciadores da
bradicinina da Bothrops jararaca (Bj-BPPs) proporciona ações sinérgicas no
sistema cardiovascular.
Nosso laboratório mostrou que um único gene codifica um precursor protêico,
cujo processamento gera o peptídeo natriurético tipo C (CNP) e uma variedade de
peptídeos ricos em prolina, conhecidos como peptideos potenciadores da
bradicinina ou BPPs. Com pequenas diferenças, esse precursor é expresso na
glândula do veneno e na região neuro-endócrina do cérebro da Bothrops jararaca.
Todos os produtos desse processamento têm como característica comum sua
ação sob o sistema cardiovascular, levando à redução da pressão arterial e da
frequência cardíaca. Esse fato intrigante levou-nos a questionar se esses
diferentes peptídeos teriam mecanismo de ação semelhante.
Surpreendentemente, esse trabalho mostrou que a resposta é negativa embora
ainda não possamos explicar detalhadamente como cada um desses peptídeos
atua no complexo mecanismo responsável pelo tônus vascular e pela frequência
cardíaca.
Historicamente, a demonstração de que os peptídeos potenciadores da
bradicinina da Bothrops jararaca (Bj-BPPs) eram inibidores naturais da enzima
conversora de angiotensina (ECA) teve ampla repercussão médica. Essa inibição
parecia explicar a forte ação anti-hipertensiva desses peptídeos, dai servirem de
modelo estrutural para o desenvolvimento de um inibidor sítio-dirigido, o Captopril,
medicamento mundialmente utilizado para o tratamento da hipertensão arterial
sistêmica humana. Contudo, recentes evidências experimentais sugerem que a
atividade anti-hipertensiva dos Bj-BPPs não está relacionada somente com a
inibição da ECA. Nosso grupo demonstrou para o Bj-BPP-10c que sua ação anti-
hipertensiva se deve à ativação da geração de L-arginina, essencial para
produção de óxido nítrico, potente vasodilatador, bem como pela regulação do
barorreflexo arterial e pela sinalização de cálcio intracelular, ações que
contribuem para a produção de NO em células endoteliais e neurais. Outros Bj-
BPPs derivados do mesmo precursor foram aqui analizados. Demonstramos que
o mecanismo de ação do Bj-BPP-5a envolve receptores B2 da bradicinina, o
receptor muscarínico do subtipo M1 e a produção de NO. Curiosamente, o Bj-
BPP-9a que serviu de modelo para a síntese do Captopril, parece atuar
predominantemente como um clássico inibidor da ECA. O Bj-BPP-11e deve ter
ação num receptor de membrana, assim explicando seus efeitos sobre
parâmetros cardiovasculares. O mecanismo de ação do Bj-BPP-12b poderia ser
explicado pela potenciação da BK e/ou pela inbição da ECA e do Bj-BPP-13a por
ação em receptor muscarínico do subtipo M3 e sobre a ASS.
Adicionalmente, o presente trabalho mostrou, pela primeira vez na área de
toxinologia, que toxinas de serpentes já se valem do recurso bem conhecido na
geração de hormônio-peptídeos em mamíferos, isto é, utilizam o processamento
de uma poliproteina para gerarem peptídeos de ação sinérgica.
Palavras-chave: peptídeos potenciadores da bradicinina, óxido nítrico, anti-

hipertensivo, argininosuccinato sintase, receptores muscarínicos, enzima
conversora de angiotensina.
SUMMARY
Morais, KLP. The structural diversity of the proline-rich oligopeptides from
Bothrops jararaca (Bj-BPPs) provides synergistic cardiovascular actions.
Our laboratory has shown that one gene codes for the protein precursor that yields
the natriuretic peptide type C (CNP) after having been processed, along with a
variety of proline-rich peptides, known as bradykinin-potentiating peptides or
BPPs. Showing little differences, this precursor is expressed in the venom gland
and the neuroendocrine region of the Bothrops jararaca brain. All processing
products have in common that they act on the cardiovascular system, lowering
arterial blood pressure and heart frequency. This intriguing fact led us to question
whether the different peptides display similar mechanisms of action. Surprisingly,
the present study showed that the answer is negative, although we cannot, at the
present time, explain in full detail how each peptide acts in the complex
mechanism, responsible for vascular tonus and cardiac frequency.
Historically, the demonstration that the Bradykinin-Potentiating Peptides from
Bothrops jararaca (Bj-BPPs) were natural inhibitors of the angiotensin converting
enzyme (ACE) had a wide medical impact. In fact, this inhibition seemed to fully
explain the strong anti-hypertensive action of these peptides, therefore being
employed as structural models for the development of a site-directed inhibitor,
Captopril, a drug used worldwide for the treatment of systemic human arterial
hypertension. Recent experimental evidences, however, suggest that the anti-
hypertensive activity of the Bj-BPPs is not due exclusively to the inhibition of the
ACE. Our group demonstrated that the antihypertensive action of Bj-BPP-10c, for
instance, is due to the activation of L-arginine generation, which is essential for
NO production, a potent vasodilator. Moreover, it also regulates the arterial
baroreflex and intracellular calcium signaling, which contribute to NO production in
endothelial and neuronal cells.
In the present work we studied the mechanism of action of other Bj-BPPs found in
the above mentioned precursor. We showed that the mechanism of action of Bj-
BPP-5a involves bradykinin B2 receptor, the muscarinic receptor, subtype M1, and
NO production. Bj-BPP-11e probably acts on a membrane receptor, thereby
explaining its effects on cardiovascular parameters. The mechanism of action of
Bj-BPP-12b might be explained by Bk potentiation and/or by ACE inhibition and Bj-
BPP-13a action on by muscarinic receptor subtype M3 and the ASS. Interestingly,
Bj-BPP-9a, which was the model molecule for the synthesis of Captopril, seems to
act predominantly as a classic ACE inhibitor.
Beside the pharmacological interest, our work also revealed, for the first time, that
snake toxins also employ the well-known strategy in hormone-peptide generation,
that is, they use the processing of a polyprotein to generate peptides which display
a synergistic action.
Keywords: bradykinin potentiating peptides, nitric oxide, antihypertensive,

argininosuccinate synthetase, muscarinic receptors, angiotensin I-converting
enzyme.
Dissertação de Mestrado – Universidade Federal de São Paulo 19
1. INTRODUÇÃO
1.1 Descrição e definição dos Peptídeos Potenciadores da Bradicinina (Bj-
BPPs)
O veneno das serpentes peçonhentas tem como principal função a
imobilização das presas para garantir sua alimentação e sobrevivência. Devido à
grande quantidade e diversidade de moléculas presentes em seus venenos,
esses animais tem cativado pesquisadores ao longo dos tempos. As toxinas
produzidas pelas glândulas de veneno são injetadas na corrente sangüínea das
vítimas causando inúmeros efeitos, como por exemplo, distúrbios na coagulação
sangüínea, efeitos citotóxicos, hemólise, hemorragia local e sistêmica, necrose
tecidual, efeitos neurotóxicos e hipotensão (Bjarnason e Fox, 1998; Walter et. al.;
1999; Tanen et. al., 2001).
O veneno das serpentes é constituído por uma mistura complexa de
proteínas e peptídeos biologicamente ativos (Bjarnason e Fox, 1998; Walter et.
al., 1999; Tanen et. al., 2001). Alguns desses peptídeos bioativos do veneno de
serpentes são sintetizados como proteínas precursoras que, após o
processamento proteolítico, geram o polipeptídeo maduro ativo (Kini, 2002). Esse
é o caso, por exemplo, para os peptídeos potenciadores de bradicinina
(“bradykinin potentiating peptides” – BPPs) presentes no veneno da Bothrops
jararaca (Bj-BPPs).
Os Bj-BPPs são moléculas capazes de potenciar algumas atividades
farmacológicas da bradicinina (BK), como a ação contrátil da musculatura lisa do
íleo isolado de cobaia, ex vivo (Ferreira, 1965) e in vivo no sistema nervoso
central (SNC), cardiovascular e antinociceptivo (Ribeiro et al., 1971).

O isolamento dos primeiros Bj-BPPs produzidos pela glândula de veneno
de Bothrops jararaca aconteceu em meados dos anos 60, e foram inicialmente
chamados de fatores de potenciação da BK (Bradykinin potentiating factors -
BPFs) (Ferreira, 1965). Apenas em 1970, quando foram caracterizados como
moléculas peptídicas foram nomeados como Bj-BPPs (Ferreira et. al., 1970).
Desde então, outros peptídeos com característica estrutural de um BPP foram
isolados do veneno dessa serpente (Ondetti et al., 1971). Em 1997 Murayama et
al. (1997) clonaram o cDNA que codifica esses peptídeos e observaram que os
Bj-BPPs são produtos do processamento da proteína precursora do peptídeo
natriurético do tipo-C (Bj-CNP). A partir desse estudo duas novas seqüências com
características estruturais de Bj-BPPs foram identificadas. Como esse trabalho
sugeriu a existência de outros Bj-BPPs, Ianzer et. al. (2004) buscaram e isolaram
mais cinco novos peptídeos do veneno da Bothrops jararaca. O fato dos Bj-BPPs
serem produzidos na mesma proteína precursora do CNP, um hormônio, sugeriu
a expressão da proteína precursora dos Bj-BPPs e CNP em outros tecidos além
da glândula. Foi, então, clonado e seqüenciado o precursor de Bj-BPPs e CNP do
cérebro da serpente que continha duas novas seqüências de putativos Bj-BPPs
(Hayashi et. al., 2003) (Tabela 1).
Os Bj-BPPs são peptídeos de 5 a 14 resíduos de aminoácidos que
possuem como característica estrutural um resíduo piroglutâmico no N- terminal,
alto conteúdo de prolinas e um resíduo de prolina na posição C-terminal (Ferreira
et al., 1970; Ondetti e Cushmann, 1984). Os peptídeos contendo mais de sete
resíduos de aminoácidos terminam com o tripeptídeo Ile-Pro-Pro e possuem
vários resíduos de prolina nas suas regiões internas (Ferreira et. al., 1970; Freer e
Stewart et. al., 1971; Ianzer et. al., 2004) (Tabela 1), o que lhes confere certa
resistência à hidrólise por aminopeptidases, carboxipeptidases e endopeptidases
(Cheung e Cushman, 1973; Ianzer, 2001).
Tabela 1 - Peptídeos Potenciadores da Bradicinina (“Bradykinin Potentiating Peptides” - Bj-

BPPs) do veneno da serpente Bothrops jararaca. A nomenclatura dos Bj-BPPs é baseada
no tamanho (número de resíduos) e na ordem cronológica de descoberta (letras) no veneno
das serpentes. <E = ácido piroglutâmico
Sequência de aminoácidos Nomenclatura MW (Da) Potenciação da BK

a,c,d,e
< E KW AP BPP-5a 611,7 +++
e
< EW PRP BPP-5b 665,8 +
a,e
< E SW PG P BPP-6a 653,7 +
e
< ED G PI P P BPP-7a 705,8 +
a,b,e
< EW PRPQ I P P BPP-9a 1101,3 +++
a,b,c,e
< E SW PG PNI P P BPP-10a 1075,2 ++
b,e
< ENW PRPQ I P P BPP-10b 1215,4 ND
a,b,c,d,e
< ENW PHPQ I P P BPP-10c 1196,3 +++
b,e
< EW PRPT PQ I P P BPP-11a 1299,5 ND
c,e
< EG R AP G PP I P P BPP-11b 1069,2 ++
d
< EG R AP H P PI P P BPP-11c 1149,3 ++
e
< EG R PP G PP I P P BPP-11d 1095,3 ND
d
< E AR P P H P PI P P BPP-11e 1189,4 ++
a,e
< EGW AW PRPQ I P P BPP-12a 1415,6 +++
d
< EW G RPP G PP I P P BPP-12b 1281,5 +++
e
< EW AQW PRPQ I P P BPP 12c 1485,8 ND
d,e
< EG GW PRPG P EI P P BPP-13a 1370,5 +++
a,b,c,d,e
< EG G L PR PG P E I P P BPP-13b 1297,5 +++
e
< EW AQW PRPT PQ I P P BPP-14a 1683,85 ND
a
Ferreira et. al., 1970;
b
Ondetti et. al., 1971;
c
Murayama et. al., 1997;
d
Hayashi et. al., 2003;
e
Ianzer et. al., 2004.
1.2 Efeitos dos Bj-BPPS sobre o sistema calicreína-cininas e renina-
angiotensina
A BK, um nonapeptídeo (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg)
identificado por Rocha e Silva et. al. (1949), pertence a um grupo de polipeptídeos
conhecidos como cininas, que são derivados de uma proteína mais complexa, o
cininogênio, pela ação da enzima calicreína (Meki et. al., 1995).
As cininas geradas através da cascata metabólica do sistema calicreínas-
cininas (SCC) estão envolvidas em vários processos fisiológicos e patológicos, e
podem causar vasodilatação, aumentar permeabilidade vascular, liberar o
ativador do plasminogênio de tipo tecidual, estimular a produção de óxido nítrico
(NO) e mobilização de ácido araquidônico. Resumidamente, podemos dizer que
as cininas participam fisiologicamente da regulação de pressão sanguínea,
funções renal e cardíaca e de processos patológicos como inflamação (Moreau et.
al., 2005).
As diversas atividades farmacológicas das cininas são mediadas através
de ligações com dois tipos de receptores específicos (receptores B1 e B2), antes
de serem metabolizadas por diversas peptidases (Marceau et. al., 1998; Leeb-
Lundberg et. al., 2005). As ações como vasodilatação e hipotensão são mediadas
pelo receptor B2, pela liberação de NO, prostaciclinas e fator hiperpolarizante
derivado de endotélio (EDHF) (Couture e Girolami, 2004). Enquanto as ações
mediadas pelos receptores B1 inclui uma importante função na angiogênese
(Campbell, 2003).
As peptidases (zinco metalopeptidases) são as principais responsáveis
pela degradação da BK, entre elas, a enzima conversora de angiotensina (ECA),
a NEP, a aminopeptidase P e as carboxipeptidases M e N (Margolius, 1995).

A ECA é uma enzima chave no sistema renina-angiotensina (RAS). Esse
sistema está envolvido no controle da pressão arterial e do balanço hídrico
corporal e tem seus efeitos mediados pela produção ou ativação de diversos
fatores de crescimento, substâncias vasoativas, peptídeos, receptores e enzimas,
induzindo vasoconstricção e hipertrofia celular.
A cascata representada pelo RAS inicia-se pela liberação de renina pelos
rins, que cliva o angiotensinogênio plasmático, produzido pelo fígado, formando
angiotensina I, que em seguida é clivada pela ECA, gerando angiotensina II (um
potente vasoconstritor. A angiotensina II tem suas ações mediadas pelos
receptores AT1 e AT2. A ligação da angiotensina II em receptor AT1 desencadeia
processos celulares produzindo vários efeitos, dentre eles, vasoconstrição,
síntese protéica, crescimento celular, regulação da função renal e do equilíbrio
hidroeletrolítico (Ardaillou e Michel, 1999; De Gasparo et. al., 2000).
A ECA possui dois sítios ativos homólogos, um localizado no seu C-
terminal e outro no N-terminal e ambos possuem um íon zinco ligado, essencial à
atividade catalítica. Assim, os inibidores da ECA competem com o substrato
natural pelo zinco(II) no sítio ativo e também através de ligações de hidrogênio e
interações hidrofóbicas.
Embora os dois sítios sejam capazes de hidrolisar angiotensina I e BK, o C-
terminal é mais efetivo na hidrólise desses peptídeos vasoativos. As evidências
experimentais sugerem que o N-terminal esteja mais envolvido com o
processamento de outros peptídeos bioativos (Coates, 2003), tais como o
hormônio-tetrapeptídeo (Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-OH) envolvido na regulação
negativa da hematopoiese (Rieger et. al., 1993; Rousseau et. al., 1994; Azizi et.
al., 1996) e a angiotensina(1-7), que inibe a hidrólise da angiotensina I feita pelo

domínio C-terminal (Deddish et. al., 1998). Dessa forma, a ECA é uma enzima de
fundamental importância na fisiologia cardiovascular, pois converte a angiotensina
I em angiotensina II (pontente vasoconstritor) e degrada a BK pela remoção do
dipeptídeo C-terminal (Turner e Hooper, 2002; Villard e Soubrier, 1996).
Os Bj-BPPs foram os primeiros inibidores naturais da ECA descritos, ou
seja, impedem tanto a degradação do peptídeo hipotensor, aumentando os seus
níveis no organismo (Stewart et. al., 1971), como a formação do peptídeo
vasoconstritor, o que ocasiona um forte efeito anti-hipertensivo.(Krieger et. al. ,
1971; Gavras et. al., 1974). Devido a ação inibitória dos Bj-BPPs sobre ECA, os
efeitos fisiológicos do RAS encontram-se diminuído, enquanto os efeitos do
sistema SCC estão potencializados (Figura 1).

Angiotensinogênio Cininogênio
Renina Calicreína
Angiotensina I Bradicinina
ECA
1 2
3
Angiotensina II
BPPs Metabólitos
Inativos
Metabólitos
Inativos
AT1
AT2 B2
Efeitos
Efeitos fisiológicos
fisiológicos
Figura 1 - Ação da ECA sobre os: sistema renina-angiotensina (SRA) e sistema calicreína-
cinina (SCC) e a interferência dos Bj-BPPs em ambos os sistemas. 1) Conversão da
angiotensina I em angiotensina II; 2) Degradação da BK; 3) Inibição da ECA pelos Bj-BPPs.
Efeitos fisiológicos no SRA mediados pelos receptores AT 1 incluem vasoconstrição, retenção de
água e sódio, liberação de aldosterona, aumento da atividade nervosa simpática entre outros;
mediados pelos receptores AT 2 incluem diferenciação celular, vasodilatação entre outros. Os
efeitos no SCC mediados pelos receptores B2 incluem vasodilatação e hipotensão através da
liberação de NO, prostaciclinas e do EDHF. Devido a inibição da ECA pelos Bj-BPPs, os efeitos
fisiológicos do SRA estão diminuídos (não há formação de angiotensina II) e os efeitos fisiológicos
do sistema SCC estão potencializados (inibição da degradação de BK).
(Adaptado de Burnett, 1999; Couture e Girolami, 2004; Santos et. al., 2005).
1.3 Bj-BPPs como modelo estrutural para o desenvolvimento do Captopril.
Após a descoberta da ação inibitória dos Bj-BPPs sobre ECA, houve
grande interesse nesses peptídeos, devido à importância da ECA no controle da
pressão arterial e a necessidade de desenvolvimento de uma terapia para
doenças cardiovasculares, assim como a hipertensão. Na época, dentre os
peptídeos identificados estavam o Bj-BPP-9a, sob o nome genérico de teprotide,
devido aos quatro resíduos de prolinas na sua estrutura, que apresentava potente
inibição da ECA e potenciação de BK in vitro (Ferreira et. al., 1970) e o Bj-BPP-5a
que também foi um dos primeiros Bj-BPPs a ter estrutura determinada e que foi
sintetizado e utilizado em ensaios que demonstravam a habilidade dessa
molécula em inibir a conversão de angiotensina I e a inativação de BK em pulmão
de rato (Stewart et. al., 1971).
Entretanto, ensaios utilizando esses dois peptídeos revelaram que o Bj-
BPP-9a era mais efetivo e tinha efeito mais duradouro que o do Bj-BPP-5a na
pressão arterial, tanto para a potenciação da BK como para a inibição da
conversão da angiotensina I (Greene et. al., 1972). Desse modo, O Bj-BPP-9a foi
utilizado na primeira demonstração clínica da utilidade dos Bj-BPPs no controle da
hipertensão, demonstrando um efeito anti-hipertensivo em humanos (Gavras et.
al., 1974; Gavras et. al., 1978).
No entanto, foi constado que a utilidade terapêutica do Bj-BPP-9a era
limitada pela ausência de atividade por administração oral, tanto em modelos
animais como em humanos e pelo alto custo de sua síntese (Krieger et. al., 1971;
Gavras et. al., 1974; Gavras et. al., 1975). Assim, tornou-se essencial para
aplicação farmacêutica o desenvolvimento de um inibidor não peptídico da ECA
efetivo por via oral.
Sendo assim, as estruturas dos peptídeos Bj-BPP-9a e Bj-BPP-5a,
(Ferreira et. al. 1970; Stewart et. al., 1971) foram estudadas por Cushman e
Ondetti que sugeriram que a prolina C-terminal dessas moléculas interagia
especificamente com sítio ativo da ECA (Cushman et. al., 1977). Assim, o Bj-BPP-
5a e Bj-BPP-9a serviram como base para o desenvolvimento do primeiro inibidor
sítio dirigida da ECA, o Captopril que foi sintetizado pela adição de um radical
quelador de metais a uma prolina (aminoácido carboxiterminal dos Bj-BPPs)
(Cushman et. al., 1977), e tem sido utilizado por via oral para o tratamento da
hipertensão arterial sistêmica humana desde os anos 80 (Ondetti e Cushman,
1981).
1.4 Evidências de diferenças funcionais e de mecanismo de ação entre os
BPPs
Apesar 1) da inibição da ECA ser um mecanismo relevante para explicar a
atividade dos BPPs e 2) da alta similaridade de seqüência de aminoácidos entre
moléculas peptídicas, tem sido sugerido que os diferentes Bj-BPPs apresentam
diferenças funcionais e de mecanismo de ação, tanto para explicar a atividade
potenciadora de BK como a atividade anti-hipertensiva (Cotton et. al., 2002;
Hayashi e Camargo, 2005; Guerreiro et. al., 2009; Lameu et al., 2010a; Mueller et.
al., 2005; Gomes et. al., 2007; Hayashi et. al., 2003).
Essas diferenças foram primeiramente observadas ao comparar a
seletividade dos Bj-BPPs codificados pelo precursor neuronal, Bj-BPP-5a, Bj-
BPP-10c, Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a (Hayashi et. al., 2003) pelos
sítios ativos da ECA e a atividade dos peptídeos de potenciar o efeito contrátil da
BK em íleo isolado de cobaia. Por exemplo, o BPP-5a é muito menos eficaz em
inibir a ECA que o Bj-BPP-13a, no entanto é muito mais potente para potenciar a
BK. Em contrapartida, o Bj-BPP-10c é um excelente inibidor do sítio C-terminal da
ECA e tem efeito de potenciação de BK similar ao Bj-BPP-5a e ao Bj-BPP-12b
que tem seletividade pelo sítio N-terminal. O Bj-BPP-11e além de ser um fraco
potenciador da BK, também não está entre os melhores inibidores dessa enzima
e não apresenta preferência por nenhum dos sítios ativos da ECA (Tabela 2).
Tabela 2 - Atividade biológica dos Bj-BPPs I. Efeito dos Bj-BPP-5a, Bj-BPP-9a, Bj-BPP-10c, Bj-
BPP-11e, Bj-BPP-12b, Bj-BPP-13a na potenciação de BK em íleo de cobaia (ex vivo) e na inibição
dos sítios N e C da ECA (in vitro). Os dados são expressos pela média ± erro padrão (Adaptado
de Hayashi e Camargo, 2005; Cotton et. al., 2002).
BPPs Sequência de Potenciação ECA Ki (nM)

aminoácidos de BK Sítio-N Sítio-C
(nmol)
BPP-5a <EKWAP 0,36±0,03 400 1280
BPP-10c <ENWPHPQIPP 0,48±0,02 200 0,5
BPP-11e <EARPPHPPIPP 2,68±0,20 100 300
BPP-12b <EWGRPPGPPIPP 0,83±0,30 5 150
BPP-13a <EGGWPRPGPEIPP 1,50±0,20 50 50
Posteriormente, em 2007, estudos da atividade anti-hipertensiva do Bj-
BPP-7a e do Bj-BPP-10c trouxeram informações sobre o mecanismo de ação
desses peptídeos, já que ambos apresentam uma potente e sustentada atividade
anti-hipertensiva em ratos espontaneamente hipertensos (SHRs) acordados, mas
não impedem a formação de angiotensina II a partir da angiotensina I, ou seja,
não afetam a função fisiológica da ECA. Além disso, no caso do Bj-BPP-10c, a
dose que produz o efeito anti-hipertensivo é menor que a dose requerida para
inibir a ECA in vivo (Ianzer et. al., 2007), sugerindo a participação de outros alvos
para gerar esses efeitos farmacológicos.
Isso pode ser reforçado através do estudo de distribuição biológica do Bj-
BPP-10c marcado com I125 que demonstraram que esse peptídeo se acumulava
em vários órgãos como: cérebro, fígado, testículos e principalmente nos rins,
mesmo após a saturação dos sítios ativos da ECA com um inibidor específico
dessa enzima, o Captopril (Silva et. al., 2008).

Dessa forma, foram realizados estudos visando identificar novos alvos para
o Bj-BPP-10c. Então, nosso grupo demonstrou que o Bj-BPP-10c tanto in vitro
como in vivo se liga a enzima argininosuccinato sintase (ASS) e aumenta sua
atividade (Guerreiro et al., 2009). A ASS é a enzima passo limitante no
fornecimento de substrato para óxido nítrico sintase (NOS) produzir NO (Shen et.
al., 2005; Flam et. al., 2007). Guerreiro e colaboradores demonstraram que a
vasodilatação promovida pelo BPP-10c em SHRs não resulta somente da
diminuição da concentração de angiotensina II e/ou aumento da BK, mas também
do aumento da biodisponibilidade de L-arginina para produção de NO (Guerreiro
et. al., 2009).
Outra evidência importante sobre o mecanismo de ação do BPP-10c surgiu
recentemente, quando foi demonstrado que o Bj-BPP-10c mobiliza [Ca2+]i em
células neuronais. Esses resultados contribuíram para entender o mecanismo de
ação do BPP-10c no sistema nervoso central, onde o peptídeo induz a liberação
dos neurotransmissores, GABA e glutamato, envolvidos no controle da pressão
arterial e diminui a sensibilidade do barorreflexo que está aumentada na
hipertensão (Lameu et. al., 2010a, Lameu et. al., 2010b).
1.5 Participação da ASS em processos bioquímicos e seus impactos
fisiológicos.
Há cerca de 60 anos, a ASS foi identificada (Ratner e Petrack, 1951), e
recentemente foi reconhecida como uma enzima presente em todos os
mamíferos. A ASS humana é um homotetrâmero, cada subunidade é composta
por 412 resíduos de aminoácidos e apresenta alta similaridade com as de outros
mamíferos, sua localização e distribuição celular estão relacionadas com a função

fisiológica desempenhada e pode ser encontrada no citoplasma, na mitocôndria e
na membrana plasmática (Husson et. al., 2003).
A ASS catalisa a reação de conjugação da citrulina com aspartato gerando
argininosuccinato com consumo de ATP. O argininosuccinato é substrato da
argininosuccinato liase (ASL) que o converte em arginina e fumarato. Ambas
enzimas agem de forma acoplada e fazem parte de vias metabólicas importantes
envolvendo a biodisponibilidade de L-arginina (Husson et. al., 2003; Flam et. al.,
2007).
A L-arginina é classificada como um aminoácido condicionalmente
essencial devido à habilidade do corpo de sintetizá-la em quantidades suficientes,
mesmo quando é extraída da dieta ou durante doenças ou traumas (Morris,
2004). O maior local de síntese de L-arginina em animais que possuem o ciclo da
uréia é o fígado, contudo, essa arginina não é secretada, pois é rapidamente
convertida a uréia e a ornitina pela arginase (ciclo da uréia) (Nussler et. al., 1994;
Shuttleworth et. al., 1995; Husson et. al., 2003). Nos rins, onde é sintetizada a
partir da citrulina, é liberada para circulação sanguínea, uma vez que esse órgão
não possui enzimas capazes de utilizá-la como substrato (Nagasaki et. al., 1996;
Gouta et. al.,1999).
No endotélio vascular a disponibilidade de L-arginina ocorre pela ação
conjunta da ASS e da enzima ASL, esta via é conhecida como ciclo da citrulina-
NO ou ciclo arginina-citrulina, onde a L-arginina é reciclada a partir da L-citrulina,
sendo disponibilizada como substrato da enzima NOS endotelial (eNOS) para
produção de NO (Nagasaki et. al., 1996; Hecker et. al., 1990).

Dessa forma, a ação da ASS sobre o metabolismo da L-arginina contribui
para três grandes funções diferentes no organismo dependendo da célula ou
tecido, desintoxicação de amônia no fígado, produção de L-arginina no rim para
todo organismo e síntese de L-arginina para produção de NO em várias outras
células (Figura 2). Além dessas três grandes funções também foi sugerido que a
ASS desempenha um papel importante na neuromodulação através da produção
de argininosuccinato (Nakamura et. al., 1991).
Figura 2 – Representação esquemática das funções da ASS em mamíferos. As enzimas

indicadas são: CPS-I, carbamil fosfato sintase; OTC, Ornitina transcarbamoilase (EC 2.1.3.3);
ASS, argininosuccinato sintase (EC 6.3.4.5); ASL, argininosuccinato liase (EC 4.3.2.1); NOS, oxido
nítrico sintase (EC 1.14.13.39) (Figura de Husson et. al, 2003)
Devido a sua participação em processos bioquímicos que geram impactos
fisiológicos no organismo, a ASS apresenta grande valor clínico, pois algumas
patologias podem ser associadas a sua deficiência ou excesso, tais como
citrulinemia (Curis et. al., 2005; Haberle et. al., 2002), hipertensão arterial
sistêmica e possivelmente, a pré-eclâmpsia (Panza, 1997; Williams et. al., 1997;
Haller, 1997; Dusse et. al., 2007, Garg e Hassid, 1989) e doença de Alzheimer
(Haas et. al., 2002; Wiesinger, 2001).
A citrulinemia é uma doença hereditária rara do metabolismo, com
transmissão autossômica recesssiva, e que se deve a deficiência da ASS no ciclo
da uréia, resultando no aumento da concentração plasmática da citrulina e da
amônia, o que é tóxico para o organismo (Curis et. al., 2005). Essa disfunção
pode levar danos cerebrais com deficiência mental, geralmente levando à coma e
à morte.
Há também sugestão da ASS como alvo terapêutico para o tratamento da
pré-eclâmpsia e a hipertensão essencial humana. Em condições fisiológicas
ideais existe um equilíbrio entre a liberação de fatores relaxantes e fatores
contráteis pelo endotélio. Sabe-se que em condições patológicas, como a
hipertensão essencial humana, esse equilíbrio é alterado. Entre esses fatores o
NO desempenha um papel fundamental na regulação do tônus vascular e da
homeostasia (Harrison, 1996), entre outras condições, a diminuição na
disponibilidade ou a deficiência de L-arginina compromete a secreção de NO
(Higashi e Chayama, 2002). Uma vez que, a ASS participa da via de reciclagem
da L-arginina, o que contribui para a manutenção de substrato para eNOS, sendo
que a sua atividade catalítica é considerada o passo limitante para produção de
NO (Solomonson et al., 2003 e Goodwin et. al., 2007), a modulação positiva
dessa enzima poderia restabelecer o equilíbrio desse sistema, com conseqüente,
diminuição da pressão arterial.

A doença de Alzheimer é caracterizada neuropatologicamente por
emaranhados neurofibrilares, por placas compostas de agregados de -amilóide e
degeneração neuronal (Haas et. al., 2002). O NO é um importante mediador da
degeneração neuronal e pode ser altamente neurotóxico quando gerado em
excesso em resposta a citocina. Observações recentes sugerem que essa
neurotoxicidade produzida pelo NO são induzidas na região das placas
características da doença de Alzheimer (Haas et. al., 2002). Dessa maneira,
considerando o ciclo citrulina-NO, a ASS funcionaria como marcador indireto, pois
indica contínua reposição de L-arginina e, assim, promoveria sustentação e
potencialização neurotóxica pela liberação de NO.
Sabendo que os Bj-BPPs são estruturalmente análogos, hipotetizamos que
outros peptídeos, além do Bj-BPP-10c, atuam sobre a ASS para ativá-la ou inibi-
lá. Dessa forma, esses peptídeos poderiam se tornar moléculas potenciais para
aplicações em outros casos clínicos, além da hipertensão. Por exemplo,
peptídeos que inibem a ASS podem ser testados em modelos experimentais de
Alzheimer, ou ainda, peptídeos que apenas se liguem a enzima podem ser
usados como biomarcadores de doenças associadas com ASS.
1.6 Produção de NO e sua participação na regulação da pressão arterial.
A biossíntese do NO é feita a partir da oxidação de L-arginina pela NOS,
que é uma enzima dimérica que contém um grupamento heme. Além do substrato
L-arginina, a reação catalisada pela NOS requer oxigênio molecular, NADPH, e
co-fatores, tais como tetrahidro-L-biopterina (H4biopterina), FMN, FAD, heme e
aumento da concentração de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) (Marletta, 1994).

Há três isoformas de NOS que são codificadas por genes distintos: a NOS
neuronal (nNOS), encontrada em concentrações elevadas em tecidos neuronais e
alguns não neuronais (Davis et. al. 2001, Marleta, 1994, Murad, 1996); a NOS
induzível (iNOS) que apesar de originalmente ter sido encontrada em macrófagos,
existe em uma variedade de tipos celulares, incluindo hepatócitos, células
musculares lisas vasculares, fibroblastos e células epiteliais (Davis et. al. 2001,
Marleta, 1994, Murad, 1996) e a eNOS, foi identificada como a enzima que produz
fatores relaxantes derivados do endotélio (Davis et. al. 2001, Marleta, 1994,
Murad, 1996). Tanto a nNOS como a eNOS, são agrupadas como NOS
constitutivas, por serem geralmente expressas constitutivamente, e tem suas
atividades reguladas pela [Ca2+]i via calmodulina. Por outro lado, a expressão da
iNOS é induzida por compostos, como endotoxina ou citocinas pró-inflamatórias
(incluindo a interleucina-1, IFN , e fator de necrose tumoral alfa) (Marleta, 1994,
Murad, 1996). A iNOS está ligada a calmodulina, mesmo em níveis basais de
Ca2+, assim, a sua função não é afetada pela concentração de desse íon. Além
disso, a iNOS pode produzir níveis muito mais elevados de NO e portanto tóxico
em comparação com as outras isoformas.
O NO produzido no endotélio possui ação vasodilatora por ação na
musculatura lisa dos vasos. Além disso, essa molécula atua em diversos tipos
celulares, tais como, células neurais, cardíacas, sanguíneas (plaquetas),
macrófagos e está implicado em um conjunto diversificado de funções fisiológicas
como inibição da ativação plaquetária (Albrecht et. al., 2003, Kubes et. al., 1991),
neurotransmissão, (Garthwaite e Boulton, 1995), além de estar associado com a
função cognitiva, com a manutenção da plasticidade simpática e com resposta
imune (Kelly e Gold, 1999; Davis et. al., 2001; Marleta, 1994; Murad, 1996).
O NO produzido pelo endotélio vascular desempenha um papel
fundamental na regulação do tônus vascular promovendo vasodilatação. Efetores
circulantes, como a BK, ligam-se a receptores específicos na membrana das
células endoteliais, sinalizando uma liberação transiente de cálcio intracelular, o
qual se liga à calmodulina formando o complexo cálcio-calmodulina (Ca2+/CaM)
responsável pela ativação da eNOS. A ligação do Ca2+/CaM a NOS estimula a
transferência seqüencial de elétrons. Primeiramente ocorre a transferência de
elétrons do NADPH para as flavinas do domínio redutase, e então os elétrons das
flavinas são transferidos para o domínio oxigenase. Desse modo, a eNOS torna-
se ativada para produzir NO na presença adequada de L-arginina (Busse e
Fleming, 1995), o que possibilita que essa enzima catalise duas reações
seqüenciais de oxidação da L-arginina em citrulina liberando o NO (Tarpey e
Fridovich, 2001).
O NO formado no endotélio difundi-se para a musculatura lisa do vaso
promovendo a ativação da guanilato ciclase e conseqüente produção de GMP
cíclico (cGMP). O cGMP atua sobre canais de K+ dependentes de voltagem
dificultando a despolarização destas células, além de promover diretamente a
diminuição da [Ca2+]i, promovendo relaxamento muscular (Cawley et. al., 2007)
(Figura 3). Além disso, é sugerido também que o NO, no cérebro, está envolvido
na regulação cardiovascular central, através da redução da atividade simpática do
SNC (Lin et. al., 1999).
Um dos fatores limitante para a produção de NO é a viabilidade do
substrato para a NOS, a L-arginina. A NOS está localizada intracelularmente na
cavéola, o que permite uma estreita proximidade com o seu substrato, L-arginina
e seus cofatores (Liu et. al., 1996). Os níveis intracelulares de L-arginina são
muito superiores ao valor de Km para NOS (Harrison, 1997), contudo a produção
de NO pode ser estimulada por uma fonte de L-arginina exógena (Vallance e
Chan, 2001). Este fenômeno conhecido como paradoxo da L-arginina sugere a
existência de um “pool” separado e exclusivo de L-arginina para a produção de
NO na célula (Solomonson et. al., 2003).
O transporte de L-arginina através da membrana das células é um possível
mecanismo de controle dos níveis de L-arginina intracelular. McDonald et. al.
(1997) mostraram que o transportador de aminoácidos catiônico 1 (CAT1) é
responsável por 60-80% do total de L-arginina transportada para o ambiente
intracelular, além de se co-localizar com a NOS na cavéola. Assim, a fonte de L-
arginina consumida pela NOS é mantida pelo CAT1 ou pela regeneração da L-
arginina através do ciclo citrulina-NO, sendo que a enzima passo limitante das
reações acopladas é a ASS (Hecker et. al.,1990, Xie et. al., 2000, Flam et. al.,
2001). Evidências clínicas sugerem que assim como a ativação da NOS pela
mobilização de Ca2+, a reciclagem de seu substrato são importantes para
produção de NO (Fakler, 1995; Scaglia et. al., 2004).
1.7 Sinalização por cálcio

2+ 2+
A concentração extracelular de Ca está na faixa de milimolar; já a [Ca ]i
oscila entre 0,1 e 10μM. Apesar deste gradiente eletroquímico transmembranar

2+
favorável, o Ca tem a sua entrada na célula restringida, pois é mediada por
canais e transportadores específicos existentes na membrana plasmática. As

2+
oscilações na [Ca ]i devem-se não só à sua entrada ou saída da célula através
da membrana celular envolvendo canais de Ca2+, mas também à sua mobilização

das reservas intracelulares pela ativação de receptores acoplados a proteína G
(Brown, 1999; Putney, 1999; Tran et. al., 2000; Putney et. al., 2001).
Os canais envolvidos na regulação do fluxo de cálcio podem ser abertos
por transmissores (agonistas), pela diferença de potencial da membrana celular
(canais dependente de voltagem), por estímulos mecânicos (canais
mecanosensíveis) ou térmicos (canais TRP) (Busse e Fleming, 1995; Putney,
1999; Putney et. al., 2001; Parekh e Putney, 2005; Vetter e Lewis; 2010).
Os receptores acoplados a proteína G que também estão envolvidos na
sinalização de cálcio são caracterizados por uma única proteína que transpassa a
membrana plasmática sete vezes, resultando em sete domínios hidrofóbicos
transmembrana conectados por três “loops” hidrofílicos extracelulares e três
intracelulares. A porção N-terminal reside no meio extracelular e a porção C-
terminal no citoplasma (Mahaut-Smith et. al., 2008; Hanson e Stevens, 2009).
As proteínas G podem ser dividas em Gs, Gi/0, Gq e G12 baseado nas
semelhanças na seqüência, seletividade de efetores e sensibilidade de inibidores.
As proteínas G existem como um heterotrímero contendo três subunidades: α, β e
γ. Na sua forma inativa, a protéina G está complexada em α, β e γ, com GDP
fixado à subunidade α. Uma vez estimulada por um receptor ativado por seu
ligante, a subunidade α troca seu GDP por GTP. Isso causa a dissociação de α
que se separadas subunidades β e γ, interagindo com uma proteína efetora ou
canal iônico a fim de estimular ou inibir mensageiros intracelulares secundários.
(Felder, 1995).
2+
As vias de mobilização de [Ca ]i desencadeadas por receptores
associadas à proteína G, podem envolver a ativação da fosfolipase C (PLC),
causando a hidrólise do fosfolipídeo de membrana fosfatidilinosito 4,5-bifosfato

(PIP2) em inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) e 1,2-diacilglicerol (DAG). O IP3 pode se
ligar a canais do retículo endoplasmático, gerando um aumento rápido e

2+
transiente da [Ca ]i. Esse tipo de sinalização pode ser ativada, por exemplo, pela
ligação de BK ao receptor B2 de cininas acoplado a proteína Gq que está
envolvido na estimulação da NOS e produção de NO, sendo um importante
mediador da atividade hipotensiva da BK (Busse e Fleming, 1995; Noda et. al.;
2004).
2+ 2+
Outro mecanismo é o Ca citoplasmático ativando a liberação de Ca dos
estoques intracelulares através de receptores de IP3 e rianodina, conhecido como

2+ 2+
liberação de Ca induzida por Ca (CICR - calcium-induced calcium release).
Essa via de mobilização de [Ca2+]i foi observada em estudos realizados com o Bj-
BPP-10c, que em células do sistema nervoso central mediava seus efeitos por um
receptor acoplado a proteína Gi/0, seguido de um mecanismo CICR. Uma vez
ativada, a proteína G ativaria canais de cálcio da membrana e permitiria a entrada
de Ca2+ na célula, ativando receptores rianodina, liberando mais Ca 2+ dos
estoques intracelulares (Lameu et. al., 2010a) (Figura 4).
O Ca2+ é um importante segundo mensageiro que possui inúmeros efetores
intracelulares para funções específicas em diversos processos fisiológicos, assim
como, atividade cardíaca, coagulação do sangue, manutenção das membranas
celulares, adesão celular, transmissão de sinais às células nervosas, contração
muscular, ativação de enzimas, controle da expressão gênica, morte celular e a
regulação de funções musculares e nervosas (Berridge et. al., 2000; Garcia et. al.,
2006).
Dentro do contexto de controle da pressão arterial, o aumento da [Ca2+]i
ativa a NOS no endotélio e em células nervosas para a produção de NO e
provoca relaxamento dos vasos. Na musculatura lisa e esquelética o aumento da
[Ca2+]i tem efeito inverso. A contração muscular acontece quando há uma
interação das proteínas contráteis de actina e miosina, que ocorre na presença
Ca2+ intracelular e ATP. O Ca2+ é liberado pelo retículo sarcoplasmático quando
estimulado pela despolarização. A função do Ca2+ no músculo é expor um sítio de
ligação da miosina na proteína actina (Volpe et. al., 1986).
Em contrapartida, respostas celulares que diminuem a [Ca2+]i, no músculo
promovem vasodilatação, por exemplo, o NO difunde-se do endotélio vascular
para a musculatura lisa do vaso ativando a guanilato ciclase e conseqüente
produção de cGMP. O cGMP atua sobre canais de K+ dependentes de voltagem
dificultando a despolarização destas células, além de promover diretamente a
diminuição da [Ca2+]i, provocando relaxamento muscular. (Figura 3) (Solomonson
et. al., 2003; Wray e Burdyga, 2010).
No músculo cardíaco esse o íon é necessário para a geração da atividade
elétrica e do disparo e manutenção da atividade contrátil. Além disso, diversos
transportadores de Ca2+ existentes na célula cardíaca regulam as variações da
[Ca2+]i para a execução das diversas funções do coração. Embora as contrações
do músculo cardíaco sejam controladas pelo sistema nervoso autônomo, a
deficiência de Ca2+ pode ocasionar disfunções contráteis nas células cardíacas
levando a arritmia e insuficiência cardíaca (Ai et. al., 2005; Bassani e Bassani,
2007).
Além disso, o Ca2+ atua na liberação de neurotransmissores, na região
adjacente a fenda sináptica. Existem muitos canais de cálcio que através da

despolarização da membrana se abrem liberando Ca2+ para dentro da célula. Este
influxo de Ca2+ nas imediações da membrana pré-sináptica, causa por atração
iônica o movimento das vesículas com neurotransmissores na direção da
membrana pré-sináptica, onde os neurotransmissores são liberados na fenda
sináptica por exocitose. Esse mecanismo é importante para as funções do
sistema nervoso, entre as quais a manutenção da pressão arterial exercida pelo
sistema simpático e parassimpático (Burnashev, 1998; Putney, 1999; Michelini;
1999).
Há também evidências que o Ca2+ possa ter um efeito hipotensor
relacionado ao fato desse íon estar associado a excreção de sódio, tanto que
medicamentos diuréticos são utilizados na tratamento de hipertensão,
aumentando a diurese e natriurese (Frohlich et. al., 1995; McCarron, 1995).
Outra relação importante entre o Ca2+ e doenças cardiovasculares está
associada a sua participação no metabolismo de carboidratos, onde o influxo de
Ca2+ ativa a secreção de insulina. Entretanto, quando há o aumento excessivo
desse íon, pode ser citotóxico e promover uma disfunção ou destruição das
células β, contribuindo para o desenvolvimento de diabetes (Nakata et. al., 1997).
Além disso, o Ca2+ estimula a exocitose de transportadores de glicose no músculo
esquelético, o que pode ser intepretado como efeito protetor contra a diabetes,
que é uma doença também relacionada com disfunções cardiovasculares (Nakata
et. al., 1997; Youn et. al., 1991).
1.8 Possíveis alvos e mecanismos de ação dos Bj-BPPs
Apesar do estudo da inibição ECA pelos Bj-BPPs ter sido muito importante
para a ciência e para saúde pública com o desenvolvimento do captopril, já tinha
sido sugerido desde longa data que a atividade de potenciação da BK e, portanto,

o efeito sobre a pressão arterial não poderia ser inteiramente explicado pela
inibição de enzimas que degradam a BK (Camargo e Ferreira, 1971; Greene et.
al., 1972). Além disso, questionamentos sobre o mecanismo de ação dos Bj-BPPs
surgiram, principalmente quando confrontadas as informações sobre a atividade
biológica desses peptídeos (Tabela 2) sugerindo interações com outros alvos e
mecanismos de ação distintos para cada peptídeo.
O Bj-BPP-10c confirmou todas as hipóteses até então sugeridas. Esse
peptídeo apresenta um novo e importante alvo, a ASS (Guerreiro et. al., 2009)
com grande potencial de se tornar alvo terapêutico assim como aconteceu com a
ECA (Ondetti et. al., 1977; Cushman et. al., 1977; Ondetti e Cushman, 1981). O
Bj-BPP-10c além de possuir um efeito periférico controlando diretamente a
vasodilatação possui um efeito central regulando o sistema nervoso autônomo
(Lameu et. al., 2010b).
Desse modo, o fato do Bj-BPP-10c possuir outro alvo além da ECA e um
novo mecanismo de ação, surgiu a necessidade e a curiosidade de estudar a
atividade de outros Bj-BPPs. Portanto, esse trabalho teve como objetivo verificar
se a potenciação de BK, a ativação da ASS, indução da produção de NO e
mobilização [Ca2+]i estão também envolvidos no mecanismo de ação do Bj-BPP-
5a, Bj-BPP-9a, Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a. Além de verificar se esses
peptídeos, assim como o Bj-BPP-10c, possuíam atividade anti-hipertensiva em
ratos espontaneamente hipertensos.
O critério utilizado para a escolha dos peptídeos foi que o Bj-BPP-5a, Bj-
BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a são peptídeos codificados pelo precursor dos
Bj-BPPs e Bj-CNP expresso no cérebro da serpente, e, portanto tem grande
possibilidade de existir um correlato endógeno em mamíferos assim como é o

caso do CNP e de outras enzimas encontradas no veneno e outros tecidos da
serpente (Cho et. al., 1999; Hayashi et. al., 2003; Hayashi e Camargo; 2005;
Woodard e Rosado, 2007; Rubattu et. al., 2008). Estudamos também os
potenciais alvos de ação do Bj-BPP-9a, pois foi o único testado em humanos e
possui eficácia comprovada no controle da pressão arterial (Gavras et. al., 1974).
Dessa maneira, com esse trabalho esperamos contribuir na literatura com novas
informações a respeito do mecanismo de ação dos Bj-BPPs.

BP
P-
10
c
Figura 3 – Vasodilatação promovida pelo NO devido ao relaxamento da musculatura lisa do

vaso. Os agentes vasodilatores atuam em receptores localizados na membrana do endotélio
2+
vascular e desencadeiam respostas intracelulares gerando a entrada de Ca pelos retículos
2+ 2+
sarcoplasmáticos. O Ca liga-se à calmodulina formando o complexo Ca /calmodulina. Este
complexo atua sobre a eNOS promovendo sua ativação e conseqüente formação de NO. O NO
difunde-se do endotélio vascular para a musculatura lisa do vaso promovendo, nessas células, a
+
ativação da guanilato ciclase e conseqüente produção de cGMP. O cGMP atua sobre canais de K
dependentes de voltagem dificultando a despolarização destas células, além de promover
2+
diretamente a diminuição da concentração de Ca intracelular provocando relaxamento muscular.
A fonte de L-arginina utilizada pela eNOS pode ser oriunda do transporte direto através do CAT1
ou através do sistema de reciclagem da L-arginina. O Bj-BPP-10c atua modulando positivamente a
atividade catalítica da ASS, aumentando a sua afinidade por um de seus substratos, o ATP, com
conseqüente aumento de disponibilidade de L-arginina, que é substrato da eNOS, estimulando a
produção sustentada de NO, contribuindo para o relaxamento muscular.
(Adaptado de Solomonson et. al., 2003; Flam et. al, 2007;
http://www.mona.uwi.edu/fpas/courses/physiology/muscles/Endothelia_and_Smooth_Muscles.htm)
Figura 4 – Representação esquemática da transdução de sinal induzida pelo Bj-BPP-10c. O

BPP-10c ativa um receptor metabotrópicos Gi/o com 7 porções transmembrana resultando na
inibição da adenilato ciclase e ativação de um dos canais de cálcio na membrana celular. O influxo
de cálcio promove CICR estimulada pela ativação de receptores intracelulares de rianodina (RyR)
2+
ou de IP3. As elevações de [Ca ]i induzida pelo Bj-BPP-10c podem participar no mecanismo de
liberação de GABA e glutamato, que exercem funções essenciais no controle da função
cardiovascular no sistema nervoso central (Figura de Lameu et. al., 2010a).
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais:
Avaliar os potenciais alvos dos Bj-BPPs (Bj-BPP-5a, Bj-BPP-9a, Bj-BPP-11e,
Bj-BPP-12b, Bj-BPP-13a) envolvidos no mecanismo de ação anti-hipertensiva.
2.2 Objetivos Específicos:
a) determinar o efeito potenciador dos Bj-BPPs 9a, Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b, Bj-
BPP-13a sobre BK na pressão arterial de ratos normotensos anestesiados;
b) determinar os parâmentros cardiovasculares (pressão arterial média e
freqüência cardíaca) de SHRs tratados com o Bj-BPP-9a, Bj-BPP-11e, Bj-
BPP-12b e Bj-BPP-13a;
c) obter a enzima ASS humana recombinante em sistema procarioto;
d) determinar o efeito dos Bj-BPPs, sobre a atividade enzimática da ASS,
analisando sua interferência na atividade catalítica dessa enzima in vitro;
e) determinar/quantificar a produção de NO de células HEK293 tratadas com os
Bj-BPPs na ausência e/ou presença de antagonistas de receptores envolvidos
no controle da pressão arterial;
f) determinar a mobilização de [Ca2+]i induzida pelos Bj-BPPs em células
HEK293.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Síntese e purificação dos peptídeos (Bj-BPPs)
Os peptídeos foram sintetizados no Laboratório de Pré-Formulação do
CAT-CEPID, segundo o método de síntese de fase-sólida pela estratégia Fmoc,
conforme descrito em Lameu et. al., 2010a. Os peptídeos foram purificados por
cromatografia de fase-reversa em sistema HPLC semipreparativo (Shimadzu)
com sistema binário de bombas LC-6AD e detector SPD-10AV UV-Vis, usando
uma coluna de fase-reversa (ODS-C18, Shimadzu, 20x250). A eluição foi feita
utilizando dois solventes: (A) ácido trifluoracético (TFA)/H2O (1:1000) e (B)
TFA/acetonitrila (ACN)/ H2O (1:900:100), sob fluxo de 5ml/min com gradiente de
10% para 60% do solvente B por 45min. Para as cromatografias de fase-reversa
em escala analítica foi utilizado um sistema de HPLC da Shimadzu com um
detector SPD-10AV UV-Vis e um detector de fluorescência RF-535, acoplado a
uma coluna Merck C18 (Merck KGaA, 4,6x30), previamente eluída com um
sistema de solvente A e B, sob fluxo de 1ml/min e um gradiente de 10%-80% de
solvente B por 20min. A eluição dos peptídeos foi monitorada por absorbância em
220nm. As amostras foram congeladas em nitrogênio liquido e liofilizadas
(Edwards Freeze Dryer Super Modulyo Pirani 1001, Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA) por 48h a -50ºC sob vácuo. A massa molecular e a pureza dos
peptídeos sintetizados foram confirmadas por espectrometria de massas MALDI-
TOF (Ettan MALDI-TOF, GE Healthcare) com a colaboração do Dr. Robson Mello
do Laboratório de Síntese de Peptídeos – LETA – CAT/CEPID – Instituto
Butantan.
3.2 Potenciação do efeito hipotensivo da bradicinina pelos Bj-BPPs em ratos
anestesiados
Para realização dos ensaios de potenciação da BK foram utilizados ratos
(Rattus norvegicus) machos adultos de peso corporal entre 250 a 350g da
linhagem Wistar. Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central do Instituto
Butantan, mantidos com acesso livre à alimentação e água e submetidos a um
ciclo luz-escuro (12h cada) no Biotério do Laboratório Especial de Toxinologia
Aplicada antes de serem utilizados para os experimentos. Procedimentos que
envolvem animais e seus cuidados foram conduzidos conforme Giles, 1987 e
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP (CEP 0934/09) e
520/08 do CEUAIB-Instituto Butantan. Para o registro dos parâmetros
cardiovasculares (pressão arterial média - PAM e freqüência cardíaca - FC), os
animais foram submetidos a procedimento cirúrgico para implantação das cânulas
arterial e venosa. Os ratos foram anestesiados com uretana 12% (1,0mL/100g de
peso corporal) por via intraperitoneal e colocados em decúbito dorsal em uma
prancha cirúrgica. Foi realizada uma pequena incisão na pele, separando a
musculatura para localização do feixe vásculo-nervoso femural. Na artéria femural
foi introduzida uma cânula para registro da pressão arterial. Na veia femural foi
introduzido uma cânula para as infusões das drogas. A cânula arterial foi
conectada ao transdutor e feito o registro dos parâmetros cardiovasculares.
Durante o procedimento experimental a temperatura do animal foi mantida em 36
- 37 C através de uma manta elétrica de aquecimento. O registro foi realizado
com a conexão da cânula arterial a um transdutor de pressão (strain-Gauge –DT-
XX Viggo-spectramed) e as oscilações de pressão captadas foram amplificadas e
convertidas em sinais digitais através do conversor analógico/digital (A/D) MP100

(BIOPAC systems, Inc.). O software utilizado foi AcqKowledge 5.0 (BIOPAC
Systems, Inc.). Após a prévia calibragem do equipamento, PAM e FC foram
monitoradas continuamente. Para padronização do efeito hipotensor causada pela
bradicinina foram realizadas injeções de doses padrão de BK de 0,5 g e 1 g.
Após a padronização, foi feita a injeção intravenosa (i.v.) in bolus dos Bj-BPPs na
dose de 60nmol num volume total de 150 L (solução de NaCl 0,9 %). Nos tempos
5, 10, 15, 20, 25 e 30min, após a injeção do peptídeo, foram reinjetadas doses
padrão de 0,5 g de BK para verificar a potenciação do seu efeito hipotensor. O
número de experimentos variou de 4 a 5 para cada peptídeo. Estes ensaios foram
realizados em colaboração com a Dra Daniele Ianzer e com o aluno de Mestrado
José Rodolfo Miranda, do Laboratório de Fisiologia Cardiovascular - LETA –
CAT/CEPID – Instituto Butantan.
3.3 Aquisição dos parâmetros cardiovasculares de ratos acordados tratados
com os Bj-BPPs.
Nesse experimento foram utilizados SHRs machos, adultos de peso
corporal entre 250 a 350g, fornecidos pelo Biotério Central do Instituto de
Ciências Biológicas - USP. Os animais foram manipulados de acordo com os
Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo colégio Brasileiro
(COBEA) e com aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP (CEP
0934/09) e 520/08 do CEUAIB-Instituto Butantan. No dia anterior a aquisição dos
parâmetros cardiovasculares, os ratos foram submetidos a procedimento cirúrgico
para implantação das cânulas arterial e venosa. Os animais foram anestesiados
com uretana 12% (1,0mL/100g de peso corporal) por via intraperitoneal e
colocados em decúbito dorsal em uma prancha cirúrgica. Foi realizada uma
pequena incisão na pele, separando a musculatura para localização do feixe

vásculo-nervoso femural. Na artéria foi introduzida uma cânula para registro da
pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) e na veia, uma cânula
para as infusões dos peptídeos (Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b ou Bj-BPP-13a). Após
18 - 20h do procedimento cirúrgico, com o animal acordado e com livre
movimentação, a cânula arterial foi conectada a um transdutor de pressão
acoplado ao sistema de aquisição de dados da BIOPAC Systems, Inc., para medir
a PAM e FC. Antes da administração de um dos Bj-BPPs (Bj-BPP-11e, Bj-BPP-
12b ou Bj-BPP-13a) foram monitorados os parâmetros cardiovasculares dos ratos
durante 60min, como controle basal. Após esse período, foi feita a injeção i.v. in
bolus do peptídeo (71nmol/Kg) e os parâmetros cardiovasculares foram
monitorados durante 6h. O número de experimentos para cada tratamento variou
de 4 a 5 animais. Estes ensaios foram realizados em colaboração com a Dra.
Daniele Ianzer e com o aluno de Mestrado José Rodolfo Miranda, do Laboratório
de Fisiologia Cardiovascular - LETA – CAT/CEPID – Instituto Butantan.
3.4 Obtenção da ASS humana recombinante
3.4.1. Subclonagem em vetor de expressão
O clone contendo o cDNA da ASS humana (pORF-ASS) foi adquirido
comercialmente da Invitrogen. Este clone é apropriado para clonagem utilizando o
sistema GATEWAY, que consiste em uma recombinação entre o clone pORF-
ASS e os vetores pDESTs. Os vetores pDESTs são um conjunto de vetores
apropriados para expressão de proteínas em sistemas procariotos, sendo que a
variação entre eles consiste apenas na proteína de fusão co-expressa com o
proteína desejada. Nesse projeto optou-se por utilizar o vetor pDEST 17, que
apresenta uma seqüência que codifica seis resíduos de histidina na região N-
terminal. Conforme recomendação do fabricante foi realizada uma reação de

recombinação que continha: pORF-ASS 150ng/μl, pDEST 17 150ng/μl, LR
clonase II 0,2U/μl em tampão Tris-EDTA (TE) pH 8,0. Em seguida, essa reação foi
incubada por 1h a temperatura ambiente e ao final foi adicionada 0,2U/μl de
proteinase K.
O DNA recombinante foi inserido em bactérias pelo método de choque
térmico, como descrito a seguir. Aproximadamente 25 a 50ng do produto da
reação descrita acima foram colocados em um tubo plástico de microcentrífuga já
contendo 105 células da bactéria Escherichia coli (E. coli) da linhagem DH5α.
Após incubação no gelo por 20min, as bactérias foram incubadas a 42ºC por 45s
e, em seguida, no gelo por 3min. Então, foram adicionados 0,95ml de meio de
cultura SOB (Super Optimal Broth, que é constituído por triptona 2%, extrato de
levedura 0,5%, NaCl 0,05%, KCl 2,5mM, MgCl2 10mM, MgSO4 10mM)
suplementado com 20mM de glicose. Em seguida, o tubo de centrífuga contendo
as bactérias foi incubado a 37ºC, por 1h, sob agitação. Só então as bactérias
transformadas foram semeadas em placas com meio LB sólido (extrato de
levedura 0,5%; triptona 1% e bacto-ágar 2%) contendo um antibiótico de seleção
(ampicilina 50μg/ml). Estas placas foram então incubadas em estufa a 37ºC entre
12 a 14h.
Os plasmídeos das colônias bacterianas foram extraídos utilizando o kit
Minipreps Wizard DNA Purification System (Promega) e os clones isolados
foram submetidos a seqüenciamento de nucleotídeos utilizando o ABI Prism Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (BigDye – Applied Biosystem)
em no seqüenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystem). Os insertos foram
seqüenciados usando oligonucleotídeos (senso 5’-ATGTCCAGCAAGGGCTC-3’)

e anti-senso 5’-TTTGGCAGTGACCTTGC-3’) correspondentes às regiões
flanqueadoras do sítio de clonagem do vetor pDEST 17.
3.4.2 Expressão e purificação da proteína ASS
Os clones positivos que continham o inserto da sequência de cDNA da
ASS humana foram isolados e inseridos em bactérias E. coli BL21 Origami
(DE3)pLysS por choque térmico. As bactérias contendo o vetor pDEST 17 com o
cDNA codificante para a ASS foram amplificadas em meio líquido contendo o
antibiótico de seleção (ampicilina 50μg/ml). Para tanto, um pré-inóculo foi
preparado retirando-se uma colônia isolada da placa e adicionando-a a 50ml de
meio de cultura LB (Luria Bertani). Após incubação entre 12 a 14h, a 37ºC, sob
agitação a 220rpm, este pré-inóculo foi transferido para um erlenmeyer contendo
500ml de LB líquido contendo ampicilina 100μg/ml, que foi incubado durante 4h a
37ºC, sob agitação a 220 rpm. A absorbância do meio de cultura com as bactérias
foi monitorada, até atingir a densidade ótica a 600nm em torno de 0,4 a 0,5. A
expressão da proteína recombinante foi induzida pela adição de L-arabinose 0,2%
(Invitrogen), seguido de incubação por aproximadamente 48h, a 18ºC, sob
agitação a 220rpm. Após a incubação, a cultura foi centrifugada a 200g, a 4ºC,
por 20min para recuperar as bactérias contendo a proteína recombinante em seu
citoplasma. Após descartar o meio de cultura, as bactérias foram lavadas com 10
a 20ml de solução salina, congeladas e estocadas a –20ºC até o seu uso.
As bactérias foram descongeladas e ressuspendidas em 10 ml de tampão
A, contendo Tris-HCl 20mM pH 7,5, KCl 100mM, imidazol 20mM, -
mercaptoetanol 10mM e glicerol 10%. Essas células foram lisadas por sonicação
no gelo e centrifugadas a 250g, a 4ºC, por 45min. Após a centrifugação, o

sobrenadante foi recolhido e a proteína recombinante foi purificada por
cromatografia de afinidade, utilizando uma resina de agarose Ni-NTA (níquel-
ácido nitriloacético, Qiagen), haja vista que a ASS recombinante foi gerada em
fusão com uma cauda de histidina, a qual apresenta afinidade pelo níquel.
A resina Ni-NTA foi inicialmente equilibrada com tampão B, contendo Tris-
HCl 20mM pH 7,5, KCl 100mM, imidazol 80mM, -mercaptoetanol 10mM e
glicerol 10% e, em seguida, foi incubada com sobrenadante obtido acima por 1h a
4ºC, sob agitação a 7rpm. A resina foi então lavada por 8 vezes com 10 volumes
de tampão A. Para eluição da proteína recombinante purificada, foram
adicionados a resina 2 volumes de tampão C [Tris-HCl 20mM pH 7,5, KCl 10mM,
imidazol 500mM, e glicerol 10% (v/v)], e então incubada por 30min a 4ºC, sob
agitação a 7rpm. Essa amostra (resina mais tampão de eluição) foi centrifugada a
200g, a 4ºC, por 5min, e o sobrenadante contendo a proteína recombinate foi
transferido para um novo tubo e estocados a 4ºC para posterior confirmação da
ASS por Western blot e espectrometria de massas (descritos nos itens 3.4.3 e
3.4.4 respectivamente) e determinação da atividade enzimática.
3.4.3 Eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e Western blot
A eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida foi realizada como descrito por
Laemmli (1970). O gel a 12,5% foi preparado em tampão Tris-HCl 380mM, pH 8,8
contendo SDS 0,1%, acrilamida 10%, TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilenediamina)
0,1% e persulfato de amônio 10%. As amostras aplicadas foram previamente
desnaturadas e reduzidas em tampão Tris-HCl 125mM, pH 6,8, contendo 2-
mercaptoetanol 2% e SDS 2% e foram aquecidas a 95 oC durante 5min. Usou-se
como tampão de corrida Tris-HCl 25mM, contendo glicina 180mM, pH 8,3 e SDS
1%. As corridas foram desenvolvidas a temperatura ambiente e a duração foi de
aproximadamente 2h, sob voltagem constante de 100V. Os padrões de massas
moleculares utilizados foram: soro albumina (68kDa), IgG (cadeia pesada 50kDa
e cadeia leve 23,5kDa), ovo albumina (43kDa) e ribonuclease (13,7kDa). Após as
corridas, os géis foram retirados da placa e submetidos à coloração com uma
solução de Coomassie blue (Coomassie blue R 250 0,1%, metanol 50%, ácido
acético 7%) durante 12h a temperatura ambiente. Transcorrido o tempo de
coloração, o gel foi colocado em solução descorante [etanol, ácido acético e água
4:1:5 (v/v)] até a completa visualização das bandas.
Para o Western blot, após a eletroforese, as amostras foram eletro-
transferidas para uma membrana de nitrocelulose, utilizando tampão de
transferência (Tris-HCl 380mM, glicina 180mM em metanol 20%), sob voltagem
constante de aproximadamente 30V, durante 12h. Após a transferência, a
membrana foi incubada com a solução TBS-T [tampão Tris-salina contendo
0,05% (v/v) de Tween 20] suplementada com BSA 5% (albumina sérica bovina)
por 1h, em agitador orbital, a temperatura ambiente. Após descartar a solução de
BSA, adicionou-se o anticorpo policlonal primário anti-ASS (BD Transduction
Laboratories) diluído em tampão TBS-T a 1:500, (recomendação do fabricante) e
incubou-se por mais 1h a temperatura ambiente. Após este período, a solução do
anticorpo foi removida, e a membrana foi lavada com a solução TBS-T, por três
vezes, durante 10 min cada, a temperatura ambiente. Após descartar a solução
de TBS-T, adicionou-se o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo
conjugado com fosfatase alcalina (Promega), diluído a 1:7500 em tampão TBS-T.
Após a incubação, sob agitação, por 1h, a temperatura ambiente, a membrana foi
novamente lavada por três vezes em tampão TBS-T por 10min cada. Finalmente,
As bandas foram reveladas usando solução AP (100mM NaCl, 100mM Tris-HCl,
pH 9.5, 5mM MgCl2) contendo 115mM BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato) e
60mM NBT (nitro blue tetrazolium) como substrato. Para determinação da massa
molecular aproximada das proteínas com afinidade pelo anticorpo, a posição das
bandas foi comparada às do marcador de massa molecular Amersham Full-
Range Rainbow (GE Healthcare, EUA).
3.4.4 Espectrometria de Massas
Após análise da proteína eluída em gel de SDS-poliacrilamida, a banda da
proteína com massa molecular semelhante a da ASS foi recortada do gel com
auxílio de uma lâmina e picotadas em fragmentos pequenos. Em seguida, os
fragmentos de géis foram transferidos para um tubo no qual foi adicionada uma
solução de NH4HCO3 75mM em etanol 40% e a mistura foi incubada por 60min a
temperatura ambiente. O processo foi repetido até o gel ficar completamente
descolorado. Então a proteína no gel foi submetida à reação de redução com a
adição de DTT (ditiotreitol) 5mM em NH4HCO3 25mM por 30min a 60ºC, seguida
de uma reação de alquilação com iodoacetamida 55mM em NH 4HCO3 25mM por
30min a temperatura ambiente, no escuro. Ao término da alquilação os
fragmentos de gel foram lavados uma vez com NH4HCO3 25mM. Fez-se a
desidratação dos fragmentos de gel incubando-os por três vezes com acetonitrila
por 10min e então os fragmentos foram secos por 10min a vácuo. Logo após, o
gel foi reidratado em uma solução contendo tripsina 40μg/ml em NH4HCO3 50mM
por 45min no gelo. Em seguida, a solução de tripsina foi retirada, uma solução de
NH4HCO3 50mM foi adicionada (em um volume suficiente para cobrir os
fragmentos de gel) e o tubo contendo os fragmentos de gel foi incubado em
banho termostatizado (a 37°C) por 16h.

Os fragmentos das proteínas digeridas foram extraídos do gel pela adição
de 0,05ml de NH4HCO3 50mM e incubação por 10min em banho de ultra-som,
seguida pela adição de 0,05ml de ACN. Este procedimento foi repetido por três
vezes. Os eluatos contendo os fragmentos gerados pela digestão com tripsina
foram secos a vácuo, ressuspensos em TFA 0,1%, e submetidos à dessalinização
em ZipTip C18 (Millipore). Cada amostra foi adicionada à placa de análise do
espectrômetro de massas Ettan MALDI-TOF/Pro e misturada com o mesmo
volume de uma solução saturada de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (Sigma)
em ACN 50%/TFA 0,1%. Para as análises o espectrômetro foi previamente
calibrado com P14R ([M+H]+ 1533,86) e angiotensina II ([M+H)]+ 1046,54). As
análises foram realizadas pelo Ms. Clécio F. Klitzke, do Laboratório de
Espectrometria de Massas - LETA – CAT/CEPID – Instituto Butantan.
3.4.5 Determinação da atividade enzimática da ASS
A ASS recombinante foi submetida à quantificação pelo método de
Bradford (Bradford, 1976) e então sua atividade enzimática foi determinada na
ausência ou prensença dos Bj-BPPs. A metodologia empregada para medir a
atividade enzimática da ASS foi a descrita por Hao et. al., 2004, que consiste em
medir, por colorimetria, o fosfato inorgânico gerado indiretamente pela ação
enzimática da ASS. A ASS conjuga a citrulina ao aspartato gerando
argininosuccinato, com concomitante hidrólise do ATP (adenosina tri-fosfato)
gerando AMP (adenosina mono-fosfato) e pirofosfato (Figura 5). O pirofosfato
resultante é então hidrolisado pela pirofosfatase (enzima adicionada à reação)
liberando duas moléculas de fosfato inorgânico que reagem com molibdato de
amônio produzindo uma solução de coloração azul.

Figura 5 – Representação esquemática da reação catalisada pela ASS. O primeiro passo da

reação é a incorporação do AMP à citrulina com liberação de pirofosfato. Em seguida, há a troca
do AMP pelo aspartato com liberação do AMP. Finalmente, ocorre a liberação do produto
arginosuccinato. (Figura de Lemke et. al, 1999)
Cerca de 1μg de ASS foi adicionado ao tampão de reação (Tris-HCl 20mM
pH 7,8; ATP 2mM, citrulina 2mM; aspartato 2mM; MgCl2 6mM; KCl 20mM e
pirofosfatase 0,2U) para volume final de 200μl de reação. As reações foram
incubadas a 37ºC em placas de 96 poços com concentrações crescentes dos
peptídeos (0,001 - 100μM) e/ou 1mM do inibidor específico da enzima, o MDLA
(ácido metil DL aspártico - Sigma) e após 30min a reação foi interrompida com a
adição de um volume igual de tampão molibdato (ácido ascórbico 10mM,
molibdato de amônio 2,5mM e ácido sulfúrico 2%). O acúmulo de fosfato
inorgânico gerado nas amostras foi determinado por colorimetria a 650nm e pela
comparação dos valores obtidos com uma curva padrão. Esta foi obtida
incubando-se crescentes concentrações (5 – 400 M) de fosfato inorgânico e o
tampão molibdato.
3.5 Cultura de Células HEK 293 (human embryonic kidney 293)
A linhagem celular HEK 293 são células renais embrionárias humanas
transfectadas com adenovírus tipo 5 [ATCC no. CRL-1573]. A manutenção
dessas células foi realizada utilizando-se o meio DMEM, suplementado com 10%
de soro bovino fetal, 100mg/ml penicilina/estreptomicina e 2mM L-glutamina e
mantidas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2.
3.6 Quantificação da concentração de NO
Para a quantificação de NO, as células HEK 293 foram tripsinizadas e 1 x
106 repassadas para placas de 6 poços com meio de cultura apropriado conforme
descrito anteriormente. Após o período de adesão celular, o meio de cultura foi
trocado por meio sem soro, e as células foram incubadas com concentrações
crescentes dos Bj-BPPs por 24h. Em seguida, o meio de cultura foi coletado e
centrifugado a 90g por 5min para eliminar possíveis fragmentos celulares e o
sobrenadante (meio extracelular) foi coletado.
As células foram lisadas com o tampão RIPA (50mM Tris-HCl, pH7,5,
150mM NaCl, 1% Nonidet p-40 (NP-40), 0,5% deoxicolato de sódio, 0,1% SDS,
1mM Ácido Dietilenotriaminopentacético e 10mM N-etilmaleimida). Em seguida, o
lisado celular foi coletado e incubado no gelo por 30min, foram centrifugados a
21000g a 4ºC por 15min e então o sobrenadante (meio intracelular) foi coletado.
O meio extra e intracelular foi injetado no analisador de NO (NOA 280i – Sievers),
seguindo a metodologia descrita por Feelisch et. al., 2002.
Embora o NO gasoso possa ser detectado diretamente, o NO formado em
sistemas biológicos é rapidamente oxidado a nitrato e nitrito (NOx). Para
determinação de NO por quimiluminescência em fase gasosa, nitrato e nitrito
foram reduzidos a NO por solução saturada de cloreto de vanádio (VCl3) em HCl
1M a 90ºC. O NO reagiu com ozônio (O3) para formar dióxido de nitrogênio, em
estado excitado (NO2*). Como o dióxido de nitrogênio volta ao estado de menor
energia (NO2) a luz foi emitida (hv). (Tarpey e Fridovich, 2001).
O3 + NO O2 + NO2* NO2 + hv
3.7 Medidas de variação da concentração de cálcio intracelular livre [Ca 2+]i.
As alterações na [Ca2+]i foram determinadas por microfluorimetria utilizando
o equipamento FlexStation 3 (Molecular Devices, EUA), de acordo com Lameu et
al., 2010a. As células HEK-293 foram cultivadas como descrito anteriormente e
repassadas para placas de paredes pretas e fundo transparente de 96 poços
(Costar, RU) a uma densidade de 5 x 104 células por poço em meio sem soro.
As células foram incubadas a 37ºC por 60min com o FlexStation Calcium
Kit contendo 2,5mM de probenecide seguindo as instruções do fabricante. O
volume final para cada poço foi de 200μl. A placa de células foi colocada no
FlexStation 3 (Molecular Devices, EUA) para monitoramento da fluorescência
antes e depois da adição de concentrações crescentes dos Bj-BPPs (adição de
50μl - 0,01-3μM concentração final). A fluorescência das amostras foi excitada a
485nm e a fluorescência de emissão foi detectada a 525nm. As amostras foram
lidas nos intervalos de 1,52s até 120s, totalizando 79 leituras por poço. Após 20s
de acompanhamento da intensidade de fluorescência basal da [Ca2+]i das células
não estimuladas, o peptídeo agonista foi adicionado ao poços e a indução de
[Ca2+]i transiente foi monitorada por 100s. As respostas foram medidas pela
intensidade do pico de fluorescência em comparação a intensidade de
fluorescência basal e calculadas no software SoftMax Pro (Molecular Devices,
EUA).
3.8 Análise Estatística
Com o auxílio do Software GraphPad Prism 5, os testes estatísticos foram
realizados por meio da análise de variância com comparações múltiplas (One-
Way ANOVA), indicado para verificar diferenças em 3 ou mais grupos distintos,
utilizando a correção de Bonferroni ou utilizando o teste de Dunnet’s para análises

comparativas de dois grupos. Níveis descritivos (p) inferiores a 0,05 ou 5% foram
considerados significantes e representados por um asterisco (*) (Neter et. al.,
1990).
4.RESULTADOS
4.1 Potenciação da BK pelos Bj-BPPs sobre a pressão arterial de ratos
Wistar anestesiados.
A avaliação e comparação da intensidade de potenciação da BK pelos Bj-
BPPs foram realizadas em ratos Wistar anestesiados após administração
intravenosa dos Bj-BPPs na dose de 60nmol. A figura 6 apresenta a resposta
hipotensora da BK antes e após a administração dos Bj-BPPs 5a, 9a, 10c, 11e,
12b e 13a em ratos normotensos anestesiados.
Nesse experimento observamos que todos os Bj-BPPs avaliados foram
capazes de potencializar a resposta hipotensora da BK (0,5µg). No entanto, a
amplitude de potenciação foi diferenciada para cada peptídeo. O efeito
potenciador do Bj-BPP-5a foi observado apenas nos tempos de 10 e 15min após
a sua injeção. O Bj-BPP-9a perdeu seu efeito potenciador sobre BK a partir de
30min após sua administração. O Bj-BPP-10c potenciou o efeito hipotensor da BK
durante todo período experimental. O Bj-BPP-12b causou potenciação da BK no
período compreendido entre 5 e 25min. Os Bj-BPPs 11e e 13a potenciaram a
resposta hipotensora da BK somente nos tempos de 10 a 20min e 5, 10 e 30min,
respectivamente. O Bj-BPP-10c apresentou o melhor efeito potenciador da BK
dentre os peptídeos estudados, seguido dos Bj-BPPs 9a, 12b e 13a (132, 114,
109 e 62%, respectivamente). Os Bj-BPPs 5a e 11e foram equipotentes com
potenciação máxima de 48%. (Tabela 3).

A Tempo (min) B Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
0 0
-10 -10
PAM (mmHg)
PAM (mmHg)
-20 -20
-30 -30 **
** *
* **
-40
* -40 **
** *
BK 0 5 g)
-50 -50 BK 0 5 g)
BK (1,0 g) BK (1,0 g)
BPP-5a -60
BPP-9a
-60
C Tempo (min) D Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
0 0
-10 -10
PAM (mmHg)
PAM (mmHg)
-20 -20
**
** * *
-30 *** ** ** -30
*
** ***
**
-40 -40
BK 0 5 g) BK 0 5 g)
-50 BK (1,0 g) -50 BK (1,0 g)
BPP-10c BPP-11e
-60 -60
E Tempo (min) F Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
0 0
-10 -10
PAM (mmHg)
PAM (mmHg)
-20 -20
* * **
* **
-30
** *
-30 ** ** *
-40 -40
BK 0 5 g)
BK 0 5 g)
-50 -50 BK (1,0 g)
BK (1,0 g)
BPP-13a
BPP-12b
-60 -60
Figura 6 – Efeito hipotensor da BK na pressão arterial de ratos Wistar anestesiados antes e

após administração de Bj-BPPs. Injeção intravenosa in bolus de Bj-BPP foi feita na dose de
60nmol. A. Bj-BPP-5a (n=4) (Gomes et. al., 2007); B: Bj-BPP-9a (n=4) C: Bj-BPP-10c (n=4); D: Bj-
BPP-11e (n=5); E: Bj-BPP-12b (n=4) and F: Bj-BPP-13a (n=5). Dados expressos como média ±
EPM. *p<0,05; **p<0,01 e *** p<0,001 vs. BK (0,5µg) antes da injeção do Bj-BPP.
4.2 Efeitos cardiovasculares da administração intravenosa de Bj-BPPs em
ratos espontaneamente hipertensos acordados
Os efeitos cardiovasculares causados pela administração intravenosa dos
Bj-BPPs foram avaliados em SHRs acordados. Os animais tiveram a pressão
arterial média (PAM) e a frequência cardíaca (FC) monitoradas durante 6h após a
injeção in bolus dos Bj-BPPs (71nmol/Kg). As Figuras 7 a 13 apresentam as
variações máximas da PAM e FC a cada 10min durante 6h após a administração
dos Bj-BPPs e do veículo.
A variação dos parâmetros cardiovasculares causados pela administração
i.v. dos Bj-BPPs na dose de 71nmol/Kg em SHRs mostrou que todos os peptídeos
avaliados foram capazes de reduzir a pressão arterial desses animais. No
entanto, a amplitude do efeito anti-hipertensivo foi diferenciada para cada
peptídeo.
Os Bj-BPPs 5a, 12a e 13a causaram alteração similar da PAM em tempos
diferenciados, atingindo média de redução de 23±4mmHg após 5,5h; 19±2mmHg
após 4h e 22±3mmHg após 5h, respectivamente (Figuras 7A, 11A e 12A). Os
BPPs 5a e 12b provocaram similar efeito bradicárdico, com redução da FC de
39±12bpm, após 6h e 43±8bpm após 5,8h, respectivamente (Figuras 2B e 6B).
Os Bj-BPPs 9a e 11e provocaram discreta alteração da PAM (redução
média de -17±4mmHg, após 5,5h para ambos peptídeos) (Figuras 8A e 10A). Ao
contrário dos outros Bj-BPPs avaliados, o efeito anti-hipertensivo causado pelo Bj-
BPP-9a não foi acompanhado da redução de frequência cardíaca (Figura 9B).
Os Bj-BPPs 10c, 11e e 13a provocaram potente redução da FC, variando
em torno de -47 a -56bpm (Figuras 9B, 10B e 12B).

A administração do veículo (NaCl 0,9%) não causou alteração significativa
da PAM ou da FC (Figura 13). Os valores da alteração máxima nos parämetros
cardiovasculares (PAM e FC) de SHRs causada pela administração dos Bj-BPPs
estão apresentados na Tabela 3. Os valores das respostas máximas
apresentados foram obtidos a partir da observação do pico máximo de queda da
PAM e FC de cada animal, sem considerar o tempo do período experimental.

‘
B P P -5 a
A
15
T e mpo (min)
5 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
PAM (m m Hg)
-5
-15
-25
-35
-45
*
-55
B
50
40
30 T e mpo (min)
20
10
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
FC (bpm )
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80 *
administração do Bj-BPP-5a (Ianzer et al., submitted). A: pressão arterial media (PAM) e B:
Frequência cardíaca (FC). Injeção intravenosa de Bj-BPP-5a (n=5) foi feita na dose de 71nmol/kg.
Dados apresentados como média ± EPM.
BPP-9a
A
15
Tempo (min)
5
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-5
PAM (mmHg)
-15
-25
-35
-45
*
-55
B
Tempo (min)
50 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
40
30
20
10
FC (bpm)
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80

administração do Bj-BPP-9a. A: pressão arterial media (PAM) e B: Frequência cardíaca (FC).
Injeção intravenosa de Bj-BPP-9a (n=5) foi feita na dose de 71 nmol/kg. Dados apresentados
como média ± EPM.
BPP-10c
A
15
Tempo (min)
5
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-5
PAM (mmHg)
-15
-25
-35
-45
-55
*
B
50
40
30 Tempo (min)
20
10
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
FC (bpm)
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80 *

administração do Bj-BPP-10c (Ianzer et al., 2007). A: pressão arterial media (PAM) e B:
frequência cardíaca (FC). Injeção intravenosa de Bj-BPP-10c (n=8) foi feita na dose de 71
nmol/kg. Dados apresentados como média ± EPM.
BPP-11e
A
15
Tempo (min)
5
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-5
PAM (mmHg)
-15
-25
-35
-45
*
-55
B
50
40
30 Tempo (min)
20
10
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
FC (bpm)
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80 *

administração do Bj-BPP-11e. A: pressão arterial media (PAM) e B: Frequência cardíaca (FC).
Injeção intravenosa de Bj-BPP-11e (n=5) foi feita na dose de 71 nmol/kg. Dados apresentados
como média ± EPM.
BPP-12b
A
15
Tempo (min)
5 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-5
PAM (mmHg)
-15
-25
-35
-45
*
-55
B
50
40
30 Tempo (min)
20
10
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
FC (bpm)
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80 *

administração do Bj-BPP-12b. A: pressão arterial media (PAM) e B: Frequência cardíaca (FC).
Injeção intravenosa de Bj-BPP-12b (n=4) foi feita na dose de 71 nmol/kg. Dados apresentados
como média ± EPM.
BPP-13a
A
15
Tempo (min)
5
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-5
PAM (mmHg)
-15
-25
-35
-45
*
-55
B
50
40
30 Tempo (min)
20
10
30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
FC (bpm)
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80 *

administração do Bj-BPP-13a. A: pressão arterial media (PAM) e B: Frequência cardíaca (FC).
Injeção intravenosa de Bj-BPP-13a (n=5) foi feita na dose de 71 nmol/kg. Dados apresentados
como média ± EPM.
Veículo
Tempo (min)
A
15 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-5
PAM (mmHg)
-15
-25
-35
-45
-55
B Tempo (min)
50 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360

40
30
20
10
FC (bpm)
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80

administração do veículo. A: pressão arterial media (PAM) e B: Frequência cardíaca (FC).
Dados apresentados como média ± EPM.
Tabela 3. Ensaios in vivo de alguns Bj-BPPs encontrados no cérebro e no veneno da Bothrops jararaca. Efeito máximo de: redução da pressão
arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC). Efeito máximo de potenciação da BK.
Redução Redução Potencialização

Sequência de
Bj-BPP Origem Máxima na PAM Máxima na FC Máxima da BK
aminoácidos
(mmHg) (bpm) (%)
Bj-BPP-5a <EKWAP Venenoa / Cérebrob -30±5* -66±9* 48±5e

Bj-BPP-9a <EWPRPQIPP Venenoa -22±3* -40±15 114±31
Bj-BPP-10c <ENWPHPQIPP Venenoa / Cérebrob -53±6*d -67±10*d 132±22
Bj-BPP-11e <EARPPHPPIPP Cérebrob -26±3* -61±9* 48±10
Bj-BPP-12b <EWGRPPGPPIPP Cérebrob -25±2* -54±9* 109±17
Bj-BPP-13a <EGGWPRPGPEIPP Venenoc / Cérebrob -27±2* -67±10* 62±15
*p<0,05 quando comparado ao grupo controle, que corresponde as alterações dos parâmetros cardiovasculares observadas no grupo tratado com o
veículo.
a
Ferreira et al.1970
b
Hayashi et al.2003
c
Ianzer et al.2004
d
Ianzer et al.2007
e
Gomes et al.2007
4.3 Clonagem e expressão da ASS recombinante humana
A inserção correta do fragmento de cDNA que codifica a ASS humana no
vetor de expressão pDEST 17 foi verificada por análise de restrição (Figura 14) e
confirmada por seqüenciamento de nucleotídeos (dados não mostrados).
A expressão da ASS humana em sistema procarionte apresentou
rendimento de cerca de 2mg de proteína por litro de cultura, após indução com L-
arabinose. A análise por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida da ASS
purificada do lisado bacteriano mostrou que a banda correspondente à ASS em
fusão com a cauda de histidina foi a única observada quando o gel foi corado com
Coomassie blue (Figura 15). Ainda, a análise por Western blot da proteína
recombinante purificada, utilizando-se o anticorpo anti-ASS, mostrou que houve
reconhecimento da banda correspondente a ASS humana (Figura 16).
A banda correspondente à ASS em fusão com a cauda de histidina
visualizada no gel de SDS-poliacrilamida foi recortada, submetida à digestão com
tripsina e os fragmentos gerados foram analisados por espectrometria de massas
(peptide mass fingerprinting em espectrômetro MALDI-TOF) no qual foi possível
identificar os peptídeos correspondentes à ASS humana (Tabela 4). Em conjunto,
esses resultados mostraram que houve a expressão da ASS em células
procariontes e que a purificação permitiu obter a ASS recombinante humana
isolada.
A clonagem, a expressão e a purificação da ASS recombinante humana
permitiram avaliar o efeito direto do Bj-BPPs sobre a atividade catalítica da
enzima. Contudo, foi necessário verificar se a ASS recombinante humana
apresentava a mesma atividade catalítica da ASS recombinante adquirida

comercialmente, e ainda se os peptídeos apresentariam o mesmo tipo de efeito
sobre a atividade catalítica das duas enzimas.
1 2 3
23,1kb
9,4kb
6,5kb
4,4kb
pDEST 17
2,3kb
2kb
cDNA da AsS
Figura 14 – Perfil eletroforético em gel de agarose mostrando fragmentos de DNA. linha 1 –

vetor pDEST 17 contendo o fragmento de cDNA codificante para a ASS submetido à digestão com
a enzima de restrição EcoR I; linha 2 – vetor pDEST 17 sem a inserção do cDNA codificante para
a ASS e digerido com a enzima EcoR I. Linha 3 - padrões de fragmentos de DNA (λ Hind III).
1 2
63 kDa
50 kDa
46 kDa
23 kDa
13 kDa
Figura 15 – Perfil eletroforético da ASS recombinante humana em gel 10% de SDS-

poliacrilamida. Linha 1 - Marcadores de massa molecular. Linha 2 – ASS humana recombinante
obtida pela expressão em E. coli.
1 2
50 kDa
35 kDa
Figura 16 – Análise por Western blot da ASS humana recombinante obtida pela expressão
em E. coli. Linha 1 - Proteína purificada revelada pelo anticorpo anti-ASS. Linha 2 - Marcadores
de massa molecular.
Tabela 4 – Confirmação da identidade da ASS recombinante por espectrometria de massas.

A confirmação da ASS expressa em bactérias foi realizada após digestão tripsínica em gel e por
análise das massas dos peptídeos gerados em MALDI-TOF.
Amostra Massa
analisada Peptídeo identificado (Da) Proteína identificada
IDIVENR 858,468
NQAPPGLYTK 1088,573
FELTCYSLAPQIK 1569,777
EFVEEFIWPAVQSSALYEDR 2415,15
RQVEIAQR 999,5694
KVFIEDVSK 1064,599
NDLMEYAK 999,4463
YLLGTSLAR 993,5728 Argininosuccinato Sintase (E.C. 6.3.4.5)
QVEIAQR 843,4683 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
MPEFYNR 956,4295
Proteína xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
correspondente VFIEDVSK 936,5037 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
a AsS expressa QHGIPIPVTPK 1186,694 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
em bactérias. EDFEEAR 895,3792 xxxxxx
4.4 Efeito dos Bj-BPPs sobre a atividade catalítica da ASS
Através de ensaios utilizando quantidades crescentes da enzima (1, 2, 3, 4
e 6 g), observamos que a enzima estava ativa, visto que o aumento da atividade
foi proporcional ao aumento da quantidade de enzima (Figura 17A). Também
avaliamos a atividade de 1 g de ASS recombinante em função do tempo,
possibilitando a observação que sua atividade era crescente até 45min de
incubação, decrescendo após esse período (Figura 17B). Além disso,
comparamos a atividade da enzima recombinante obtida no nosso laboratório
com a adquirida comercialmente, e os resultados mostraram que a mesma
quantidade de proteína de ambas as preparações (da ASS recombinante humana
e ASS adquirida comercialmente) apresentaram velocidades catalíticas
equiparáveis (Tabela 5). Todos juntos, estes resultados sugerem que a expressão
da ASS recombinante humana em sistema procarionte resultou em uma enzima
ativa com a capacidade de conjugação da citrulina com o aspartato para gerar

argininosuccinato, que foi inibida pelo MDLA, um inibidor específico da ASS
(Figura 18) (Shen et. al., 2005; Flam et al., 2007).
Após terem sido confirmadas a característica e integridade enzimática da
ASS, avaliamos os efeitos de concentrações crescentes dos Bj-BPPs sobre a
atividade da enzima recombinante. Os resultados desses ensaios revelaram que
os Bj-BPPs estudados possuem efeitos distintos sobre a ASS. Alguns Bj-BPPs
são capazes de modular positivamente sua atividade catalítica, como é o caso do
Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a (Figura 19D e E), em contrapartida, nas concentrações
estudadas, alguns peptídeos não alteram a atividade catalítica da ASS, isso foi
observado para os Bj-BPPs 9a e 11e (Figura 19B e C). Resultados ainda mais
antagônicos aos peptídeos que modulavam positivamente e aqueles que não
alteravam a atividade catalítica da ASS foram os obtidos com o Bj-BPP-5a, que
modula negativamente a atividade catalítica dessa enzima (Figura 19A).

A B
25 250
] u M /m in
20 200
(u M )
15 150
3-
4
P r o d u ç ã o [P O
3-
PO4
10 100
5 50
0 0
5
10
20
30
45
60
0,
A S S (u g ) T e m p o (m i n )
Figura 17 – Caracterização da atividade enzimática da ASS recombinante utilizando o

método de colorimetria. A - Avaliação da atividade enzimática com quantidades crescentes de
enzima; B- Avaliação da atividade enzimática (1 g de ASS) em diferentes intervalos de tempo.
150
] u M /m in
100
3-
4
% P r o d u c a o [P O
50
***
0
al
10
as
B
M D L A (m M )
Figura 18 – Efeito do MDLA na atividade enzimática da ASS recombinante. Avaliação da

atividade enzimática (1 g de ASS) na presença de 1 ou 10mM de MDLA, um inibidor específico da
ASS.
Tabela 5 – Validação da atividade enzimática da ASS recombinante. A atividade enzimática da

ASS recombinante humana é comparável à da ASS recombinante adquirida comercialmente. Os
valores são a média ± desvio-padrão de três replicatas.
Proteína Atividade catalítica (μM/min)
ASS comercial 1,27 ± 0,13
ASS recombinante humana 1,23 ± 0,39

A B
150 150
]
]
3-
3-
4
4
% P ro d u ç ã o [P O
100 100
* * * ** ** ** *
***
50 50
0 0
al
01
03
0
1
10
30
1
3
al
01
03
0
1
3
1
10
30
0.
0.
10
0.
0.
10
as
as
0.
0.
0.
0.
B
B
[B j -B P P -5 a ] ( M) [B j -B P P -9 a ] ( M)
C D
150 200
**
*
*
]
150
3-
3-
4
4
100
100
50
50
0 0
al
al
0
0
01
03
01
03
3
1
10
30
10
30
0.
0.
0.
0.
10
10
as
as
0.
0.
0.
0.
B
[B j -B P P -1 1 e ] ( M) [B j -B P P -1 2 b ] ( M)
150 ***
*** ***
***
*
* *
]
3-
4
100
50
0
al
01
03
0
1
10
30
1
3
0.
0.
10
as
0.
0.
B
[B j -B P P -1 3 a ] ( M)
Figura 19 – Efeito de concentrações crescentes dos Bj-BPPs sobre a atividade enzimática

de 1 g de ASS recombinante. A - Bj-BPP-5a; B - Bj-BPP-9a; C - Bj-BPP-11e; D - Bj-BPP-12b; E
- Bj-BPP-13a. Os valores são a média ± desvio-padrão de três experimentos.
4.5 Efeito dos Bj-BPPs na produção de NO por células HEK293
Ensaios para avaliar a produção de NO seriam uma forma indireta de
avaliar ou correlacionar o efeito dos Bj-BPPs sobre a ASS ou até mesmo verificar
se esses peptídeos alteram a produção de NO sem afetar a atividade catalítica
dessa enzima.
Testamos a capacidade dos peptídeos estimularem a produção de NO em
células HEK-293. Após o tratamento das células com quantidade crescentes de
cada Bj-BPP, observamos que o Bj-BPP-9a, Bj-BPP-11e e Bj-BPP-12b nas
concentrações utilizadas não interferiram na produção de NO por essas células
(Figura 20).
O Bj-BPP-5a e o Bj-BPP-13a promoveram aumentos significativos na
produção de NO pelas células HEK293. Na figura 20A e E, podemos observar
que células HEK-293 estimuladas por 24 horas com Bj-BPP-5a nas
concentrações entre 0,3 e 3 M aumentaram a produção de NO em 137%, de
basal 4,75±0,68 para 13,68±1,84nmol/106 células. Na figura 20E,
semelhantemente ao Bj-BPP-5a, o Bj-BPP-13a nas concentrações entre 0,1 e
3μM induziu um aumento de 148%, de basal 4,75±0,68 para 14,09±1,4nmol/106
células).
Mediante esses resultados, buscamos avaliar a participação da ASS, do
receptor B2 de cininas, dos receptores de acetilcolina muscarínicos e do receptor
2-adrenérgico, no mecanismo de produção de NO por células HEK-293 induzida
pelo Bj-BPP-5a e Bj-BPP-13a. Para tanto, as células incubadas com o Bj-BPP-5a
(0,3 M) ou Bj-BPP-13a (0,1 M) foram pré-tratadas com o inibidor específico da
ASS, MDLA e com antagonistas de receptores de membrana B2 de cininas, HOE-

140; 2-adrenérgico, yohimbina e muscarínicos do subtipo M1, pirenzepina; M2,
galamina e M3, 4-DAMP (4-Diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide). Os
resultados mostraram que o mecanismo pelo qual o Bj-BPP-5a induz a produção
de NO deve envolver ambos, receptor B2 de cininas e receptor muscarínico do
subtipo M1 (Figura 21), já que o HOE-140 e pirenzepina reduziram cerca de 40%
e 60%, respectivamente a resposta do peptídeo.
Na produção de NO induzida pelo Bj-BPP-13a, foi possível observar que
tanto o inibidor da ASS como o antagonista do receptor muscarínico do subtipo
M3 interferiram na produção de NO induzida pelo Bj-BPP-13a, cerca de 10 e
25%, respectivamente (Figura 22).
A concentração do MDLA, inibidor da ASS, utilizada foi de 10mM, a
requerida para bloquear o efeito de seu ativador, Bj-BPP-10c (Guerreiro et. al.,
2009) em células HEK293. As concentrações dos antagonistas dos receptores B2
de cininas (HOE-140 1 M), 2-adrenérgico (yohimbina 10 M) e muscarínicos dos
subtipos M1 (pirenzepina 1mM), M2 (galamina 100 M) e M3 (4-DAMP 10 M)
utilizadas foram suficientes para inibir a resposta de seus agonistas 1 M de BK,
1mM de L-arginina e 50 M de muscarina. (Figura 23)

A B
20 20
***
15 *** 15
( n m o l/1 0 6 c é lu la s )
( n m o l/1 0 6 c é lu la s )
***
*
N O x tota l
N O x tota l
10 10
5 5
0 0
al
al
03
3
1
03
1
3
0,
0,
0.
0.
as
as
0,
0.
B
B
[B j -B P P -5 a ] ( M ) [B j -B P P -9 a ] ( M )
C D
20 20
15 15
( n m o l/1 0 c é lu la s )
N O x tota l
N O x tota l
10 10
6
5 5
0 0
al
al
03
03
1
3
0,
0,
0,
0,
as
as
0,
0,
B
[B j -B P P -1 1 e ] ( M ) [B j -B P P -1 2 b ] ( M )
E
20
*** ***
15 ***
***
***
N O x tota l
10
6
0
al
3
1
3
03
0,
0,
as
0,
B
[B j -B P P -1 3 a ] ( M )
Figura 20 – Produção de NO por células HEK293 estimuladas com concentrações

crescentes (0,03 - 3 M) de BPPs . A - Bj-BPP-5a; B - Bj-BPP-9a; C - Bj-BPP-11e; D - Bj-BPP-
12b; E - Bj-BPP-13a. Os valores são a média ± desvio-padrão de três experimentos
independentes.
( n m o l/1 0 c é lu la s ) 150
100
% NO x t o t a l
*
6
***
50
0
a
40
na
a
na
P
LA
-5
in
M
-1
pi
bi
D
P
am
A
E
ze
+M
im
P
-D
O
B
al
en
oh
+4
+H
+G
ir
+Y
P
+
Figura 21 – Intermediação dos receptores B2 de cininas e muscarínico do subtipo M1 na

produção de NO induzida pelo Bj-BPP-5a em células HEK293. Porcentagem de metabólitos de
NO (NOx) formados em células HEK293 estimuladas com 0,3 M de Bj-BPP-5a na ausência ou
presença de 10mM de MDLA, inibidor da ASS e antagonistas de receptores de membrana: 1 M
de HOE-140, antagonista de B2 de cininas; 1mM de pirenzepina, antagonista de receptor
muscarínico do subtipo M1; 100 M de galamina, antagonista de receptor muscarínico do subtipo
M2 e 10 M de 4-DAMP, antagonista de receptor muscarínico do subtipo M3.
150
100
*
% NO x t o t a l
***
6
50
0
3a
40
P
na
LA
na
in
M
-1
-1
pi
bi
D
am
A
P
ze
+M
im
-D
P
al
en
oh
+4
B
+H
+G
ir
+Y
+P
Figura 22 – Intermediação da ASS e do receptor muscarínico do subtipo M1 na produção de

NO induzida pelo BPP-13a em células HEK293. Porcentagem de metabólitos de NO (NO x)
formados em células HEK293 estimuladas com 0,1 M de Bj-BPP-13a na ausência ou presença de
10mM de MDLA, inibidor da ASS e antagonistas de receptores de membrana: 1 M de HOE-140,
antagonista de B2 de cininas; 1mM de pirenzepina, antagonista de receptor muscarínico do
subtipo M1; 100 M de galamina, antagonista de receptor muscarínico do subtipo M2 e 10 M de 4-
DAMP, antagonista de receptor muscarínico do subtipo M3.
250 250
200 200
% N O x t o t al
% N O x t o t al
150 150
***
100 100
**
50 50
0 0
al
40
al
na
na
B
as
as
-1
ni
bi
E
B
gi
O
ar
hi
H
L-
yo
+
K
+
B
na
ni
gi
ar
L-
800
600
% N O x to tal
400 **
*** ***
200
0
al
na
P
a
in
in
M
as
ri
ep
A
ca
B
D
la
nz
4-
us
ga
re
+
M
+
pi
na
na
+
ri
ri
na
ca
ca
ri
us
us
ca
M
M
us
M
Figura 23 – Interferência dos inibidores na resposta de agonistas de receptores 2-

adrenérgico, B2 de cininas, muscarínicos do subtipo M1, M2 e M3. Porcentagem de
metabólitos de NO (NOx) formados em células HEK293 estimuladas com agonistas após pré-
incubação das células com seus inibidores por 30min. As concentrações dos antagonistas dos
receptores B2 de cininas (HOE-140 1 M), do receptor 2-adrenérgico (yohimbina 10 M) e dos
receptores muscarínicos dos subtipos M1 (pirenzepina 1mM), M2 (galamina 100 M) e M3 (4-
DAMP 10 M), foram suficientes para inibir a resposta de seus agonistas 1 M de BK, 1mM de L-
arginina e 50 M de muscarina, respectivamente.
4.5 Mobilização de [Ca2+]i induzida pelos Bj-BPPs em células HEK293
Os transientes de [Ca2+]i induzido pelos Bj-BPPs após estimulação das
células HEK293 com os peptídeos foram monitorados por microfluorimetria
(Lameu et al., 2010a). As curvas dose-resposta para elevação da [Ca2+]i para
cada peptídeo foi determinada individualmente. O Bj-BPP-5a apresentou uma
potência (valores de pD2) de 7,93±0,12; o BPP-11e, 7,15±0,11; BPP-12b,
8,63±0,15 e o BPP-13a, 7,82±0,17, enquanto que nenhuma resposta de [Ca2+]i
significante pode ser observada pela estimulação das células com o Bj-BPP-9a
(Figura 24). Além disso, observamos que o aumento da [Ca2+]i foi instantâneo e
transiente, ou seja, imediatamente após a aplicação do Bj-BPPs o pico de
resposta alcançou a [Ca2+]i (dados não mostrados).

A B C
125 125 125

% U n id ad e d e F lu o rescên cia
100 100 100
(m a x -m i n )
(m a x -m i n )
(m a x -m i n )
75 75 75
50 50 50
25 25 25
0 0 0
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -9 -8 -7 -6 -5 -12 -10 -8 -6 -4
lo g [B P P -5a] (M ) lo g [B P P -9a] (M ) lo g [B P P -11e ] (M )
D E
125 125
100 100
(m a x -m i n )
(m a x -m i n )
75 75
50 50
25 25
0 0
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5
lo g [B P P -12b ] (M ) lo g [B P P -1 3 a ] (M )
2+
Figura 24 – Mobilização de cálcio intracelular ([Ca ]i) em HEK293 estimuladas com
concentrações crescentes dos Bj-BPPs 5a, 9a, 11e, 12b e 13a. As curvas dose-resposta foram
obtidas pela regressão não-linear e os valores pD2 (-log EC50) foram calculados usando o
programa Graph-Pad PRISM (GraphPad Software). Os valores são a média ± desvio padrão de
três experimentos independentes.
5.DISCUSSÃO
5.1 Os Bj-BPPs apresentam efeitos diferenciados sobre o RAS e SCC
A potenciação dos efeitos contráteis de BK em íleo isolado de cobaia foi
observada pela primeira vez com o veneno bruto da serpente Bothrops jararaca, e
ainda não se sabia ao certo quais substâncias dessa mistura complexa de
moléculas eram responsáveis por essa resposta (Rocha e Silva et. al., 1949).
Atualmente já está bem estabelecido que esse efeito desencadeado pelo veneno
da Bothrops jararaca é devido a peptídeos vasoativos presentes na sua
composição, os Bj-BPPs (Ferreira et. al., 1970). O efeito desses peptídeos de
potenciação das respostas da BK sempre foi atribuído a capacidade de inibir a
ECA (Stewart et. al., 1971; Smith e Vane, 2003). A ECA possui dois sítios ativos
homólogos, um na região C-terminal e outro na região N-terminal. Recentemente,
demonstrou-se que alguns inibidores da ECA possuem maior seletividade pelo
sítio C-terminal, que é o sítio mais efetivo na hidrólise da BK e na formação de
angiotensina II, enquanto outros inibidores são mais seletivos para o sitio N-
terminal, que segundo evidências experimentais estaria mais envolvido com o
processamento de outros peptídeos bioativos (Cotton et. al., 2002).
No entanto, existem relatos que sugerem que os inibidores da ECA podem
promover vasodilatação através de mecanismo independentes da inibição dessa
enzima (Greene et. al., 1972; Marks et. al., 1980), por exemplo, estudos com o
Captopril mostraram que esse inibidor da ECA é capaz de produzir redução nos
níveis da pressão arterial em animais onde o RAS não é o responsável pela
manutenção da pressão arterial (Marks et. al., 1980).
Além disso, existem estudos que sugerem que os Bj-BPPs possam agir por
vias independentes da ECA, demonstrando que, se correlacionarmos os efeitos
inibitórios da ECA com a potenciação de BK, esses dois mecanismos não serão
suficientes para justificar os efeitos dos Bj-BPPs (Camargo e Ferreira, 1971;
Greene et. al., 1972; Ianzer et. al., 2007).
Entre os métodos clássicos para avaliar a potenciação de BK estão os
testes farmacológicos em órgãos isolados, como o íleo de cobaia ex vivo e in vivo
sobre o efeito hipotensor de BK (Mueller et. al., 2005). Sabe-se que todos os
peptídeos utilizados nesse trabalho são capazes de potenciar BK ex vivo,
(Hayashi e Camargo, 2005), entre esses alguns também já foram testados in vivo
(Hayashi et. al., 2003) e aparentemente os mecanismos utilizados por esses
peptídeos in vivo e ex vivo são distintos.
Embora a causa não esteja totalmente clara, estudos sugerem que a
inibição da ECA não se correlaciona diretamente com o efeito potenciador da BK.
Por exemplo, é sugerido que a fosforilação de receptores B1 pela proteína
quinase C (PKC) promova sua internalização, ou seja, desensibilização, e sua
desfosforilação pela fosfatase SHP-2 o ressensibilize (Ignjatovic et. al., 2002).
Assim, uma das hipóteses seria a de que os Bj-BPPs poderiam ter influência
sensibilizando ou dessensibilizando os receptores de BK (Marcic et. al., 2000), ou
participando da hetero-oligomerização dos receptores B2 de cininas, o que
incluiria a interação com a ECA (Minshall et. al., 1997) e com outras enzimas
responsáveis pela degradação da BK (Deddish et. al., 2002).
Nesse trabalho, além da ação anti-hipertensiva já descrita para os Bj-BPP-
5a, Bj-BPP-9a e Bj-BPP-10c (Ianzer et. al., 2010; Gavras et. al., 1975; Bianchi et.
al., 1973; Ianzer et. al., 2007), demonstramos que os Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b e
Bj-BPP-13a também são capazes de promover esses efeitos na pressão arterial,
embora a amplitude do efeito anti-hipertensivo ocasionado por cada Bj-BPP seja

diferente. Além disso, não podem ser diretamente correlacionados com a
constante de inibição da ECA e a potenciação de BK.
Por exemplo, o Bj-BPP-5a é eficiente na potenciação de BK ex vivo
(Ferreira et. al., 1970; Ondetti et. al., 1971; Murayama et. al., 1997), mas o mesmo
não é observado nos experimentos realizados in vivo (Figura 6A). Além disso,
esse peptídeo não é um bom inibidor da ECA, sendo mais seletivo para o sítio N-
terminal dessa enzima, que não é o mais eficiente na formação de angiotensina II
e na degradação de BK. Entretanto, a administração desse peptídeo a SHRs
acordados promoveu eficientemente a redução da PAM e da FC (Ianzer et. al.,
2010).
O Bj-BPP-11e é um fraco potenciador de BK, tanto ex vivo como in vivo,
não apresenta preferência por nenhum dos sítios ativos da ECA, provoca discreta
redução da PAM. Surpreendentemente, entretanto, ocasiona potente redução da
FC quando comparado ao Bj-BPP-10c. Esses dados sugerem uma ação do
peptídeo em células musculares especializadas no nódulo sino-atrial (marcapasso
do coração), região especial do coração que controla a FC (Somsen et. al., 2004).
Embora, o coração possua seus próprios sistemas intrínsecos de controle e
possa continuar a operar, sem quaisquer influências nervosas, a eficácia da ação
cardíaca pode ser muito modificada pelos impulsos reguladores do sistema
nervoso central. O sistema nervoso central é conectado ao coração através de
dois grupos diferentes de nervos, os sistemas: parassimpático e simpático. A
estimulação dos nervos parassimpáticos causa diminuição da freqüência, dos
batimentos cardíacos, da força de contração do músculo atrial, diminuição na
velocidade de condução dos impulsos através do nódulo átrio-ventricular,
aumentando o período de retardo entre a contração atrial e a ventricular e

diminuição do fluxo sanguíneo através dos vasos coronários que mantém a
nutrição do próprio músculo cardíaco. Todos esses efeitos podem ser resumidos,
dizendo-se que a estimulação parassimpática diminui todas as atividades do
coração. A estimulação dos nervos simpáticos apresenta efeitos exatamente
opostos sobre o coração, como aumento da freqüência cardíaca, aumento da
força de contração e aumento do fluxo sanguíneo através dos vasos sanguíneos
(Velden et. al., 1990; Michelini, 1999).
Dessa maneira, existe também a possibilidade do Bj-BPP-11e ter um efeito
na estimulação do sistema parassimpático e/ou diminuição do simpático para
reduzir a FC que leva a discreta queda da PAM promovida por esse peptídeo.
Tanto o Bj-BPP-12b como o Bj-BPP-13a causam alteração da PAM e FC
de modo semelhante ao Bj-BPP-5a, sendo diferente do tridecapeptideo por
ocasionar uma potente redução da FC, observada principalmente entre 30 e
90min após a injeção do peptídeo. No entanto, ambos apresentam efeito
potenciador da BK ex vivo, mas somente o Bj-BPP-12b potencia in vivo, além do
fato de apresentar seletividade de inibição pelo sitio N-terminal da ECA o que não
ocorre com o Bj BPP-13a que não é um bom inibidor dessa enzima (Tabela 2).
O Bj-BPP-9a potencia BK equivalentemente in vivo e ex vivo, é mais
seletivo para o sítio C-terminal da ECA, sendo considerado um eficiente inibidor
dessa enzima (Cotton et. al., 2002). Entretanto, promove discreta redução da
PAM e não altera a FC, portanto é descartada a hipótese de ação sobre o sistema
nervoso central.
O Bj-BPP-5a, Bj-BPP-10c, Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a, além de
serem encontrados no veneno, também são codificados pelo precursor dos Bj-
BPPs e CNP expresso no cérebro da Bothrops jararaca, sugerindo um papel na

fisiologia da serpente (Hayashi et. al., 2003; Hayashi e Camargo, 2005).
Interessantemente, dentre os peptídeos apresentados, o Bj-BPP-9a é o único que
não está na proteína precursora dos BPPs e CNP do cérebro (Murayama et. al.,
1997; Hayashi et. al., 2003).
Sabe-se que, por exemplo, a fosfolipase A é uma enzima que desempenha
um importante papel na fisiologia da serpente e no envenenamento, sendo
responsável por efeitos nas presas que inclui mamíferos. Como a mesma enzima
está presente no veneno e na fisiologia da serpente, o que determina o seu efeito
tóxico é explicado, entre outras causas, pela quantidade injetada na corrente
sanguínea da vítima. A combinação com outras moléculas pode desencadear
vários efeitos biológicos, tais como neurotoxicidade, cardiotoxicidade,
miotoxicidade, a inibição da agregação plaquetária, edema, hemólise,
anticoagulação, hemorragia, convulsão e hipotensão arterial para imobilização da
presa (Soares et. al., 1998; Kini, 2003).
Recentemente, nosso grupo observou que o Bj-BPP-10c é capaz de
mobilizar [Ca2+]i em neurônios de mamíferos, possivelmente contribuindo para
elevar a produção de NO no sistema nervoso central (Lameu et al., 2010b), com
conseqüente aumento da liberação de neurotransmissores, assim como GABA e
glutamato melhorando a sensibilidade do barorreflexo de ratos espontaneamente
hipertensos (Lameu et. al., 2010a; Lameu et. al., 2010b). Como a sensibilidade do
barorreflexo está prejudicada em patologias relacionadas com o controle da
pressão arterial, como por exemplo, na pré-eclâmpsia (Molino et. al.,1999), esse
peptídeo usado em quantidades adequadas pode ser benéfico para tratar esses
tipos de patologia.
5.2 ASS como alvo para os Bj-BPP-5a, Bj-BPP-10c, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a
A ASS desempenha um papel fundamental no ciclo citrulina-NO, sendo a
enzima passo limitante de reações acopladas para fornecimento de L-arginina
para consumo da NOS (Hao et. al., 2004; Shen et. al., 2005; Corbin et. al., 2008).
Os substratos da ASS são a citrulina, o aspartato e o ATP, dessa forma,
essa enzima conjuga citrulina e aspartato a argininosuccinato. O primeiro passo
da reação é a incorporação do AMP à citrulina com liberação de pirofosfato. Em
seguida, há a troca do AMP pelo aspartato com liberação do AMP. Finalmente,
ocorre a liberação do produto argininosuccinato, que por ação da ASL é
convertido a L-arginina e fumarato (Husson et. al., 2003; Karlberg et. al., 2008).
A ASS humana é uma proteína tetramérica que consiste de dois dímeros
idênticos. A estrutura monomérica dessa enzima possui três domínios: um
domínio de ligação de ATP, um domínio de síntese e um domínio no C-terminal
envolvido na oligomerização de suas subunidades (Karlberg et. al., 2008).
Recentemente, nosso grupo demonstrou que a ASS é alvo do Bj-BPP-10c
e que esse peptídeo é capaz de modular positivamente a atividade catalítica
dessa enzima, aumentando a sua afinidade pelo ATP, provavelmente, devido a
uma mudança conformacional ocasionado por esse peptídeo que facilitaria a
interação da ASS com o ATP (Guerreiro et. al., 2009).
No presente trabalho nós demonstramos que outros Bj-BPPs, como o Bj-
BPP-13a também aumentam a atividade catalítica da ASS, entretanto
apresentando efeitos de menor amplitude. Outros, como o Bj-BPP-5a são até
antagônicos a atividade do Bj-BPP-10c sobre a ASS.
Embora sem apresentar uma curva dose-resposta, o Bj-BPP-5a promove
uma discreta inibição da ASS. Desse modo, poderíamos sugerir esse peptídeo
como um possível candidato para estudos relacionados com patologias onde a
atividade preservada da ASS é nociva, como é o caso de alguns tumores. Há
trabalhos indicando a relação entre a constante reposição de L-arginina gerada
pela ASS e o crescimento de carcinoma hepatocelular, melanoma maligno,
câncer de próstata, renal e ovariano, assim um molécula que modulasse a
atividade catalítica da ASS negativamente poderia ser utilizada no tratamento
dessas patologias (Feun et. al., 2008; Shen et. al., 2006; Delage et. al., 2010).
Entre os demais Bj-BPPs avaliados o Bj-BPP-12b e o Bj-BPP-13a são
capazes de modular positivamente a atividade da ASS, mas no caso do Bj-BPP-
12b esse fato ocorre em concentrações mais altas que o Bj-BPP-10c e o Bj-BPP-
13a. Desse modo, esses dois peptídeos apresentam potencial no tratamento de
patologias onde a atividade dessa enzima está reduzida, como a citrulinemia
(Haberle et. al., 2002; Ezgu et. al., 2005) e quando a modulação positiva da sua
atividade catalítica pode trazer contribuição terapêutica como na hipertensão e na
pré-eclampsia, devido a disponibilização de substrato para consumo da NOS e,
conseqüente, aumento da produção de NO (Shen et. al., 2005; Guerreiro et. al.,
2009).
Os Bj-BPP-9a e Bj-BPP-11e não alteram a atividade da ASS, o que poderia
indicar que essa enzima não é alvo desses peptídeos, ou ainda, que interagem
com a ASS sem modificar sua capacidade enzimática, isso não os descartaria
como possíveis biomarcadores de patologias associadas a ASS.
Sendo assim, esses resultados sugerem que a disponibilização de
substrato para consumo da NOS, L-arginina, deva participar apenas do
mecanismo de ação do Bj-BPP-13a, assim como observado para o Bj-BPP-10c
(Guerreiro et. al., 2009), mas não deve participar do mecanismo de ação do Bj-
BPP-5a, Bj-BPP-9a e Bj-BPP-11e, pois não são ativadores da ASS. No caso do
Bj-BPP-12b, a participação desse mecanismo se torna menos sugestiva, já que
em concentrações muito mais altas que do Bj-BPP-13a apresenta atividade sobre
a ASS, mas nas mesmas doses promovem intensidade de queda da PAM e FC
semelhantes.
5.3 A produção de NO pode não ser o único mecanismo de ação dos Bj-
BPPs para promover vasodilatação
A NOS catalisa a oxidação do grupo guanidino da L-arginina, formando NO
e citrulina (Tarpey e Fridovich, 2001). O NO se difunde rapidamente do endotélio
para a musculatura lisa do vaso promovendo vasodilatação (Solomonson et. al.,
2003).
Devido a ação do Bj-BPP-10c sobre a ASS, sabe-se que esse peptídeo é
capaz de disponibilizar substrato para consumo da NOS, sustentando a produção
de NO (Guerreiro et. al., 2009). Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a aumentarm a atividade
da ASS, entretanto, mostramos que Bj-BPP-5a também induz a produção de NO,
mesmo sendo um inibidor dessa enzima. Para o Bj-BPP-12b não observamos um
aumento da produção de NO pelas células HEK293, nas concentrações utilizadas
já que foram menores que a concentração mínima para aumentar a atividade da
ASS (10 M) que é muito alta, tornando o papel do NO secundário no mecanismo
de ação do Bj-BPP-12b. O Bj-BPP-9a e o Bj-BPP-11e também não provocaram
nenhuma alteração na liberação de NO, todavia esses peptídeos não alteram a
atividade da ASS, sugerindo que o ciclo citrulina-NO não esteja envolvido nos
seus mecanismos de ação.
No entanto, não é só o aumento da atividade da ASS pelos Bj-BPPs que
pode induzir a produção de NO. Sabemos que a estimulação do receptor B2 de

cininas pela BK leva a um aumento da [Ca2+]i. Essa elevação de transientes de
Ca2+ induzida pela BK ativa a NOS para gerar NO (Busse e Fleming, 1995).
Muitos outros receptores quando ativados geram sinais intracelulares para induzir
a produção de NO, entre esses podemos citar os receptores muscarínicos e α2-
adrenérgico, que também estão envolvidos na regulação da pressão arterial.
Os receptores α2-adrenérgicos constituem um grupo de receptores
acoplados a proteína Gi/0 e Gs, que são ativados quando estimulados por
catecolaminas e mais recentemente foi demonstrado que a L-arginina é um
agonista desses receptores (Joshi et. al., 2007). A ativação pré-sináptica desses
receptores diminui a atividade simpática e relaxa os vasos. No endotélio, esses
receptores promovem vasodilatação através da liberação de NO e acúmulo de
GMPc (Vanhoutte, 2001).
Os receptores muscarínicos são membros de uma superfamília de
receptores acoplados à proteína G, associados principalmente a ações
fisiológicas desencadeadas quando ligados a acetilcolina (ACh). As ações
muscarínicas da ACh são mediadas por cinco subtipos de receptores
muscarínicos molecularmente distintos (M1-M5) (Caulfield e Birdsall,1998).
Baseado em sua habilidade de ativar diferentes classes de proteínas G
heterotriméricas, os cinco subtipos de receptores muscarínicos podem ser
subdivididos em duas classes distintas de acordo com suas atividades funcionais:
os mobilizadores intracelulares de cálcio (receptores M1, M3 e M5), que são
acoplados seletivamente às proteínas G da família G q, e os inibidores da
adenilato ciclase (M2 e M4), que demonstram seletividade por proteínas G da
família Gi (Felder, 1995). Diferentes abordagens experimentais demonstram que
os receptores muscarínicos estão presentes em praticamente todos os órgãos,

tecidos e tipos celulares. Os receptores muscarínicos periféricos são
responsáveis pelas ações clássicas da ACh em órgãos ou tecidos inervados por
fibras nervosas parassimpáticas. As principais ações mediadas por esses
receptores muscarínicos periféricos incluem a redução do ritmo cardíaco e
estimulação de secreção glandular e relaxamento da musculatura lisa (Wess,
2004). Os receptores muscarínicos centrais estão envolvidos na regulação de um
número extraordinário de funções cognitivas, comportamentais, sensitivas,
motoras e autônomas. Sinalização reduzida ou aumentada dos diferentes
subtipos de receptores muscarínicos implicam na fisiopatologia de diversas
doenças do sistema nervoso central, incluindo a doença de Alzheimer e
Parkinson,depressão, esquizofrenia e epilepsia (Wess, 2004).
Dessa maneira, utilizamos ferramentas farmacológicas, antagonistas de
receptores e inibidores de enzimas, para estudar a participação dos receptores
muscarínicos, α2-adrenérgico, B2 de cininas e da enzima ASS no mecanismo de
produção de NO induzida pelos BPPs.
Com isso, confirmamos a participação da ASS no mecanismo de ação do
Bj-BPP-13a, mas nossos resultados sugerem fortemente também a participação
de receptor muscarínico do subtipo M3 nos efeitos induzidos por esse peptídeo.
Os receptores muscarínicos do subtipo M3 estão, principalmente
envolvidos no controle do tônus vascular. Há medicamentos no mercado que
ativam esse receptor para promover relaxamento, como é o caso da pilocarpina,
utilizada para o tratamento de glaucoma, hipertensão ocular (Hurvitz et. al., 1991;
Costagliola et. al., 2009)
Observamos também que a produção de NO induzida pelo Bj-BPP-5a não
teve interferência do MDLA conforme esperado. Entretanto, verificamos que a

participação dos receptores de BK e muscarínico do subtipo M1 devem ser
importantes no seu mecanismo de ação. Ianzer e colaboradores, recentemente,
mostraram que o Bj-BPP-5a não age sobre receptores B1 e B2 de cininas (Ianzer
et al., 2010). A participação do receptor de BK no mecanismo de ação de um Bj-
BPP poderia de ser devido ao acumulo de BK pela inibição da ECA, no entanto o
Bj-BPP-5a não é um bom inbidor dessa enzima. Dessa forma, sugerimos o Bj-
BPP-5a promova um “cross-talking” entre os receptores M1 e B2. O mecanismo
de cross-talking deve envolver vários passos e o primeiro deles seria a ação
direta do Bj-BPP-5a sobre o receptor muscarínico do subtipo-M1.
A participação do receptor muscarínico do subtipo-M1 na produção de NO
estimulada pelo Bj-BPP-5a é muito interessante do ponto de vista científico e
terapêutico, já que muitos esforços têm sido aplicados na busca de agonistas
para os receptores muscarínicos do subtipo M1, para o tratamento de desordens
cognitivas, tais como Alzheimer (Fisher et.al., 2003; Caccamo et. al., 2006; Conn
et. al., 2009). A ativação desse subtipo de receptor também tem sido relacionada
com a liberação de EDHF (Eglen, 2006) e com o aumento de expressão da NOS
(Wotta et. al., 1998; Cuadra e El-Fakahany, 1998).
5.4 Os Bj-BPPs encontrados na proteína precursora dos BPPs e do CNP no
cérebro de serpentes são capazes de mobilizar [Ca2+]i
A mobilização da [Ca2+]i. induzida pelo Bj-BPP-10c é instantânea e
transiente, ou seja, imediatamente após a aplicação do peptídeo, o pico de
resposta alcança a [Ca2+]i máxima nas células, e então rapidamente [Ca2+]i
diminuiu e alcança níveis basais, caracterizando uma resposta típica de ativação
de receptores de membrana (Lameu et. al., 2010a). Dessa maneira, investigamos

se os demais Bj-BPPs (Bj-BPP-5a, Bj-BPP-9a, Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-
BPP-13a) eram capazes de mobilizar [Ca2+]i em células HEK293.
Com exceção do Bj-BPP-9a, todos os Bj-BPPs utilizados nesse trabalho
foram capazes de induzir transientes de [Ca2+]i, sugerindo que esses peptídeos
possuem a habilidade de interagir com receptores de membrana.
Nossos resultados permitem indicar os receptores muscarínicos do subtipo
M1 e M3 como os principais candidatos a ser receptor do Bj-BPP-5a e Bj-BPP-
13a, respectivamente, no entanto, a validação desses receptores como alvos dos
Bj-BPPs ainda precisa ser realizada.
Nossos resultados também indicam que o principal mecanismo de ação do
Bj-BPP-9a é a inibição da ECA e potencialização de BK, já que esse peptídeo não
altera a FC, não age sobre a ASS, não estimula a produção de NO e não mobiliza
[Ca2+]i pelo menos em células HEK293. Entretanto, não podemos descartar a
possibilidade desse peptídeo interagir com receptores tecido-específicos não
expressos nas células HEK293, ou interferir em mecanismos bioquímicos que não
foram observados nesse ou em trabalhos anteriores.
Conforme discutido anteriormente, apenas o Bj-BPP-5a e o Bj-BPP-13a
estimulam a produção de NO em células HEK293. Embora o Bj-BPP-5a iniba
discretamente a ASS, esse efeito não compromete a produção de NO induzida
por esse peptídeo, provavelmente a produção de NO ocorra devido a ativação da
NOS pelo aumento nos níveis de [Ca2+]i provocado por esse peptídeo.
O Bj-BPP-13a além de disponibilizar substrato para consumo dessa enzima
pela modulação da atividade da ASS deve contribuir com a ativação da NOS
através da mobilização da [Ca2+]i, possivelmente através receptores M3.

Entretanto o Bj-BPP-11e e o Bj-BPP-12b não estimulam a produção de NO,
mas os ensaios de mobilização de [Ca2+]i sugerem que esses peptídeos sejam
agonistas de um receptor de membrana, envolvido com a liberação de EDHF ou
com outras funções, assim como controle da expressão gênica e ativação de
enzimas diferentes da NOS (Finkbeiner e Greenberg, 1997).
É relevante citar que a mobilização [Ca2+]i, desempenha papel fundamental
na liberação de neurotransmissores (Putney, 1999), assim como o GABA, que
está relacionado com controle das funções cardiovasculares pelo sistema nervoso
central (Gordon e Sved, 2002). Conforme já descrito, o Bj-BPP-10c é capaz de
estimular a liberação desse neurotransmissor, regulando a sensibilidade do
barorreflexo de ratos espontaneamente hipertensos (Lameu et. al., 2010a; Lameu
et. al., 2010b).
Sendo assim, não poderíamos descartar a possibilidade dos Bj-BPP-5a, Bj-
BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a atuarem no sistema nervoso central, já que
além de diminuírem a freqüência cardíaca como Bj-BPP-10c, também estão
presentes no cérebro da serpente.
Tomando em conjunto os resultados de comparação das ações biológicas
dos Bj-BPPs encontrados no veneno da Bj e no sistema nervoso central dessa
serpente como parte do precursor do hormônio CNP, verificamos que,
contrariamente ao que por várias décadas se supunha, esses peptídeos tem
efeitos biológicos diferenciados e por isso mesmo são uma fonte inesgotável de
surpresas como sinalizadores biológicos, potencialmente úteis para o
desenvolvimento de fármacos.
6.CONCLUSÕES
6. Conclusões
Os Bj-BPPs foram os primeiros inibidores naturais da ECA descritos,
bloqueiam a conversão de angiotensina I em angiotensina II (potente
vasoconstritor) e a degradação da bradicinina (potente vasodilatador). Devido
essa habilidade eles serviram como modelo estrutural para o desenvolvimento do
Captopril, que desde os anos 80 tem sido utilizado por via oral para o tratamento
da hipertensão arterial sistêmica humana (Ondetti e Cushman, 1981). Além disso,
sabe-se que dentre esses peptídeos, alguns apresentam atividade anti-
hipertensiva, o que é o caso do Bj-BPP-5a, Bj-BPP-7a e Bj-BPP-10c (Ianzer et.
al., 2007; Ianzer et. al., submitted).
Os resultados apresentados nesse trabalho fornecem informações
importantes a respeito das respostas desencadeadas pelos Bj-BPP-5a, Bj-BPP-
9a, Bj-BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a na a potenciação de BK, na ativação
da ASS, na indução da produção de NO e na mobilização [Ca2+]i e confirma que
todos os peptídeos possuem atividade anti-hipertensiva em SHRs:
1) foi observado que todos os peptídeos que são expressos na proteína
precursora dos Bj-BPPs e do CNP no cérebro da Bothrops jararaca reduzem a FC
de SHRs, o Bj-BPP-9a que é encontrado apenas no veneno não produziu o
mesmo efeito sobre a FC. Por isso, as ações do Bj-BPP-5a, Bj-BPP-11e, Bj-BPP-
12b e Bj-BPP-13a podem estar associadas ao fato de serem encontrados em
regiões do cérebro de serpentes correlacionados com o controle neuroendócrino,
indicando que podem agir no sistema nervoso central, como já foi visto para o Bj-
BPP-10c (Lameu et. al., 2010a);
2) foi demonstrado que o mecanismo pelo qual o BPP-5a induz a
produção de NO deve envolver ambos, receptor B2 de cininas e receptor

muscarínico do subtipo M1, sem qualquer participação da ASS, mobilizando
[Ca2+]i para ativação da NOS, além de ser um potente potenciador de BK ex vivo,
apesar de não ser um excelente inibidor da ECA (Cotton et. al., 2002; Hayashi et.
al., 2003; Gomes et. al., 2007);
3) o Bj-BPP-9a não apresentou nenhum efeito sobre os alvos ou
mecanismos avaliados. Provavelmente, tenha como principal alvo de ação a ECA,
pois é um potente inibidor dessa enzima com maior seletividade pelo sítio C-
terminal (Cotton et. al., 2002), o que explicaria seu efeito anti-hipertensivo e de
potenciação de BK;
4) Os mecanismos de ação do Bj-BPP-11e Bj-BPP-12b foram os
menos esclarecidos nesse trabalho, já que esses peptídeos foram capazes de
mobilizar [Ca2+]i, mas ainda não temos nenhuma sugestão do receptor envolvido
nessa resposta. O Bj-BPP-11e é um fraco potenciador de BK, nem está entre os
melhores inibidores da ECA. O Bj-BPP-12b é potente potenciador de BK in vivo e
ex vivo, mas é mais seletivo para o sítio no N-terminal. Além disso, apesar de
modular positivamente a ASS em altas concentrações, o Bj-BPP-12b não deve ter
como principal mecanismo de ação a indução da produção de NO;
5) O Bj-BPP-13a induz a produção de NO através de um mecanismo
que envolve a ativação do receptor muscarínico do subtipo M3, mobilizando
[Ca2+]i para ativação da NOS e disponibilizando substrato para consumo dessa
enzima por modulação da atividade da ASS. Esse peptídeo apresenta efeitos
semelhantes de potenciação da BK tanto in vivo e como ex vivo e não apresenta
seletividade por nenhum dos sítios ECA;
Sendo assim, esse trabalho demonstra que o Bj-BPP-5a, Bj-BPP-9a, Bj-
BPP-11e, Bj-BPP-12b e Bj-BPP-13a apresentam atividade anti-hipertensiva e

confirma que possuem diferentes mecanismos de ação, ocasionando diferentes
efeitos na potenciação de BK, na ativação da ASS, indução na produção de NO e
na mobilização [Ca2+]i (Tabela 6).

Tabela 6 - Atividade biológica dos Bj-BPPs II. Efeito dos BPPs na potenciação da resposta contrátil em musculatura lisa (ex vivo) e na resposta
hipotensiva da BK (in vivo), na pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) de SHRs acordados, na atividade da ASS, na produção de NO e
2+
na mobilização de [Ca ]i em células HEK293. Os dados são expressos pela média ± erro padrão.
Potenciação Potenciação Mobilização

ECA Ki (nM) Redução Redução Ação Indução da
Sequência de da BK ex Máxima da de [Ca2+]i
Bj-BPP Origem Máxima da Máxima da sobre a produção
aminoácidos vivo BK in vivo Valores de
PAM (mmHg) FC (bpm) ASS de NO
(nmol) (%) Sítio-N Sítio-C pD2
a
Veneno
Bj-BPP-5a <EKWAP 0,36±0,03 b 48 ± 5 g 400b 1280b - 30 ± 5*f - 66 ± 9* f Inibiçãoj Simj 7,93±0,12 j
Cérebrob
Bj-BPP-9a <EWPRPQIPP Venenoa 0,22± c 114 ± 31j 100b 1b -22 ± 3*j -40 ± 15 j Nulaj Nãoj Nãoj
Venenoa
Bj-BPP-10c <ENWPHPQIPP 0,48±0,02 e 132 ± 22j 200b 0,5b - 53 ± 6*e - 67 ± 10* e Ativação h Sim h 7,23±0,09 i
b
Cérebro
Bj-BPP-11e <EARPPHPPIPP Cérebrob 2,68±0,20 b 48 ± 10j 100b 300b - 26 ± 3*j -61 ± 9*j Nulaj Nãoj 7,15±0,11 j
Bj-BPP-12b <EWGRPPGPPIPP Cérebrob 0,83±0,30 b 109 ± 17j 5b 150b - 25 ± 2*j -54 ± 9*j Ativaçãoj Nãoj 8,63±0,15j
Venenod
Bj-BPP-13a <EGGWPRPGPEIPP 1,50±0,20 b 62 ± 15j 50b 50b - 27 ± 2*j -67 ± 10*j Ativaçãoj Simj 7,82±0,17j
b
Cérebro
*p<0,05 quando comparado ao grupo controle.

a
Ferreira et al.1970
b
Hayashi et al.2003
c
Ianzer, 2001
d
Ianzer et al.2004
e
Ianzer et al.2007
f
Ianzer et. al. submitted
g
Gomes et al., 2007
h
Guerreiro et. al., 2009
i
Lameu et al., 2010
j
presente trabalho
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8.ANEXOS

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KÁTIA LUCIANO PEREIRA MORAIS

A diversidade estrutural de peptídeos potenciadores da

Dissertação apresentada à Universidade

A diversidade estrutural de peptídeos potenciadores da

Dissertação apresentada à Universidade

Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Martins de Camargo

Co-orientadora: Dra. Claudiana Lameu

Especial de Toxinologia Aplicada (CAT-

CEPID) do Instituto Butantan, durante o

curso de Pós-Graduação em Biologia

Molecular e apresentada à Universidade

Federal de São Paulo como requisito

para obtenção do título de Mestre em

Apoio Financeiro: CNPQ / FAPESP

amor e apoio, pelas palavras de animo, pela

paciência, pela companhia e por tudo o que ele

faz por mim.

que sempre acreditaram em mim.

em minha vida durante essa etapa, o meu

coração transborda de alegria e gratidão a esse

Ao Prof. Dr. Antonio Carlos de Martins de Camargo pela oportunidade,

Figura 2 – Representação esquemática das funções da ASS em mamíferos. .............................. 32

Figura 3 – Vasodilatação promovida pelo NO devido ao relaxamento da musculatura lisa do vaso

Figura 4 – Representação esquemática da transdução de sinal induzida pelo Bj-BPP-10c. ........ 45

Figura 5 – Representação esquemática da reação catalisada pela ASS. ...................................... 59

Figura 7 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

Figura 8 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

Figura 9 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

Figura 10 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

Figura 11 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

Figura 12 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

Figura 13 – Alterações nos parâmetros cardiovasculares de SHR durante 6 horas após a

Figura 14 – Perfil eletroforético em gel de agarose mostrando fragmentos de DNA. .................... 77

Figura 15 – Perfil eletroforético da ASS recombinante humana em gel 10% de SDS-poliacrilamida.

Figura 17 – Caracterização da atividade enzimática da ASS recombinante utilizando o método de

Figura 18 – Efeito do MDLA na atividade enzimática da ASS recombinante. ................................ 81

Figura 19 – Efeito de concentrações crescentes dos Bj-BPPs sobre a atividade enzimática de 1 g

Figura 20 – Produção de NO por células HEK293 estimuladas com concentrações crescentes

Figura 21 – Intermediação dos receptores B2 de cininas e muscarínico do subtipo M1 na

Figura 22 – Intermediação da ASS e do receptor muscarínico do subtipo M1 na produção de NO

Figura 23 – Interferência dos inibidores na resposta de agonistas de receptores 2-adrenérgico,

Tabela 1 - Peptídeos Potenciadores da Bradicinina (“Bradykinin Potentiating Peptides” - Bj-BPPs)

Tabela 2 - Atividade biológica dos Bj-BPPs I. ................................................................................. 29

Tabela 3 - Ensaios in vivo de alguns Bj-BPPs encontrados no cérebro e veneno da Bothrops

Tabela 4 - Confirmação da identidade da ASS recombinante por espectrometria de massas. .... 79

Tabela 5 - Validação da atividade enzimática da ASS recombinante. ........................................... 82

Tabela 6 - Atividade biológica dos Bj-BPPs II.. ............................................................................. 110

4-DAMP 4-Diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide

AMP adenosina mono-fosfato

ASL argininosuccinato liase

ASS argininosuccinato sintase

ATP adenosina tri-fosfato

BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato

BPF fatores potenciadores da bradicinina

BPPs peptídeos potenciadores da bradicinina

BSA albumina sérica bovina

[Ca2+]i concentração de Ca2+ intracelular

CAT1 transportador de aminoácidos catiônico 1

CIRC liberação de cálcio mediada por cálcio

CNP peptídeo natriurético do tipo-C

cGMP monofosfato de guanosina cíclica

DMEN dulbecco’s modified eagle medium

ECA enzima conversora de angiotensina