UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS

ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO

METANÓLICO DE Schinus terebinthifolius Raddi, DO
METIL GALATO E DE DERIVADOS CARBOHIDRAZIL
EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO EXPERIMENTAL

EDNA KIYOMI KASSUYA IRIGUCHI

DOURADOS MS
2012
 EDNA KIYOMI KASSUYA IRIGUCHI

ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO

METANÓLICO DE Schinus terebinthifolius Raddi, DO METIL
GALATO E DE DERIVADOS CARBOHIDRAZIL EM MODELOS
DE INFLAMAÇÃO EXPERIMENTAL

Dissertação apresentada à Universidade

Federal da Grande Dourados –
Faculdade de Ciências da Saúde, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Cândida

Aparecida Leite Kassuya
Co-orientador: Prof. Dr. Arquimedes
Gasparotto Júnior

DOURADOS MS
2012
 Agradecimentos

Agradeço a Deus pela força e presença em todos os momentos, por me conceder

serenidade e por tornar tudo possível colocando pessoas maravilhosas no meu
convívio.

Aos meus pais Yoshio (in memorian) e Ivako, pela minha vida e pelos
conhecimentos passados.

Aos meus irmãos que sempre me apoiaram principalmente ao Roberto que me

incentivou e sempre torceu por mim.

A minha família, que foi capaz de aceitar a minha ausência.

A Universidade Federal da Grande Dourados, pela oportunidade de fazer o mestrado.

Agradeço de forma especial, a minha orientadora Profa. Cândida Leite Aparecida

Kassuya, pela confiança, paciência, amizade e por entender os meus limites e
dificuldades.

Ao meu co-orientador Prof. Arquimedes Gasparotto Júnior e participantes da banca,

por participar da concretização de mais uma etapa da minha formação profissional.

A Profa. Anelise Samara Nazari Formagio, pelo profissionalismo e competência na

realização do projeto.

A Profa. Arielle Cristina Arena pela ajuda com os materiais e nos procedimentos
experimentais realizados.

Aos professores, funcionários e colegas do Curso de Pós Graduação em Ciências da

Saúde.

Ao Magaiver Andrade Silva, meu “irmãozinho” querido, um grande amigo que

esteve sempre presente nos momentos que eu precisei, de aflições e alegrias. Sou
muito grata a você.

Ao Antônio da Silva Novaes pela amizade e apoio durantes as dificuldades.

Aos técnicos em geral, principalmente a Alexsandra e Anália que foram essenciais na

realização da minha pesquisa.

As alunas Isabella e Thaisa, pela valiosa contribuição na realização dos

experimentos, por estar sempre dispostas a ajudar.

A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização deste trabalho.

iii
 Dedicatória

Dedico essa conquista para a minha família, estrutura fundamental de apoio e amor,
compartilhando comigo as alegrias e tristezas, incentivando-me a prosseguir.
Dedico a você Hiroshi, meu companheiro e dedicado marido que soube se doar em
silêncio na minha ausência na criação de nossos filhos. Sei que não foi fácil, mas por
confiar totalmente em você, entreguei essa responsabilidade.
Dedico a vocês, meus filhos Leandro Eiki e Giovanna Ayane, que são a minha
alegria, o tesouro da minha vida. Agradeço por serem crianças maravilhosas e ter a
oportunidade de ser a mãe de vocês.

Obrigada, família querida!

iv
 Sumário

Agradecimentos .............................................................................................................iii
Dedicatória ....................................................................................................................iv
Listas de figuras ............................................................................................................vii
Listas de abreviaturas e símbolos ................................................................................viii
Resumo ...........................................................................................................................xi
Abstract..........................................................................................................................xii
1 INTRODUÇÃO ..........................................................................................................01
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................03
2.1 Aspectos gerais ........................................................................................................03
2.1.1 Família Anacardiaceae ..............................................................................03
2.1.2 Gênero Schinus ..........................................................................................03
2.1.3 Schinus terebinthifolius ..............................................................................03
2.2 Aspectos fitoquímicos .............................................................................................05
2.2.1 Taninos/Polifenóis .....................................................................................05
2.2.2 Ácido gálico e derivados naturais ou sintéticos ........................................06
2.2.3 Derivados de Carbohidrazida....................................................................07
2.3 Propriedades farmacológicas .................................................................................09
2.4 Inflamação ...............................................................................................................10
2.4.1 Alterações vasculares e celulares do processo inflamatório .....................10
2.4.2 Indutores e resolução da inflamação .........................................................12
2.4.3 Mediadores do processo inflamatório .......................................................13
2.4.3.1 Aminas vasoativas (histamina e serotonina) ..................................13
2.4.3.2 Eicosanóides: prostaglandinas, leucotrienos e lipoxinas ................14
2.4.3.3 Citocinas e Quimiocinas ...................................................................16
2.5 Medicamentos anti-inflamatórios ..........................................................................18
3 OBJETIVO .................................................................................................................21
3.1 Objetivo geral ...............................................................................................21
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................21

v
4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................22
5 ANEXOS .....................................................................................................................31

vi
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Foto de Schinus terebinthifolius.....................................................................04

Figura 2: Foto de folhas e frutos de Schinus terebinthifolius ........................................05

Figura 3: Estrutura do núcleo fundamental dos derivados 3,4,5- triidroxifenil ............08

vii
 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AA – ácido araquidônico

AAS - ácido acetilsalicílico

AINE – anti-inflamatório não esteroidal

AIE – anti-inflamatório esteroidal

ANOVA – análise de variância

AP-1 – proteína ativadora 1

CAMs – moléculas de adesão celular

Cg – carragenina

CHCl3 – clorofórmio

13
CNMR - ressonância magnética nuclear de carbono

COX – ciclooxigenase

ECM – matriz extracelular

ERO – espécies reativas de oxigênio

GCs - glicocorticóides

GR – receptor de glicocorticóide

1
HNMR - ressonância magnética nuclear de hidrogênio

ICAM-1 – molécula de adesão intercelular - 1

IkB – inibidor de kappa B

IkK – inibidor kappa B quinase

i.p. – intraperitoneal

viii
i.pl. - intraplantar

IL – interleucina

LOX - lipooxigenase

LT – leucotrienos

LTB4 – leucotrieno B4

LTC4 – leucotrieno C4

LTD4 – leucotrieno D4

LTE4 – leucotrieno E4

mDO – mili densidade óptica

MeOH – metanol

mg/kg – miligramas por quilograma

mmol - milimol

MPO – mieloperoxidase

NF-kB – fator nuclear kappa B

nm – nanômetro

v.o. – via oral

PBS – tampão fosfato salina

PECAM-1 – molécula de adesão plaqueta/endotélio

PG – prostaglandinas

PGD2 – prostaglandina D2

ix
PGE2 – prostaglandina E2

PGF2 – prostaglandina F2

PGG2 – prostaglandina G2

PGH2 – prostaglandina H2

PGHS – prostaglandina endoperóxido sintase

PGI2 – prostaciclina

PLA2 – fosfolipase A2

PMN – polimorfonucleares

RNA – ácido ribonucléico

s.c. – subcutânea

TLC - layer chromatography TLC

TNF-α – fator de necrose tumoral –alfa

TX – tromboxanos

TXA2 – tromboxano A2

TXA4 – tromboxano A4

TXB2 – tromboxano B2

µm – micrômetro

μg/paw – microgramas/pata

VCAM-1 – molécula de adesão celular vascular – 1

x
 Resumo

Inflamação é a resposta induzida por estímulos nocivos, com o objetivo principal de

garantir a manutenção da homeostase e reparação à lesão tecidual. O metil galato é
um importante componente encontrado em várias plantas medicinais, especialmente
em Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae), uma planta popularmente usada
em doenças inflamatórias. No presente estudo, foram utilizados camundongos
(n=5/grupo), para avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato metanólico e do metil
galato (composto 2) obtidos de Schinus terebinthifolius (EMST). Uma série de
derivados de 3,4,5-triidroxifenil com uma porção substituída de carbohidrazidas
foram sintetizadas e quimicamente identificadas como radical carboidrazil ou 3,4,5-
triidroxifenil-carboidrazida, 3,4,5-triidroxifenil-N’-(4-metoxibenzilidene)-1-
carbohidrazida, 3,4,5-triidroxifenil-N’-(4-N-dimetilaminobenzidene)-1-
carbohidrazida, 3,4,5-triidroxifenil-N’-(4-nitrobenzilidene)-carbohidrazida, 3,4,5-
triidroxifenil-N’-(benzilidene)- carbohidrazida e avaliados quanto a sua atividade
anti-inflamatória. A administração oral do EMST (100 e 300 mg/kg), do composto 2
(100 e 300mg/kg), dos compostos 3,4,5,e 6 (100 mg/kg), mas não do composto 7
(100 mg/kg), inibiram significativamente o edema induzido por carragenina na pata
dos camundongos. Entretanto somente o composto 4 (100 mg/kg) inibiu a atividade
da mieloperoxidase (MPO) induzida por carragenina (Cg). Quando foi aplicado
localmente, o composto 2 (10 e 100 µg/pata), compostos 4, 5 e 6 (10 µg/pata)
inibiram o edema induzido por carragenina e compostos 3, 4 e 6 (10 µg/pata)
reduziram a atividade da MPO. Para avaliar se os derivados do metil galato
apresentavam os efeitos anti-inflamatórios em outro modelo de inflamação
experimental, os compostos 3 e 4 foram testados no modelo de pleurisia, induzindo
inibição em parâmetros de migração de leucócitos e extravazamento de proteínas. As
observações experimentais da atividade anti-inflamatória do extrato de S.
terebinthifolius e metil galato guiaram o desenvolvimento de novos derivados de
metil galato que apresentaram atividades anti-inflamatórias.

Palavras-chave: Schinus terebinthifolius, Anacardiaceae, camundongos, inflamação,

metil galato, carbohidrazida

xi
 Abstract
Inflammation is response induced by noxious stimuli, with the main objective to
provide maintenance of homeostasis and repairs the tissue injury. The methyl gallate
is an important component found in several medicinal plants especially in Schinus
terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae) a plant popularly used against inflammatory
diseases. In the present study, we used mice (n=5/group) to assess the anti-
inflammatory effect of methanolic extract (MEST) and methyl gallate (compound 2)
obtained from S. terebinthifolius. A series of 3,4,5-trihydroxyfenyl derivatives
bearing a substituted carbohydrazide moiety were synthesized and chemically
identified as radical carbohydrazide or 3,4,5-trihydroxyfenyl- carbohydrazide
(compound 2), 3,4,5-trihydroxyfenyl-N’-(4-methoxybenzylidene)-1-carbohydrazide
(compound 4) , 3,4,5-tri-hydroxyfenyl-N’-(4-N-dimethylaminobenzylidene)-1-
carbohydrazide (compound 5), 3,4,5-tri-hydroxyfenyl-N’-(4-nitrobenzylidene)-
carbohydrazide (compound 6), 3,4,5-tri-hydroxyfenyl-N’-(benzylidene)-
carbohydrazide (compound 7) were evaluated for their anti-inflammatory activity.
The oral administration of MEST (100 and 300 mg/kg), compound 2 (100 and 300
mg/kg), compound 3, 4, 5 and 6 (100 mg/kg), but not compound 7 (100 mg/kg),
inhibited significantly the carrageenan-induced oedema in mice paw. Therefore,
only compound 4 (100 mg/kg), reduced the carrageenan-increased of
myeloperoxidase activity. When local application occur, compound 2 (10-100
g/paw), 4, 5, and 6 (all at 10 g/paw) inhibited the carrageenan-induced oedema
and 3, 4, and 6 (10 g/paw) decrease the MPO activity. To investigate if methyl
gallate derivatives induced anti-inflammatory effects in another model of
experimental inflammation, compound 3 and 4 were tested in pleurisy model
inducing inhibition of inflammatory parameters like leukocyte migration and protein
extravazation. The experimental observations from anti-inflammatory activities of S.
terebinthifolius extracts and methyl gallate have been guiding for the development of
new methyl gallate derivatives that possess anti-inflammatory activities.

Key-words: Schinus terebinthifolius, Anacardiaceae, mice, inflammation, methyl

gallate, carbohydrazide
xii
 1

1 INTRODUÇÃO

As plantas medicinais são uma importante fonte para descoberta de novos fármacos
e desempenham um papel fundamental no tratamento de doenças e têm sido empregadas
com sucesso terapêutico por meio da história da humanidade [1-2]. A utilização de plantas
medicinais corresponde a uma das formas mais antigas empregadas pelo homem no
tratamento de vários tipos de enfermidades, objetivando a cura bem como a prevenção dos
mesmos [3].
Estima-se que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica atual foram
desenvolvidos a partir de produtos naturais: 25% de plantas, 13% de microrganismos e 3%
de animais [4]. Demonstrando assim que as plantas medicinais desempenham um papel
importante para o desenvolvimento de novos medicamentos principalmente por fornecer
moléculas com estrutura química inédita. Entre 1950-1970, aproximadamente 100 plantas
foram utilizadas como base para desenvolvimento e descoberta de novas drogas
introduzidas no mercado como a reserpina, vinblastina e vincristina. Entre 1971-1990
drogas como a artemisinina e ginkgolide foram desenvolvidas para o tratamento da malária
[5].
Como exemplos clássicos de utilização de moléculas obtidas de plantas medicinais
temos: i) a reserpina isolada da Rauwolfia serpentina utilizado para o tratamento da
hipertensão arterial [6]; ii) a vinblastina e a vincristina obtidas de Catharanthus roseus,
medicamentos utilizados no tratamento da leucemia aguda e doença de Hodgkin [7]; iii) a
artemisinina utilizado no tratamento da malária é derivado da planta Artemisia annua [8-
9].
No Brasil, o mercado de fitoterápicos representa 6,7% das vendas de
medicamentos, movimentando em torno de quatrocentos milhões de dólares por ano [10].
Em relação a esses fitoterápicos, destaca-se o fato do extrato de Ginkgo biloba ser utilizado
para tratar os sintomas da fase inicial da Doença de Alzheimer e demência vascular [11].
Dentre outros exemplos de medicamentos oriundos de plantas cita-se a digoxina extraído
da Digitalis sp que é utilizada no tratamento de insuficiência cardíaca [12]; a quinina
utilizada no tratamento da malária [13] e a quinidina indicada como um potente agente
antiarrítmico, na terapia cardiovascular [14] ambos derivados de Cinchona sp [15]; a
morfina, utilizada como potente analgésico; a codeína como antitussígeno, e a papaverina
usada como vasodilatador derivados de Papaver somniferum [16].
 2

Muitos produtos naturais podem ser encontrados no Brasil, haja vista estar nesse
país a maior biodiversidade do planeta, com uma variedade de animais e plantas com
moléculas bioativas em potencial para o desenvolvimento e exploração biotecnológica
[17]. Ainda é um desafio para a indústria química farmacêutica desenvolver agentes mais
eficazes e com menor toxicidade para tratar os sinais e sintomas da inflamação aguda, bem
como para minimizar as consequências a longo prazo de doenças derivados do processo da
inflamação crônica [18].
Atualmente as plantas medicinais são utilizadas como fonte direta de agentes
terapêuticos, como modelos para novos compostos sintéticos, ou como um marcador
taxonômico para a descoberta de novos compostos, servindo como base de matéria-prima
para a elaboração de mais semi-sintéticos compostos químicos [19].
Dentro dessa biodiversidade encontramos a planta Schinus terenbinthifolius Raddi,
da família Anacardiaceae conhecida popularmente como aroeira, aroeira-vermelha e
aroeira-pimenteira. Essa planta é nativa da América do Sul e Central e é utilizada para o
tratamento de inflamações [20]. Atualmente a indústria farmacêutica pesquisa e
desenvolve medicamentos a partir de substâncias extraídas de S. terebinthifolius Raddi.
Exemplo disso é o fitoterápico “Kronel”, um antimicrobiano com ação cicatrizante e anti-
inflamatória para uso ginecológico, produzido pelo laboratório Pernambucano Hebron que
lançou o produto no mercado nacional [21].
A síntese de análogos a partir de princípios ativos isolados de produtos vegetais tem
contribuído para a obtenção de novos agentes terapêuticos. Ao isolar-se uma substância
química biologicamente ativa pode-se promover modificações moleculares em sua
estrutura com a finalidade de otimizar tal atividade, incorporando novos grupamentos, ou
até mesmo, simplificando a molécula. Como consequência, estas ações podem modificar a
potência, a duração e, também, a natureza do efeito farmacológico. A introdução de
substituintes, por exemplo, pode alterar diversas propriedades físico-químicas de uma
molécula como hidrofobicidade, conformação estrutural e consequentemente as suas
propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas; além de elucidar a importância desses
substituintes na sua atividade biológica [22].
Neste trabalho demonstramos a influência da introdução de diferentes substituintes
na molécula do metil galato, isolado do extrato de S. terebinthifolius, frente à sua atividade
anti-inflamatória em modelo animal.
 3

2 Revisão da literatura
2.1 Aspectos gerais

2.1.1 Família Anacardiaceae

Schinus terebinthifolius Raddi pertence à família Anacardiaceae. Essa família

apresenta cerca de 76 gêneros e 600 espécies [23], nas quais 15 gêneros e cerca de 70
espécies ocorrem no Brasil. Algumas plantas do mesmo gênero apresentam importância na
alimentação como a castanha-de-caju (Anacardium occidentale), a manga (Mangifera
indica), os cajás (Spondias spp), o umbu (Spondias tuberosa) e a seriguela (Spondias
purpurea) entre outros [24]. Outro gênero da família Anacardiaceae, o Rhus a maior da
família, com cerca de 200 espécies e estudos fitoquímicos têm demonstrado que as
espécies deste gênero são ricas em flavonóides, apresentando atividade antimalárica,
antiviral e citotóxica [23].

2.1.2 Gênero Schinus

O gênero Schinus apresenta 24 espécies [25]. Foi descrito pelo sueco naturalista
Carolus Linnaeous em 1753 quando estabeleceu o gênero Schinus L., derivado de
“aroeira”, nome latino dado para a árvore Mastic (Pistacia lentiscus L.) também da mesma
família. S. terebinthifolius Raddi foi descrita pela primeira vez em 1820 pelo italiano
Giuseppe Raddi (1770-1829). O nome terebinthifolius é derivado de “terebinthus”, nome
em latim para a árvore Terebinto (Pistacia terebinthus L.) e “folium” de folhas em
referências as folhas resinosas da espécie [26].

2.1.3 Schinus terebinthifolius Raddi

Schinus terebinthifolius é uma árvore de porte médio, entre 5-10 metros de altura, o
tronco com 30-60 cm de diâmetro, revestido de casca grossa. As folhas são compostas de 3
a 10 pares de folíolos aromáticos, medindo de 3 a 5 cm de comprimento por 2 a 3 cm de
largura (Figura 1). Os frutos são do tipo drupa, corpo globuloso ou ovóide, com cerca de 5
cm de diâmetro, aromático, adocicado, de cor vermelha e lustrosa [27]. As flores são
amarelas pálidas, pequenas e dispostas em cachos piramidais [28].
 4

A espécie S. terebinthifolius é uma árvore da América do Sul e Central [29],

conhecida como aroeira-vermelha, aroeira-pimenteira e pimenta vermelha [30] entre
outros. Como os frutos possuem a aparência de uma pimenta de coloração rosa-
avermelhada é chamado também de pimenta rosa, “pink-pepper” (Figura 2). É comum ser
encontrado entre rios e lagos e em formações florestais úmidas, mas pode crescer em
qualquer tipo de solo [31], apresentando uma ampla distribuição geográfica [30]. Seus
frutos são utilizados como condimento alimentar na cozinha nacional e internacional [32].
Outros nomes populares da S. terebinthifolius são citados como aguaraíba, aroeira,
aroeira-branca, aroeira-do-brejo, aroeira-do-campo, aroeira-mansa, aroeira-negra, aroeira-
vermelha, bálsamo, cabuí, coração-de-bugre, corneíba, fruto-de-raposa, fruto-de-sabiá,
entre outros. Algumas sinonímias são Sacortheca bahiensis Turcz., S. mellisii Engl., S.
mucronulata Mart., S. terebinthifolia Var. damaziana Beauverd, S. terebinthifolia var.
raddiana Engl. [27].

Figura 1 – Foto de Schinus terebinthifolius Raddi. FONTE: Horto de Plantas Medicinais,

Maria do Carmo Veira, agosto de 2011.
 5

Figura 2 - Foto de folhas e frutos de Schinus terebinthifolius. FONTE: Horto de Plantas

Medicinais, Maria do Carmo Veira, agosto de 2011.

2.2. Aspectos fitoquímicos

O perfil fitoquímico de S. terebinthifolius se caracteriza pela presença de derivados

do ácido gálico, taninos, terpenos, flavonóides e saponinas. Dentre estes componentes
acredita-se que as propriedades bioativos e em especial a antioxidante deve ser atribuída
aos flavonóides [33-34]. No entanto a presença de taninos lhe confere a ação cicatrizante
[35].
As atividades farmacológicas dos taninos, para tratar feridas, queimaduras e
inflamações, podem ser explicadas por sua capacidade de precipitar as proteínas das
células superficiais das mucosas e tecidos, formando uma capa protetora (complexo tanino-
proteína e/ou polissacarídeo) sobre a pele ou local afetado, impedindo assim, o
desenvolvimento de microrganismos [36].
A análise do óleo essencial extraído do fruto maduro demonstrou a presença de 18
compostos identificados com predominância de monoterpenos, sendo β-pineno o
constituinte majoritário (22,56%) . Já são verificadas nos frutos secos quantidades elevadas
de limoneno (23,80%) [37]. Outro estudo do óleo essencial de frutos de S. terebinthifolius,
α-pineno foi o composto majoritário (29,39%), seguido pelo limoneno (18,15%) [37].

2.2.1 Taninos/Polifenóis
 6

Taninos são compostos fenólicos solúveis em água que tem a propriedade de

precipitar alcalóides, gelatinas e outras proteínas. São classificados em taninos
hidrolisáveis e taninos condensados [39]. Os taninos hidrolisáveis por hidrólise ácida
liberam ácidos fenólicos tais como ácido gálico, caféico, elágico e glicose [40]. Os taninos
condensados são mais complexos, são polímeros dos flavonóides [40] formados por
unidades de catequinas e estão presentes em maior quantidade nos alimentos [41].
Algumas pesquisas relatam a atividade biológica dos taninos para o tratamento de
diarréias, hipertensão, feridas, queimaduras, problemas renais, gástricos e inflamatórios
[36].

2.2.2 Ácido gálico e derivados naturais ou sintéticos

O ácido gálico (3,4,5-triidroxibenzóico) é um composto que consiste em uma

estrutura fenólica tri-hidroxilada e encontra aplicações em vários campos. Pode ser
produzido por hidrólise de ácido tânico ou pela enzima tanino acil hidrolase conhecida
como tanase. Sua principal aplicação é para a fabricação de um agente antibacteriano,
utilizado com sulfonamida [42-46]. É amplamente utilizado em curtumes, corantes de tinta
e na fabricação de papel [47].
Um grande número de plantas são fontes ricas de ácido gálico. O ácido gálico puro
é um pó cristalino e incolor, existe em duas formas, como molécula livre e como parte de
taninos. Está presente no chá, vinho tinto, frutas, bebidas e várias plantas medicinais [48-
49].
O ácido gálico apresenta uma vasta gama de atividades biológicas incluindo ação
antioxidante, atividades anti-inflamatórias, antimicrobiana, anticâncer [50-52],
antimutagênica [53] antidiabética [54] e antialérgica [55]. Atua como agente anti-
apoptótica protegendo células humanas contra danos oxidativos [56]. O ácido gálico
mostrou atividade citotóxica contra as células cancerosas sem danificar as células normais
[57]. Um dos mecanismos demonstrados de ação do ácido gálico é a inibição da ativação
do fator nuclear kappa B (NF-B) via inibição de kappa /B quinases (IK /), levando a
redução da IB degradação, NF-B translocação e ligação NF-B/DNA [58].
Tanto os derivados naturais como os sintéticos do ácido gálico apresentam
importante atividade biológica em vários estudos. O metil galato isolado de S.
 7

terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae), demonstrou boa atividade contra a inibição da

liberação de histamina [59]. Duas substâncias isoladas da Casearia sylvestris, o éter de
isobutil galato-3,5-dimetil e éter de metil galato-3,5-dimetil apresentam potencial contra
tumor de Ehrlich e câncer pulmonar [60]. Além disso, dois monoterpenos conjugados com
ácido gálico, globulusina A e eucaglobulina isolados de Eucalyptus globulus apresentaram
atividade anti-inflamatória e anti-melanogênica [61]. Foi demonstrado também que o
lauril, metil, propil galato induz apoptose em linhagens celulares e inibem proliferação
linfocítica [62].
A abordagem com modificação estrutural de compostos de origem natural para
obtenção de novas moléculas é muito útil em casos de adequação do composto às
necessidades tanto do ponto de vista farmacológico quanto farmacotécnico [63]. Um
exemplo clássico é do ácido salicílico, isolado da Filipendula ulmaria (Spirae ulmaria
(Rosaceae) e da Salix alba que eram comercializado como analgésico e causava frequentes
problemas gástricos. A acetilação da hidroxila fenólica, produzindo o ácido acetilsalicílico
(aspirina), amenizou estes efeitos colaterais e sua comercialização foi iniciada em 1899
[63].

2.2.3 Derivados Carbohidrazidas

Devido ao amplo espectro de propriedades biológicas e, principalmente, a sua

aplicação como fármacos na química medicinal, várias sínteses de compostos
carbohidrazidas foram desenvolvidas nestes últimos anos. O nosso principal objetivo com
a avaliação farmacológica de derivados 3,4,5-triidroxifenil contendo na posição -1 a
unidade carbohidrazida (Figura 3) é de contribuir na obtenção de novos agentes
terapêuticos.
 8

O
R
HO N
N
H H
HO
OH
carbohidrazil

3,4,5-triidroxifenil

Figura 3: Estrutura do núcleo fundamental dos derivados 3,4,5-triidroxifenil

contendo na posição -1 a unidade carbohidrazida, foco do nosso trabalho.

Assim, devido à inexistência de dados da literatura sobre estudos de compostos

3,4,5-triidroxifenil, contendo o grupo carbohidrazil mostraremos alguns exemplos gerais
de compostos com atividade biológica, contendo este grupo.
Trabalhos da literatura têm demonstrado que a subunidade N-acilhidrazona (ou
carbohidrazida), possui potente atividade antinociceptiva [61-62], anti-inflamatória [63] e
estimulante cardíaca [64-65]. Protótipos ativos como os derivados 1-3 apresentaram
potente atividade analgésica, no modelo de contorções abdominal induzido por ácido
acético em camundongos e efeito cardioativo. O derivado 4 apresentou importante ação
antinociceptiva e anti-inflamatória [66].

1 2 4
3

As carbohidrazidas (5a-d) apresentaram potente atividade antitumoral frente às

células cervical e pulmão [67].
 9

O
H
H3CO N C R
N
H
H3CO
OCH3

(5a) R=2-F (5b) R=3-F;

(5c) R=4-F (5d) R=4-CF3

Em outro trabalho, foi realizada a síntese e avaliação da atividade antitumoral de

vários derivados tiodiazolínicos, tendo como substituinte o grupo carbohidrazida, e os
compostos que melhor apresentaram atividade foram os derivados (6a) e (6b) [68].

H
N C
O
N
H
N
N (6a) R=OH
H3C CH3 R
S N (6b) R=NO2

2.3 Propriedades farmacológicas

Schinus terebinthifolius apresenta potencialidades medicinais, auxiliando nos

tratamentos de diversos males [72]. Na medicina popular é utilizado como anti-
inflamatório, analgésico, depurativo, para tratar doenças do sistema urogenital [59],
infecções respiratórias [73].
Extrato liofilizado da casca de S.terebinthifolius na dose de 440 mg/kg com
tratamento oral e intraperitoneal apresentou um efeito de proteção à mucosa gástrica contra
ulcerações em ratos [74]. O extrato etanólico das folhas de S. terebinthifolius apresentou
potencial atividade antifúngica contra espécies de levedura de Candida glabrata e
Sporothrix schenckii [75]. Outro estudo utilizando o óleo essencial de folhas apresentou
atividade contra Aspergillus flavus com inibição de 58% do crescimento, C. albicans com
inibição de 49,8% do crescimento e Aspergillus niger com inibição de 48,7% do
 10

crescimento [76]. Outro estudo utilizando o óleo essencial extraído das folhas de
S.terebinthifolius no tratamento de otites em cães por via otológica, apresentou efeito
inibitório do crescimento frente a alguns agentes antibacterianos contra Staphylococcus
spp. , Malassezia sp. e Proteus sp. [77]. Em relação à atividade cicatrizante estudos
demonstraram efeito no processo de cicatrização de feridas em pele de ratos tratados via
intraperitoneal com extrato hidroalcoólico de S. terebinthifolius na dose de 100 mg/kg [78-
80].
O óleo essencial extraído da casca de S. terebinthifolius mostrou atividade
antioxidante e anticâncer [81].
Resultados demonstraram que α-pineno substância encontrada no fruto da S.
terebinthifolius foi capaz de induzir a apoptose em modelo murino de melanoma
metastático [82].
Estudos realizados por nosso grupo demonstraram (Anexo II) que a administração
oral do óleo essencial do fruto inibiu em 58% o edema de pata em ratos induzido por
carragenina, inibição de 91% nos parâmetros inflamatórios do modelo de bolsa de ar
administrados na dose de 100 mg/kg via oral e causou inibição de 33% na inflamação
induzida por adjuvante completo de Freund (CFA) na dose de 200 mg/kg [37].

2.4 Inflamação

A inflamação é uma resposta essencial que permite a sobrevivência durante a

infecção ou lesão contribuindo para a manutenção da homeostase do tecido sob uma
variedade de condições nocivas [83]. Mas em excesso pode levar a necrose tecidual,
desequilíbrio fisiológico, fibrose, falência de órgãos e morte [84].
Os marcadores do processo inflamatório foram descritas a mais de 2.000 anos por
Cornelius Celsius: calor, rubor, edema e dor [85]. Outro sinal clínico, o quinto sinal
cardinal - a perda da função, foi descrito posteriormente por Virchow [86], completando os
cinco sinais cardinais da inflamação aguda [87].

2.4.1 Alterações vasculares e celulares do processo inflamatório

A reação inflamatória aguda é caracterizada por uma série de eventos inter-

relacionados, dentre os quais cita-se: a vasodilatação arteriolar, devido ao aumento no
 11

fluxo sanguíneo, o aumento localizado da permeabilidade microvascular na região afetada

ocasionando o edema, a dor localizada, a migração celular, o acúmulo de leucócitos
inflamatórios que migram dentro do tecido, a formação de tecido de granulação e o reparo
tecidual [88]. As fontes vasculares e celulares das inflamações são mediadas por várias
moléculas derivadas do plasma ou de células denominadas de mediadores químicos da
inflamação [89].
As alterações vasculares da inflamação aguda consistem em alterações no fluxo de
sangue e na permeabilidade dos vasos. Essas mudanças no fluxo e no calibre se iniciam
rapidamente, logo após a lesão e se desenvolvem em diferentes graus dependendo da sua
gravidade. A vasodilatação, com ou sem vasoconstrição causa aumento no fluxo sanguíneo
pela ação dos mediadores histamina e óxido nítrico (NO), aumentando a pressão
hidrostática causando o calor e a vermelhidão no local da inflamação. Com o aumento da
permeabilidade vascular ocorre um extravasamento de plasma rico em proteínas para os
tecidos extravasculares, diminuindo a pressão osmótica do plasma intravascular
acarretando a saída de líquido e formação do edema [90].
O aumento da permeabilidade vascular pode ser induzido por vários mecanismos,
sendo o mais comum à contração das células endoteliais resultando em abertura das fendas
intercelulares, permitindo o extravasamento plasmático. Outros mecanismos envolvidos
incluem a lesão endotelial direta mediada por leucócitos (p.ex. queimaduras) causando
necrose, extravasamento retardado prolongado (p.ex. queimadura de sol), lesão endotelial
mediada por leucócitos, extravasamento através de novos capilares (angiogênese) e por
transcitose que por determinados fatores induzem o extravazamento vascular [89].
O recrutamento de leucócitos no sangue é fundamental na reação inflamatória.
Leucócitos, células de defesa do organismo, são derivados da medula óssea, circulam em
estado inativo e são rapidamente ativados por patógenos invasores e outros estímulos.
Contribui para a resposta inflamatória secretando compostos citotóxicos como espécies
reativas de oxigênio, nitrogênio e enzimas proteolíticas presente em seus grânulos para
atividade fagocítica sobre os agentes estranhos. São recrutados para o tecido inflamado por
uma sequência de interações entre os leucócitos e o endotélio, que são mediadas por
moléculas de adesão (CAMs) e diferentes subconjuntos de CAMs que são responsáveis
pelos diferentes passos do extravasamento na superfície da célula [91-94].
Em decorrência das alterações vasculares, as células sanguíneas como as
polimorfonucleares (PMNS) passam a circular mais próximas do endotélio vascular. A
 12

migração dos PMNS da corrente sanguínea para o local da inflamação é denominada de

extravazamento e pode ser divida em várias etapas sequenciais, incluindo: marginação,
rolamento transitório provocando a ativação das integrinas, aderência estável e
diapedese/transmigração para o endotélio [95].
Esses eventos celulares são produzidas por proteínas expressas na membrana
celular endotelial e também nos leucócitos, conhecidas como moléculas de adesão. A
expressão dessas moléculas de adesão é regulada pelos vários mediadores inflamatórios e
podem ser agrupados em três famílias: i) as selectinas; ii) as integrinas e; iii) as
imunoglobulinas. As selectinas são compostas pela E-selectina expressa no endotélio, P-
selectina, expressa em plaquetas e células endoteliais e L-selectina expressa em leucócitos
[96].
As integrinas são heterodímeros formados pela associação não covalente de sub-
unidade α e β, ambas proteínas com segmentos extracelulares sendo 18 sub-unidades-α e 8-
β totalizando 24 tipos de integrinas que já foram descritas [97-98]. Essas moléculas que
estão expressas na superfície dos neutrófilos, interagem com ligantes tais como colágenos,
fibronectina, fibrinogênio e com as imunoglobulinas, como ICAM-1, VCAM-1 e outras.
Integrinas são receptores de adesão transmembrana que facilitam a adesão celular por meio
da ligação extra-celular que proporciona uma ligação mecânica entre uma célula e a matriz
extracelular (ECM) [99].
Os ligantes de integrina envolvidos na adesão de leucócitos, pertencem a
superfamília das imunoglobulinas e incluem moléculas de adesão intercelular ICAM (1-5)
e VCAM -1, que são moléculas de adesão que agem entre as células vasculares. O receptor
das imunoglobulinas envolvidos no recrutamento de leucócitos são as moléculas de adesão
de plaquetas/célula endotelial (PECAM-1), que auxiliam durante a diapedese [96, 100].

2.4.2 Indutores e resolução da inflamação

Os indutores da inflamação podem ser agentes exógenos ou endógenos. Os

indutores exógenos são classificados em dois grupos: microbianos e não microbianos.
Existem duas classes de indução microbiana. A primeira classe associados a padrões
moleculares (PAMPs) os quais são detectados diretamente por receptores específicos. A
segunda classe compreende uma variedade de fatores de virulência, restrito aos agentes
patogênicos. Os indutores exógenos que são de origem não microbiana incluem corpos
 13

estranhos, alérgenos, irritantes e compostos tóxicos [101] dentre outros como calor e frio
intenso.
Os indutores endógenos são sinais que se iniciam a partir da resposta inflamatória,
ativando sensores especializados dando início à produção de mediadores específicos, esses
sinais são produzidos devido ao estresse de tecidos danificados e células mortas
ocasionando um desequilíbrio, desencadeando um processo inflamatório [101].
Os agentes indutores geram o processo inflamatório a partir da produção de vários
tipos de substâncias mediadoras, alterando o funcionamento de tecidos e órgãos [102]. A
lesão tecidual induzida por esse trauma resulta na liberação de mediadores inflamatórios,
incluindo as citocinas, o fator de necrose tumoral (TNF-α) e a interleucina-1 (IL-1) a partir
de leucócitos, monócitos e macrófagos [103].
A resolução completa de uma resposta inflamatória aguda e o retorno do corpo à
homeostasia é necessário para a saúde [104]. Caso isso não aconteça alguns exemplos de
falhas no processo de resolução são descritos como aterosclerose, obesidade, artrite
reumatóide, fibrose pulmonar, câncer, esclerose múltipla, doença neurodegenerativa [105]
como a doença de Alzheimer [106], dentre outras.
A resolução da inflamação aguda é um processo ativo e bem coordenado por
mediadores endógenos denominados de pró-resolutivos (ex. prostaglandinas
ciclopentenonas, lipoxinas/resolvinas, NF-B, anexina-1 e indutores da apoptose que tem a
função de reverter a vasodilatação e permeabilidade vascular, fazendo com que haja a
eliminação segura de leucócitos inflamatórios, exsudato e fibrina, conduzindo assim à
restauração do tecido inflamado. A resolução bem sucedida irá limitar a lesão tecidual
excessiva, dando pouca oportunidade para o desenvolvimento da inflamação crônica [107].
Aliado a isso, existe a formação de mediadores pró-inflamatórios como aminas vasoativas
(histamina e serotonina), metabólitos do ácido araquidônico (AA), citocinas (TNF-α, IL-1
e várias outras), quimiocinas, fator ativador de plaquetas (PAF), sistema completo, sistema
de coagulação e das cininas e outros.

2.4.3 Mediadores do processo inflamatório

2.4.3.1 Aminas vasoativas (histamina e serotonina)

 14

Histamina e serotonina são as principais aminas vasoativas, sendo denominadas

desse modo porque tem importantes ações nos vasos sanguíneos. A histamina (2-[4-
imidazolil]etilamina) é sintetizada a partir do aminoácido L-histidina descarboxilase, uma
enzima expressa nas células do corpo, incluindo neurônios centrais do sistema nervoso,
células da mucosa parietal gástrica, mastócitos e basófilos. A histamina é liberada em
resposta a uma variedade de estímulos. São mediadas pela ligação com quatro subtipos de
receptores, pertencentes à família dos receptores acoplados a proteína G (G protein-
coupled receptors), tais como H1, H2, H3, H4 [90, 108-110]. A histamina é considerada o
principal mediador da fase transitória, causando dilatação das arteríolas e aumento da
permeabilidade das vênulas [90].
Outra amina biologicamente ativa é a serotonina conhecida como 5-
hidroxitriptamina (5-HT). Esta além de ser encontrada nas terminações nervosas é
encontrada também nas células neuroendócrinas, células do estômago e plaquetas. A
biossíntese da serotonina acontece nos neurônios pré-sinápticos pela descarboxilação e
hidroxilação do aminoácido L-triptofano [111].
A atividade biológica da serotonina é mediada por meio de interações com sete
famílias de receptores diferentes (5-HT1-7), composto por 14 subtipos diferentes [112].
Todos são acoplados a receptores da proteína G, com exceção do receptor 5-HT3. O
receptor 5-HT2A é o mais conhecido [113]. A histamina induz a contração do músculo liso,
atuando no aumento da permeabilidade vascular [114].

2.4.3.2 Eicosanóides : prostaglandinas, leucotrienos e lipoxinas

Os eicosanóides são produtos de oxidação de ácidos graxos insaturados e sua

reação de síntese é iniciada pela liberação de ácido araquidônico (AA). O ácido
araquidônico o mais importante dos precursores dos eicosanóides é um ácido graxo de 20
carbonos que é liberado a partir da hidrólise dos fosfolipídios da membrana, por meio da
enzima fosfolipase A2 (PLA2) que está presente em leucócitos e plaquetas sendo ativada
por citocinas inflamatórias como a IL-1 [115-116] e por outros agentes.
O AA é metabolizado em diferentes famílias dos eicosanóides por vários sistemas
enzimáticos. As duas vias principais são as ciclooxigenases COX-1 e COX-2, que
determinam a produção das prostaglandinas (PGs) e tromboxanos (TXs), e a via das
 15

lipoxigenases (LOXs) que levam à síntese dos leucotrienos (LTs) e lipoxinas (5-LOX, 12-
LOX e 15-LOX) uma outra via é a P450 epoxigenase [117].
Esses mediadores lipídicos biologicamente ativos servem como sinais intra ou
extracelulares, incluindo a regulação da função renal, cardiovascular, gastrintestinal,
inflamatória e da hemostasia [90, 118].
Os produtos da via COX como as prostaglandinas, o tromboxano e a prostaciclina
coletivamente são chamados de prostanóides [116].
A COX ou prostaglandina endoperóxido sintase (PGHS) (COX-1 e COX-2) é a
enzima que cataliza a conversão do ácido araquidônico em prostaglandina G2 (PGG2),
convertendo a PGG2 em H2 (PGH2). A PGH2 intermediária é convertida por uma variedade
de enzimas em PGE2, PGF2α, PGD2, PGI2 (prostaciclina) e em tromboxanos TXA2 [119].
A COX-1 é conhecida por ser uma enzima constitutiva presente em quase todos os
tipos de células, enquanto que a COX-2 pode ser induzida por citocinas ou fatores de
crescimento inflamatórios, tais como macrófagos e monócitos [120-121]. Existe outra
classe denominada de COX-3, que segundo alguns estudos poderiam ser mais efetivas em
cães do que em humanos ou roedores determinando possivelmente a diminuição da atenção
sobre a COX-3 [122].
As prostaglandinas atuam de maneira autócrina e parácrina, implicando numa
grande variedade de funções biológicas tais como vasoconstrição, vasodilatação,
agregação, quimiotaxia, febre, resposta a dor e asma [123-124]. Nesta família incluem
PGE2, PGD2 e PGF2. O PGE2 é um modulador implicado nas condições inflamatórias, tais
como vasodilatação, dor, febre, relaxamento dos músculos lisos, função neuronal e
inibição da liberação de noradrenalina a partir de terminações nervosas [124]. Os
receptores de prostaglandinas pertencem a três grupos, dentro de uma subfamília distinta
do receptor acoplado a proteína G. Existem quatro subtipos de receptores que se ligam a
PGH2 (EP1-EP4), dois que se ligam a PGD2 (DP1 e DP2) e outros receptores que se ligam
em PGF2α, PGI2 e TXA2 são FP, IP e TP, respectivamente [123].
A PGH2 é metabolizada em dois compostos altamente instáveis e biologicamente
ativos com estruturas diferentes das prostaglandinas primárias, o tromboxano A2 e a
prostaciclina ou prostaglandina I2. O tromboxano A2, é sintetizado principalmente pelas
plaquetas, causa efeitos contrários como a vasoconstrição e agregação plaquetária, tem
meia-vida curta de aproximadamente 30 segundos sendo convertido não enzimaticamente
em tromboxano B2 (TXB2), um composto estável e relativamente inativo. A PGI2
 16

predomina principamente no endotélio vascular, é responsável por vasodilatação e pela

inibição da adesividade plaquetátia, tem meia-vida aproximadamente de três minutos
sendo convertida em um composto com menor atividade, a PGFα [125-126].
As enzimas lipoxigenases são responsáveis pela produção dos leucotrienos, que são
secretados principalmente pelos leucócitos apresentando efeitos vasculares. Existem três
tipos de lipoxigenases 5-, 12- 15-lipoxigenases (LOX). A enzima converte o AA a ácido 5-
hidroxieicosatetraenóico que é precursor dos leucotrienos [87, 90]. Pela via da
lipoxigenase gera-se os quatro tipos de leucotrienos: LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4 [87].
O LTB4 é um potente agente quimiotático e ativador de neutrófilos, causando
agregação e adesão das células do endotélio vascular, geração de espécies reativas de
oxigênio (ERO) e liberação de enzimas lisossômicas [90].
O leucotrieno C4 é submetido a um metabolismo extracelular, formando LTD4 e
LTE4. Esses três leucotrienos (LTC4, LTD4 e LTE4) são chamados de cisteínicos, por
apresentarem cisteinil na sua estrutura e são responsáveis por causar intensa vasocontrição,
broncoespasmo e permeabilidade vascular [90, 122].
Em relação as lipoxinas (LXs), essas compõem uma classe do ácido aracdônico
com propriedades anti-inflamatórias e imunorreguladoras. As lipoxinas são produzidos por
meio da cooperação entre 5- e 12-lipoxigenase, ou durante interações celulares de 15-LO.
Elas apresentam ações opostas exercidas pelas prostaglandinas e leucotrienos e as
principais representantes são a LXA4 e a LXB4 [127]. Essas atuam como mediadores anti-
inflamatórios por inibição da infiltração de neutrófilos e transmigração em locais da
inflamação, por meio da indução da produção do óxido nítrico para suprimir leucócitos
endoteliais e para inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, por meio
de fatores de transcrição NF-kB e proteína ativadora-1(AP-1) [128].

2.4.3.3 Citocinas e quimiocinas

As citocinas pertencem a uma família de moléculas de sinalização polipeptídicas

que são liberadas por várias células em resposta a inúmeros estímulos. São proteínas
regulatórias de baixo peso molecular ou glicoproteínas que se ligam a receptores
específicos de uma maneira autócrina, parácrina e / ou endócrina [87, 129]. São produzidos
principalmente por linfócitos ativados, macrófagos, células endoteliais, epiteliais e do
tecido conjuntivo [130]. Iniciam a sua ação por meio da ligação a receptores específicos
 17

provocando alteração da síntese do RNA e de proteínas de diferentes células do organismo

[131].
Entre os reguladores mais importantes desse processo destacam-se o fator de
necrose tumoral-α (TNF-α) e a interleucina 1 (IL-1), as quais são produzidas
principalmente por macrófagos.
A interleucina 1 (IL-1) como o próprio nome diz, foi a primeira a ser descrita na
década de 70. Atualmente existem 11 membros da família IL-1: IL‑1α, IL‑1β, antagonista
de receptor IL-1 (IL-1Ra), IL‑1F5–IL‑1F10, IL‑18 (também conhecida como IL-1F4),
IL‑33 (também conhecida como IL-1F11) [132]. A IL-α e IL-β apresentam uma mínima
homologia, mas possuem propriedades biológicas similares. Enquanto a IL-α é uma forma
biologicamente ativa, a IL-β não tem atividade biológica até ser processado pela enzima
caspase-1, mas ligam-se ao mesmo receptor IL-1R, podendo a IL- β também se ligar no
receptor IL-2R [87, 133].
A IL-α está geralmente associada com a membrana plasmática e age localmente. É
expressa por queratinócitos e células endoteliais, enquanto que a IL-β é secretada e circula
sistemicamente sendo produzida por monócitos e macrófagos [132].
A IL-1 é uma potente citocina pró-inflamatória que atua como um pirógeno
endógeno. Depois de se ligar ao receptor IL-1R, a IL-1 induz a produção de um amplo
espectro de citocinas e quimiocinas, bem como a expressão de moléculas de adesão sobre
as células endoteliais, levando assim ao recrutamento de células inflamatórias. Além disso,
a IL-1 contribui para o desenvolvimento de dano vascular, estimulando a proliferação e
diferenciação celular. O antagonista de IL-1R (IL-1Ra) é um homólogo estrutural de IL-1
que se liga a IL-1R, mas não induz qualquer resposta celular e é, por conseguinte, um
inibidor natural da atividade de IL-1 [134].
O TNF-α é uma citocina multifuncional que tem papel importante na inflamação
aguda e crônica, nas respostas anti-tumorais infecciosas [135]. O TNF-α pode ser
produzido por macrófagos ativados, linfócitos ou monócitos, se ligam a receptores
específicos denominados (TNF-R) I e II. O principal efeito fisiológico do TNF-α é
promover a resposta imune e a inflamatória por meio do recrutamento de neutrófilos e
monócitos para o local da infecção, além de ativá-los, provocando uma série de efeitos no
organismo [136].
Em relação à quimiocinas são citocinas quimiotáticas que recrutam populações
específicas de leucócitos provocando o movimento destes para dentro de vários sítios
 18

teciduais, induzindo a aderência dessas células ao endotélio vascular, onde estão

envolvidas em muitos processos inflamatórios crônicos [87, 137]. É uma família de
pequenas proteínas, das quais 50 quimiocinas diferentes já foram identificadas, sendo
classificadas com base no número e na localização dos resíduos das cisteínas [138]. Esses
quimioatraentes agem principalmente sobre neutrófilos, monócitos, linfócitos e eosinófilos
[139]. As quimiocinas se ligam as moléculas por meio de receptores associados à proteína
G e são classificados em receptores CXCR, CCR, CR e CX3CR [140].

2.5. Medicamentos anti-inflamatórios

Existem vários fármacos anti-inflamatórios, mas os mais utilizados na prática

clínica são os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) não seletivos da COX, os AINEs
seletivos da COX-2 e os anti-inflamatórios esteroidais (AIES). Outros fármacos anti-
inflamatórios utilizados terapeuticamente, por exemplo, no tratamento da artrite
reumatóide tem seu mecanismo de ação baseado no antagonismo de receptor para
interleucina-6, antagonismo de receptor para interleucina-1, inibição da ação do TNF-.
Apesar destas classes de substâncias (AINES e AIES) apresentarem excelentes
propriedades anti-inflamatórias e serem utilizados na terapêutica clínica, seu uso produz
importantes efeitos colaterais.
Em 1893 foi introduzida na medicina a primeira molécula com atividade
analgésica, chamado de ácido acetilsalicílico (AAS) ou aspirina criada pelo Laboratório
Bayer onde o químico alemão Felix Hoffman motivado pela preocupação com seu pai
devido à artrite reumatóide, sintetizou o AAS a partir do ácido salicílico. Os AINEs,
compostos anti-inflamatórios não esteróides são conhecidos pela humanidade há cerca de
100 anos e estão entre os agentes farmacológicos mais utilizados na prática médica,
apresentando indicações terapêuticas como analgesia, anti-inflamação, antipirese e
profilaxia contra doenças cardiovasculares [141].
Os AINEs inibem a enzima COX de ácidos graxos, deste modo há inibição da
produção de PGs e TXs. As isoformas mais conhecidas são COX-1 (constitucional ou
fisiológica) e COX-2 (induzida ou inflamatória), com características químicas e
fisiológicas definidas apesar de existirem outras isoformas [142-143]. As COX-1 e COX-2
desempenham um papel chave no metabolismo do AA e na regulação de eicosanóides
[144].
 19

Um dos principais efeitos dos AINEs é a inibição específica da COX e

consequentemente a redução da conversão do AA em PGs. A ciclooxigenase é a primeira
enzima da síntese das PGs, que tem o papel de converter o AA nas PGs intermediárias
instáveis que são a PGG2, que sob a ação da peroxidase forma PGH2, que são convertidas
em PGs, PG12 e TXs e as lipoxigenases transformam o AA em leucotrienos e outros
compostos [93, 145]. A terapia anti-inflamatória decorre da necessidade de controlar os
sinais cardinais da inflamação [146].
Os AINEs tradicionais como naproxeno, ibuprofeno, diclofenaco, indometacina,
flurbiprofeno, nabumeton e aspirina inibem ambas as isoformas de COX, classificados
como anti-inflamatórios não seletivos. Por atuarem nas duas isoformas, reduz a inflamação
por inibir a COX-2 que é altamente seletiva, mas causa efeitos secundários
gastrointestinais por inibirem a COX-1. Isto parece ser explicado pelo envolvimento de
ambas isoformas na produção de prostanóides associados com proteção gástrica, pois
estudos mostram que tanto COX-1 e COX-2 apresentam-se em humanos e animais na
mucosa gástrica [147].
Com a descoberta da isoforma COX-2 durante o processo inflamatório, surgiu
novas perspectivas terapêuticas para o desenvolvimento de drogas com menos efeitos
adversos, denominados de Coxibes ou inibidores seletivos da COX-2 [148]. Alguns
exemplos de coxibes são celocoxibe, parecoxibe, valdecoxibe, etoricoxibe e rofecoxibe
[143]. Em 2004 e 2005 o medicamento rofecoxibe e valdecoxibe foram retirados do
mercado por causar problemas cardiovasculares e celecoxibe foi recomendado a colocação
de tarja preta por apresentar risco cardiovascular [149].
Em relação aos GCs conhecidos como anti-inflamatórios esteroidais ou hormonais
são bastante prescritos pois são utilizados em protocolos de tratamento de uma ampla
variedade de doenças inflamatórias e autoimunes, como a artrite reumatóide, por exemplo
[150]. São classificados de acordo com sua meia-vida, sua potência e sua duração de ação.
Alguns exemplos são: a cortisona e a hidrocortisona (ação curta), prednisona,
prednisolona, metilprednisolona e a triancinolona (ação intermediária), dexametasona e
betametasona (ação longa) [151]. Os esteróides farmacêuticos são normalmente
sintetizados a partir do ácido cólico, obtido do gado bovino ou de sapogeninas esteroides
encontradas em plantas [116].
Depois de entrarem nas células, os GCs se ligam a receptores protéicos específicos-
receptores de GC (RCG). O receptor ativado interage com a zona de regulação, atuando
 20

com fator de transcrição, induzem a sua mudança e um sinal de translocação é exposto,

ligando se ao DNA cromossômico, alterando a expressão do gene alvo em resposta a um
sinal hormonal específico [150-152]. Esta ligação desencadeia ou inibe a transcrição do
gene, num mecanismo clássico que é dividido em dois processos: transativação e
transrepressão.
A transrepressão é uma regulação indireta da expressão do gene por interação do
receptor de GC. O receptor se liga em monômeros de moléculas de GC e interagem com
fatores de transcrição tais como NF-kB e a proteína ativadora 1 (AP-1) e promove o efeito
inibitório, reduz a síntese de citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucinas 6 (IL-6) ,
IL-2, TNF-α e PGs [153-154].
Já no processo de transativação o complexo glicocorticóide-receptor são
translocado para o núcleo da célula, modifica a sua estrutura, no qual se liga a regiões
promotoras de certos genes, denominadas elementos responsivos aos GC, induzindo a
síntese, não somente de proteínas anti-inflamatórias, como a lipocortina-1 e IkB, mas
também de proteínas que atuam no metabolismo sistêmico (por exemplo, proteínas que
promovem gliconeogênese) [154].
O processo transrepressão é responsável por um grande número de desejáveis
efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores, sendo considerado o mecanismo chave
para a atividade anti-inflamatória e a transativação está associado com efeitos adversos que
ocorrem com frequência nas atividades imunossupressoras [155].
A ação anti-inflamatória resulta, sobretudo, da interação do receptor de
glicocorticóide ativado com os fatores de transcrição NF-κB e AP-1, a qual leva à inibição
da expressão de moléculas pró-inflamatórias [156].
 21

3 Objetivos

3.1 Objetivo geral

 Realizar o estudo da atividade anti-inflamatória do extrato metanólico de Schinus

terebinthifolius Raddi, do metil galato e de 5 novos compostos derivados
carbohidrazil em modelos de inflamação experimental .

3.2 Objetivos específicos

 Avaliação da atividade do extrato metanólico de S. terebinthifolius no modelo de

edema de pata agudo e atividade da mieloperoxidase induzida por carragenina em
camundongos;

 Avaliação das atividades anti-inflamatórias do metil galato e derivados

carbohidrazil no edema de pata agudo e atividade da mieloperoxidase induzida por
carragenina em camundongos;

 Avaliação da atividade anti-inflamatória dos derivados de metil galato em modelo

experimental de pleurisia induzida por carragenina em camundongos.
 22

4 Referências

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tratamento de úlceras gástricas, Funcap 3 (2001) 5-6.
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 31

5 ANEXOS

5.1 Anexo1 - Artigo científico

O artigo científico segue as normas do periódico internacional, que será submetido.

Chemico-Biological Interactions

Title: Analysis of responses of 3,4,5-trihydroxyfenyl derivatives bearing a

substituted carbohydrazide moiety experimental inflammation in mice

Edna Kiyomi Kassuya Iriguchia, Anelise Samara Nazari Formagiob, Luiz Augusto

Cauz dos Santosb, Maria do Carmo Vieirab, Candida Aparecida Leite Kassuyaa

a
Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Grande Dourados,

MS, Brazil
b
Faculdade de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Grande Dourados,

MS, Brazil

*Corresponding author: Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Federal

da Grande Dourados, Dourados, 79825-070, MS, Brazil, Phone: +55 67 3410-

2326, Fax: +55 67 3410-2326. E-mail address: candida2005@gmail.com

 32

ABSTRACT

Inflammation is response induced by noxious stimuli, with the main objective to

provide maintenance of homeostasis and repairs the tissue injury. The methyl

gallate is an important component found in several medicinal plants especially in

Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae) a plant popularly used against

inflammatory diseases. In the present study, we used mice (n=5/group) to assess

the anti-inflammatory effect of methanolic extract (MEST) and methyl gallate

(compound 2) obtained from S. terebinthifolius. A series of 3,4,5-trihydroxyfenyl

derivatives bearing a substituted carbohydrazide moiety were synthesized and

chemically identified as radical carbohydrazide or 3,4,5-trihydroxyfenyl-

carbohydrazide (compound 2), 3,4,5-trihydroxyfenyl-N’-(4-methoxybenzylidene)-

1-carbohydrazide (compound 4) , 3,4,5-tri-hydroxyfenyl-N’-(4-N-

dimethylaminobenzylidene)-1-carbohydrazide (compound 5), 3,4,5-tri-

hydroxyfenyl-N’-(4-nitrobenzylidene)-carbohydrazide (compound 6), 3,4,5-tri-

hydroxyfenyl-N’-(benzylidene)-carbohydrazide (compound 7) were evaluated for

their anti-inflammatory activity. The oral administration of MEST (100 and 300

mg/kg), compound 2 (100 and 300 mg/kg), compound 3, 4, 5 and 6 (100 mg/kg),

but not compound 7 (100 mg/kg), inhibited significantly the carrageenan-induced

oedema in mice paw. Therefore, only compound 4 (100 mg/kg), reduced the

carrageenan-increased of myeloperoxidase activity. When local application occur,

compound 2 (10-100 g/paw), 4, 5, and 6 (all at 10 g/paw) inhibited the

carrageenan-induced oedema and 3, 4, and 6 (10 g/paw) decrease the MPO

activity. To investigate if methyl gallate derivatives induced anti-inflammatory

effects in another model of experimental inflammation, compound 3 and 4 were

tested in pleurisy model inducing inhibition of inflammatory parameters like

 33

leukocyte migration and protein extravazation. The experimental observations

from anti-inflammatory activities of S. terebinthifolius extracts and methyl gallate

have been guiding for the development of new methyl gallate derivatives that

possess marcant anti-inflammatory activities.

Key-words: Schinus terebinthifolius, Anacardiaceae, mice, inflammation, methyl

gallate, carbohydrazide

1. Introduction

The Inflammatory process is essential complex response that maintain the

homeostasis after noxious condition such as infection or injury [1]. However, when

excessive and uncontrolled, inflammation can lead to necrosis, physiologic

unbalance, fibrosis [2], and chronic diseases. An example is the development of

rheumatoid arthritis that maybe occur when inflammation is inappropriately

directed against self tissues or is not adequately controlled [3].

The conventional anti-inflammatory therapy control the cardinal signs of

inflammation in some diseases [4]. The four cardinal signs of inflammation such as

swelling, rubor, heat, pain were described by Celsus and Virchow included a fifth

cardinal sign for this process and loss of function [5].

Studies of natural products contributed to development of the spectroscopic

approaches to structure elucidation, and synthetic methodologies that now

constitute the foundation of organic chemistry. Recognition of the biological

 34

properties of natural products has fueled the current focus of this field, namely, the

search for new drugs, antibiotics and others [6].

Schinus terebinthifolius Raddi is an evergreen shrub or tree of the

Anacardiaceae, native to South and Central America [7]. It is known as “aroeira-

vermelha” and “aroeira pimenteira” [8]. In folk medicine, it has been used as a

remedy for ulcers, respiratory problems, wounds, rheumatism, gout, tumors,

diarrhea, skin ailments, arthritis [9] and used for the treatment of inflammation

[10]. Some works have revealed through phytochemical analysis that gallic acid,

methyl gallate (1,2,3,4,6-pentagalloylglucose) are the major components of the

extracts from Schinus genus and some studies were made to shown that this

components are important to medicinal activity by plants from this genus [11-12].

The research into plants with etnopharmacological use as anti-inflammatory

drugs, should be a strategy to development for new anti-inflammatory drugs [13]

because the traditional anti-inflammatory drugs (NSAIDs) as well as glucocorticoid

could lead adverse effects. Examples are that selective COX-2 inhibitors that

increase the incidence of thrombotic adverse cardiovascular effect [14]. There is

an urgent need to find safer and more effective drug treatments [15].

In the present study, we sought to investigate, by the use of inflammation

procedures the ability extract of S. terebinthifolius Raddi as well as the isolated

natural compound methyl gallate involvement in paw edema and pleurisy in

experimental models of inflammation. We also synthesized and evaluated the anti-

inflammatory activity of the series of 3,4,5-trihydroxyfenyl derivatives bearing a

substituted carbohydrazide moiety (3-7). Attempts have been made to further

investigate if some of methyl gallate synthetized by our group exhibit also anti-

inflammatory actions.
 35

2 Materials and methods

2.1. Plant material

Schinus terebinthifolius leaves were collected in Dourados-MS, in August,

2009, and identified by Dr. Zefa Valdevina Pereira of the UFGD. A voucher

specimen (DDMS 4600) was deposited in the herbarium of the UFGD, MS, Brazil.

2.1.1. Preparation of the methanolic extract (MEST) and purification of methyl

gallate

Dried leaves (23 g) were extracted successively with methanol at room

temperature. After filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure

at 45 οC and lyophilized to give a solid material (8 g). Part of the methanolic extract

(5 g) was dissolved in methanol: water (1:1) and partitioned with hexane, CHCl3

and ethyl acetate. The solvent was evaporated to dryness under vacuum to give

the ethyl acetate fraction (EAF 2.8 g). The EAF (1.6 g) was purified on Sephadex

LH-20 (25 g) using H2O, H2O-MeOH (1:3, 1:1) and MeOH, affording methyl gallate

(15.4 mg). 1HNMR (300 MHz, CD3OD): 7.02 (s, 2H), 3.84 (s, 3H). 13CNMR

(75 MHz, CD3OD): 52.2 (OCH3), 122,0 (C), 110.4 (2CH), 146.5 (2C), 139,7 (C),

170.6 (C=0).

2.1.2. General
 36

1H and 13C spectra were recorded in a Varian spectrometer model Mercury plus

BB at 300 MHz and 75 MHz, respectively. For TLC, Merck precoated plates (silica

gel 60 G254) were used. All reagents were purchased from commercial suppliers:

4-methoxybenzaldehyde (Sigma-Aldrich, 98%), , 4-dimethylaminobenzaldehyde

(Merck, 98,5%), , benzaldehyde (Acros Organic, 99%), 4-nitrobenzaldehyde

(Acros Organic, 99%), hydrazine hydrate (Aldrich, 80%), ethanol (Synth, Nuclear),

sulfuric acid (Dinâmica 95-98%), sodium bicarbonate (Synth 99,5%), methanol

(Nuclear), ethyl acetate (Synth, Nuclear), n-hexane (Nuclear), CHCl3 (Nuclear),

gallic acid (Sigma-Aldrich, 98%).

2.2. Synthesis

2.2.1. General procedure for preparation of carbohydrazine (3)

To a solution of 2.97mmol of methyl gallate (2), previously prepared by

reaction esterification of the gallic acid (1), in 30 mL of ethanol, was added 1.8 ml

(48.2 mmol) of 80% hydrazine hydrate. This mixture was refluxed for 60 h, when

TLC analysis indicated the end of the reaction. Then, the media were poured on

ice and the resulting precipitate was filtered out, affording the corresponding

carbohydrazine (3). 1HNMR (300 MHz, CD3OD): 6.82 (s, 2H). 13

CNMR (75 MHz,

CD3OD): 121.5 (C), 110.1 (2CH), 146.7 (2C), 153.4 (C), 162.4 (C=0).

2.2.2. General procedure for preparation of carbohydrazides (4-7)

 37

A solution of derivatives 3 (1 mmol) in water (10 mL) containing two drops

of concentrated sulfuric acid was refluxed for 30 min, until complete dissolution.

Then, a solution of aromatic aldehyde (1 mmol) in ethanol (3 mL) was added. The

resulting solution was refluxed for 48 h. The mixture was poured into cold water

and neutralized with 10% aqueous sodium bicarbonate solution and the precipitate

formed was filtered of buchner, crystallized from methanol and dried, furnishing

the title compounds 4-7 with 74-80% yield.

2.2.2.1. 3,4,5-trihydroxyfenyl-N’-(4-methoxybenzylidene)-1-carbohydrazide

(4)

Yield: 75%; 1HNMR (300 MHz, CD3OD): 3.87 (3H, s, OCH3), 7.00 (2H, s), 7.70
13
(2H, d, J= 8.7 Hz), 7.80 (2H, d, J= 8.7 Hz), 8.58 (1H, s, N’=CH). C NMR (75

MHz, CD3OD): 55.6, 115.2, 115.4, 125.9, 127.6, 131.2, 140.7, 145.9, 149.3, 162.3,

163.6.

2.2.2.2. 3,4,5-tri-hydroxyfenyl-N’-(4-N-dimethylaminobenzylidene)-1-

carbohydrazide (5)

Yield: 75%; 1HNMR (300 MHz, CD3OD): 3.03 (s, 6H), 6.93 (2H, d, J= 8.7 Hz), 7.68
13
(2H, s), 7.78 (2H, d, J =8.7 Hz), 8.36 (1H, s, N’=CH), C NMR (75 MHz, CD3OD):

40.3, 111.9, 114.1, 125.9, 129.8, 130.4, 141.4, 146.2, 149.4, 161.2, 162.6.

2.2.2.3. 3,4,5-tri-hydroxyfenyl-N’-(4-nitrobenzylidene)-carbohydrazide (6)

 38

Yield: 87%; 1HNMR (300 MHz, CD3OD): 7.34 (2H, d, J=7.5 Hz), 7.66 (2H, d, J
13
=7.5 Hz), 7.70 (2H, s), 8.10 (1H, s, N’=CH). C NMR (75 MHz, CD3OD): 114.8,

125.4, 123.8, 128.2, 130.1, 139.5, 145.5, 146.2, 150.3, 161.2.

2.2.2.4. 3,4,5-tri-hydroxyfenyl-N’-(benzylidene)-carbohydrazide (7)

Yield: 75%; 1HNMR (300 MHz, CD3OD): 7.40 (3H, m), 7.88 (2H, d, J =7.0 Hz),

7.86 (2H,s), 8.65 (1H, s, N=CH). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): 115.4, 126.3, 128.7,

128.8, 131.0, 133.9, 140.4, 145.2, 148.7, 162.5.

2.3. Animals

The experiments were conducted using male and female Swiss mice (25-35

g) provided from Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD). The animals

were maintained under a 12 h light-dark cycle, with controlled humidity (60 - 80

%), and temperature (22 ± 1ºC). The animals were acclimatized to the

experimentation room for at least 2 h before testing and were used only once

throughout the experiments (n = 5/group). All experimental procedures were

carried out in accordance with U.S. National Institute of Health, and were

approved by the ethics committee for research on laboratory animal of the UFGD

(Nbr. 005/2010).

2.4. Material and reagents

 39

λ-Carrageenan (Cg), Tween 80 and dexamethasone were purchased from

Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).

2.5. Carrageenan-induced paw oedema

Different groups of mice were orally treated with MEST (100 and 300

mg/kg), methyl gallate (100 and 300 mg/kg) and novel 3,4,5-trihydroxyphenyl

derivatives bearing a substituted carbohydrazyde group at C-1 (3-7) (100 mg/kg)

or vehicle.

In a separate experimental group, mice were treated intraplantar injection

methyl gallate (10 and 100 μg/paw) and derivates (3-7) (10 µg/paw) or vehicle.

Another group of mice were treated subcutaneously with the anti-inflammatory

drug dexamethasone (1 mg/kg). After 1 h, the animals received a 50 μL s.c.

injection into the right hindpaw of carrageenan (300 µg/paw) suspended in sterile

0.9% saline. The contralateral paw received only saline and was used as control.

The thickness of the paw oedema was measured using a digital micrometer

(DIGIMESS 110-284) 1h before any treatment and at different time points (0.5, 1,

2, 4 and 24 h) after the injection of carrageenan. Results were expressed in μm

and the difference between basal and post-injection values quantified as oedema

[16].

2.6. Determination of myeloperoxidase (MPO) activity

To investigate whether oral treatment with extract, methyl gallate and

compounds (3-7) and treated intraplantar injection methyl gallate (10 and 100
 40

μg/paw) and compounds (3-7) (10 μg/paw) or vehicle could affect the cellular

migration induced by carrageenan the myeloperoxidase activity was measured

into the mouse paw. Animals were euthanized 6 h after carrageenan injection, the

described before [17] . For MPO activity, the tissue was homogenized in 5% (w/v)

of 80 mM phosphate buffer, pH 5.4, containing 0.5% of

hexadecyltrimethylammonium bromide. The homogenate was centrifuged at 3200

rpm and 4ºC for 20 min. Aliquots (30 μL) of each supernatant were mixed with 100

μL of phosphate buffer 80 mM, 85 μL of phosphate buffer 0.22 M and 15 μL of

0.017% H2O2 on a 96-well plate. The reaction was triggered with 20 μL of 3,3,3-

tetramethylbenzidine (dissolved in N,N-dimethylformamide). The plate was kept at

37 ºC for 3 min, after which the reaction was stopped by adding 30 μL of sodium

acetate 1.46 M, pH 3.0. The enzymatic activity was determined by measuring the

optical density at 630 nm and was expressed as mOD per mg of protein.

2.7. Pleural cell migration and protein exudation

Different groups of animals treated with compounds (3) and (4) (10 mg/kg,

i.p.) or dexamethasone (1.0 mg/kg, subcutaneously, positive control), vehicle, and

naïve (0.9%—negative control) were administered orally by gavage, in different

groups of mice. Pleurisy was induced by the intrathoracic injection of 100 µl of 1%

carrageenan as previously described [18]. The carrageenan was diluted in saline

buffered. Briefly, an adapted needle was inserted into the right side of the thoracic

cavity of the animals to enable intrathoracic (i.t.) administration of carrageenan.

Control mice received an equal volume (100µL) of sterile, pyrogenfree saline. After

4 h, the animals were killed and the thoracic cavity was washed with 1mL of
 41

phosphate-buffered saline (PBS). The exudate volume was measured, and an

aliquot of 20 μL was diluted in Turk solution (1:20) and used to determine the total

number of leukocytes in a Neubauer chamber. For differential counting of

leukocytes, the remaining fluid was centrifuged at 3200 rpm for 20 min, and the

cells were resuspended.The protein exudation was evaluated directly from the

lavage by Bradford’s reaction, using the commercially available Bradford kit

(Bioagency, São Paulo, Brazil). Total and differential cell counts were performed

under light microscopy and the results are reported as the number of cells per ml

of pleural fluid.

2.8. Statistical analysis

All data are presented as mean ± S.E.M. Difference between groups was

evaluated by analyses of variance (one-way ANOVA) followed by Student

Newman-Keuls test. The number of animals per group is indicated in the legends.

Statistical differences were considered to be significant at P<0.05.

3. Results

3.1. Obtention of new carbohydrazides derivatives

The synthetic route for the preparation of carbohydrazides derivatives is presented

in Scheme 1. The methyl gallate (2) were prepared by reaction esterification of the

corresponding carboxylic acid (1) with methanol and sulfuric acid [19]. Reaction of

methyl gallate with hydrazine hydrate afforded the carbohydrazil (3). Condensation

of 3 with aromatic aldehydes 4-methoxybenzaldehyde, 4-

 42

dimethylaminobenzaldehyde, 4-nitrobenzaldehyde and benzaldehyde, under reflux

in ethanol yielded the carbohydrazides (4-7) [20] according to the procedures

described in literature for similar compounds.

All novel compounds and isolated compound were characterized by their

spectral data (1H and 13

C NMR). The 1H NMR spectra of carbohydrazides 4-7

showed signals at H 8.40 integrating for one proton, and at H 6.70–9.00,

corresponding to the imine and aromatic hydrogens, respectively, of the

(substituted-benzylidene) carbohydrazide group. The presence of this group was

confirmed by the signals at C 147–150 (C=N), 158–162 (C=0), and d 110–135

(aromatic carbons of R group) in the 13C NMR spectra.

3.2. Effects of oral MEST on carrageenan-induced paw oedema and increase in

MPO activity

The injection of carrageenan in the paw induced an oedema that started at

30 min and peaked at 2 h (Fig. 1A). The oral treatment with MEST (100 and 300

mg/kg) significantly inhibited oedema formation. The inhibitions were of 33 ± 9%

and 34 ± 6% at doses of 100 and 300 mg/kg, respectively (Fig., 1A and B).

Moreover, our results showed that the MEST at dose of 300 mg/kg, presented its

significant inhibition 2 h after its administration as indicated by the time course

analysis (Fig.1A). In addition, the inhibition observed in dexamethasone-treated

group was 41 ± 5% after 2 h of the injection of carrageenan in the paw (Fig.1A).

The injection of carrageenan (300 µg/paw) not increase MPO activity after 6

hours, therefore the oral treatment with MEST (100 and 300 mg/kg) did not alter

the increasing of MPO activity induced by carrageenan. The positive control

 43

(Dexametasone) was able to induce inhibitory activity in MPO analysis when

compared to control group (Fig.1C).

3.3. Effect of oral and intraplantar administration methyl gallate on carrageenan-

induced paw oedema and increase in MPO activity

In carrageenan-induced paw oedema experiment, the oral administration of

methyl gallate (100 and 300 mg/kg) showed inhibitory properties in oedema

formation. The inhibitions were of 43 ± 9% and 58 ± 5% at doses of 100 and 300

mg/kg, respectively (Fig. 2A). Dexamethasone inhibited oedema formation (51 ±

4%) at 2h after inflammatory stimulus (Fig. 2A). Animals treated with intraplantar

injection methyl gallate (10 and 100 g/paw), the inhibition were of 34 ± 2% and 39

± 8%, respectively (Fig. 2C). The injection of Cg (300µg/paw) did not increase

MPO activity oral treated with methyl gallate (100 and 300 mg/kg) and treated with

intraplantar methyl gallate (10 and 100 g/paw) compared with the paws of the

animals treated control group (Fig. 2B and 2D).

3.4. Effects of oral administration carbohydrazydes compounds (3-7) on

carrageenan-induced paw oedema and increase in MPO activity

The oral treatment of the animals with compounds (3-6) significantly

inhibited the oedema formation in about 67 ± 6%, 63 ± 9%, 61± 3% and 47 ± 10%,

respectively for dose of 100 mg/kg (3, 4, 5 and 6). The injection of Cg (300

g/paw) increased the MPO activity compared with the paws of animals treated
 44

only with saline (Fig. 3B). The compound 4, but not 3, 5 and, 6, was able to inhibit

significantly 33 ± 4% the MPO activity with dose of 100 mg/kg (Fig. 3B).

The oral administration of compound 7 did not interfere with oedema nor

with MPO activity induced by carrageenan (results not shown).

3.5. Effects of intraplantar administration compounds carbohydrazides (3-7) on

carrageenan-induced paw oedema and increase in MPO activity

The local treatment with compounds (3-7), specially 4, 5 and 6 (but not 7)

were also capable of reducing the oedema induced by carrageenan. The inhibition

were of 58 ± 5%, 34 ± 5% and 31 ± 5% at doses of 10 g/paw, respectively

(Fig.4A). The 3, 4 and 6 was able to inhibit significantly (62 ± 5%, 37 ± 5% and 45

± 4%) the MPO activity with dose 10 g/paw (Fig. 4B).

The intraplantar administration of 7 did not interfere with oedema or with

MPO activity induced by carrageenan (results not shown).

3.6. Effects of compounds carbohydrazides (3-4) on carrageenan-induced pleural

cell migration and protein exudation

The compounds 3 and 4 showed marcant efficacy in mouse paw oedema,

then It was decided to test only this two compounds in the pleurisy model.

The results were expressed as leukocytes x107 and plasma leakage in mg

of proteins/mL (Fig. 5). Administration of carrageenan to the pleural cavity of the

animals induced an increase in total leukocyte numbers (Fig. 5A), and an increase

in protein extravasation (Fig. 5B) 4 h after injection. Compounds 3 and 4, given by

i.p. route, significantly reduced the increase in total leukocytes (inhibition of 50 ±

 45

5% and 73 ± 9%, respectively) and also reduced the rise in protein levels

(inhibition of 100% and 82 ± 9% respectively) induced by carrageenan in the

pleural cavity (Fig. 5B). The subcutaneous administration of the dexamethasone

(1.0 mg/kg, s.c.) 1 h before Cg also reduced the increase in total leukocytes

(inhibition of 83 ± 10%), and protein levels (100%) induced by carrageenan in the

pleural cavity.

4. Discussion

In this present study, we demonstrate that extract and the methyl gallate

obtained from Schinus terebinthifolius Raddi a plant popularly used against

inflammatory diseases in several countries, including Brazil, were able to reduce

the inflammation in mice, after oral administration. Furthermore, the anti-

inflammatory effect of the crude extract could be associated with high levels of

methyl gallate, and also found in other plants, the family Aceraceae such as , Acer

rubrum L, Acer saccharinum L, Acer saccharum Marsh [21], and also found in

other plants, such as Paeonia lactiflora [22], Cercis chinensis [23], Toona sinensis

[24] and Caesalpinia ferrea MART [25].

There has been considerable interest in the development of novel

compounds with anti-inflammatory activities. A chemical investigation of

interactions between organisms has led to the isolation and identification of

biologically active principles. Some of the biologically active natural products have

served as leads to the discovery and development of commercialized

medicaments.
 46

The anti-inflammatory activity of S. terebinthifolius and methyl gallate were

evaluated in carrageenan induced inflammation in mice paw, but the efficacy of

two products were only limited in inhibiting oedema formation. Previous studies

from others researches showed that extracts from S. terebinthifolius exhibit

antibacterial and antifungal activity [26-28]; anticancer activity [29]; antiulcer

activity [30]; wound healing properties [31-33]; antioxidant properties [34] . Methyl

gallate obtained from Lithrea molleoides (Vell.) Engl. (from the same family of S.

terebinthifolius) showed an anti-inflammatory activity in carrageenan-induced paw

edema and in TPA-induced ear edema corroborating with our results [35].

Researchers have shown that the constituent from ethyl fraction obtained from S.

terebinthifolius may be responsible by inhibition of 80% of the histamine-induced

oedema probably was methyl gallate. In the same study it was tested the methyl

gallate at concentration of 100 µg/mL in rat peritoneal cells in vitro inhibited the

inflammatory activity of C48/80 compound [12]. Another studies showed that the

ability of extract of S. terebinthifolius in inhibiting fosfolipase A2 in pig pancreas

could be associated by the presence of tripernes in this specie [36]. Previous

results from our group have showed that the oral administration of essential oil

from fruits of S. terebinthifolius (100-200 mg/kg) inhibited carrageenan-induced

oedema in rats, inflammatory parameter in air pouch models, and CFA-induced

inflammation [37]. Preparations obtained from S. terebinthifolius are continuously

self-administered as a phytomedicine, an example is the Brazilian phytotherapic

Kronel (Hebron industries) used as antibacterial, anti-inflammatory, wound

healing agents against gynecologic infections. Nevertheless, the anti-inflammatory

effects of extract of S. terebinthifolius have never been described. Thus, this is the

first study showing that oral extract of S. terebinthifolius administration and also
 47

oral or topical administration of methyl gallate reduces the oedema induced by

local inflammation in mice, suggesting that this fenolic compound is the main

responsible for the antiedematogenic effects popularly attributed to S.

terebinthifolius. [33]

Methyl gallate have been demonstrated to possess activity antitumor [38],

antibacterial [39], antiviral [40], analgesic [41] , anti-inflammatory [20] among

other. Several examples of the chemical modification of such natural products

yielding new medicaments are made some examples are roscovitin, derived from

olomucin obtained from Raphanus sativus L. (Brassicaceae). Roscovitin is in

clinical phase but is a promisse of natural product compound with possess potent

effect in inhibition of protein kinases to treatment of câncer and glomerulonefritis

[42]. As classical examples about natural products as molecules leads are

Salicilates obtained from Salix alba guinding the discovery of Aspirin® in 1897

[43]. Procaine and benzocaine (local anethesics) obtaned by the derivatization of

cocaine from Erythroxylon coca [44]. Then, as methyl gallate exhibit several

activities it was a good choice as a natural products as leads in structural

modification studies yielding new anti-inflammatory agents. In the present study,

the results showed the description of new five derivatives, 3,4,5-trihydroxypheny-

N’-(substituted-benzylidene)-1-carbohydrazides. A single oral dose of compound

3, 4, 5 and 6 (100 mg/kg), but not compound 7 (100 mg/kg), inhibited the

carrageenan-induced oedema in mice paw. Compound 4 (100 mg/kg) reduced the

carrageenan-increased of myeloperoxidase activity showing evident advantages

above the methyl gallate original structure. When local application occur, methyl

gallate (10-100 g/paw), Compound 4, 5, and 6 (all at 10 g/paw) inhibited the

carrageenan-induced oedema and compound 3, 4 and 6 (10 g/paw) decrease the

 48

MPO activity. To investigate if methyl gallate derivatives induced anti-

inflammatory effects in another model of experimental inflammation, 4 and 3 were

tested in pleurisy model inducing inhibition of inflammatory parameters like

leukocyte migration and protein extravazation. The relative acidity of the amide

hydrogen, as well as its capacity for stabilizing free radicals give these compounds

the ability of mimicking the bis-allylic moiety of unsaturated fatty acids and amides

like, that is, arachidonic acid.

Inflammation is, in some cases, could be a chronic condition that must be

daily treated with anti-inflammatory drugs in chronic inflammatory diseases like

rheumatic arthritis (RA). Although the current clinical practice lowering

inflammation as a priority for people suffering from RA, the efficiency of the

pharmacological treatment is reduced by absence of satisfactory responses that

may be related to adverse effects [45]. At least to our known, this is the first study

showing that preparations obtained from S. terebinthifolius, and the methyl gallate,

are able to cause inflammation reduction in mice. Methyl gallate is not the only

active compound, but it showed activity and certainly contributes to anti-

inflammatory effect of crude extract. Also, these observations from anti-

inflammatory activities of S. terebinthifolius extracts and methyl gallate have been

guiding for the development of new methyl gallate derivatives that possess

marcant anti-inflammatory activities.

 49

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 53

Legends to figures

Figure 1 – Effect of oral administration of MEST on carrageenan-induced paw

oedema in mice. Animal received MEST (100 or 300 mg/kg, p.o.), dexamethasone
(DEX – 1 mg/kg, s.c) or vehicle and after 1 h, an intraplantar injection of
carrageenan (300 g/paw) was performed. In (A), the time course of the inhibition
induced by 300 mg/kg MEST and DEX is shown. In (B), bars show the effect of
different doses of MEST and DEX in paw oedema (m) 2 h after carrageenan
injection. In (C), the not inhibition induced by MEST in increasing of
myeloperoxidase (MPO) activity induced by local injection of carrageenan. The
bars express the mean ± SEM of 5 animals, compared with vehicle (V) vs treated
group. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, one-way ANOVA followed by Student-
Newman-Keuls.

Figure 2 – Effect of methyl gallate (compound 2) on carrageenan-induced paw

oedema in mice. Animal received the oral treatment compound 2 (100 and 300
mg/kg, p.o.), dexamethasone (DEX – 1 mg/kg, s.c) or vehicle and after 1 h, an
intraplantar injection of carrageenan (300 g/paw) was performed. In (A), bars
show the effect of different doses of compound 2 and DEX in paw oedema (m)
2h after carrageenan injection. In (B), the not inhibition induced by compound 2 in
increasing of myeloperoxidase (MPO) activity induced by carrageenan. In (C),
bars show the effect of different doses of intraplantar injection of compound 2 (10
and 100 µg/paw), DEX in paw oedema (mm) 2 h after carrageenan injection. In
(D), the not inhibition induced by compound 2 in increasing of MPO activity
induced by local injection of carrageenan. The bars express the mean±SEM of 5
animals, compared with vehicle (V) vs treated group. *P<0.05, **P<0.01,
***P<0.001, one-way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls.

Figure 3 – Effect of compounds 3, 4, 5 and 6 on carrageenan-induced paw

oedema in mice. Animal received the oral treatment compounds 3, 4, 5 and 6 (100
mg/kg, p.o.), dexamethasone (DEX – 1 mg/kg, s.c) or vehicle and after 1h, an
intraplantar injection of carrageenan ( 300 μg/paw) was performed. In (A), bars
 54

show the effect of compounds 3, 4, 5 and 6 and DEX in paw oedema (m) 2h after
carrageenan injection. In (B), the inhibition induced by compound in increasing of
myeloperoxidase (MPO) activity induced by local injection of carrageenan. The
bars express the mean±SEM of 5 animals, compared with vehicle (V) vs treated
group. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, one-way ANOVA followed by Student-
Newman-Keuls.

Figure 4 - Effect of compounds 3, 4, 5 and 6 on carrageenan-induced paw

oedema in mice. Animal received the local treatment with compounds 3, 4, 5 and 6
(10 ug/paw), dexamethasone (DEX – 1 mg/kg, s.c) or vehicle and after 1h, an
intraplantar injection of carrageenan (300 μg/paw) was performed. In (A), bars
show the effect of different compounds derived from Compound 2 and
dexamethasone in paw oedema (m). 2h after carrageenan injection. In (B), the
inhibition induced by compound in increasing of myeloperoxidase (MPO) activity
induced by local injection of carrageenan. The bars express the mean±SEM of 5
animals, compared with vehicle (V) vs treated group. *P<0.05, **P<0.01,
***P<0.001, one-way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls.

Figure 5 – Effects of Compound 4 and Compound 3 on total leukocytes (A) and

protein extravasation (B) induced by carrageenan in the pleural cavity of mice.
Animal received the intraperitoneal treatment compounds derived from gallic acid
(10 mg/kg), or vehicle, and after 1 h they received an intrapleural injection of Cg
(100 ul of a 1% solution/cavity). Control animals received only the vehicles.
Animals were killed after Cg injection. The bars express the mean ± SEM of 5
animals, compared with vehicle (V) vs treated group. *P<0.05, **P<0.01,
***P<0.001, one-way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls.
 55

O
O O
HO
OH HO HO
a OCH3 b NHNH2
c
HO
HO HO
OH
OH OH
(1)
(2) (3)

O
R
HO N
N
H H
HO
OH

(4-7)

Scheme 1. Reagents and conditions: (a) CH3OH, H2SO4, reflux, 48 h; 85%. (b)

NH2NH2.H2O, EtOH, reflux, 48 h; 74%. (e) RCHO, EtOH, H2SO4 (cat), reflux, 36 h;

74-80%.
 56

Figures

Fig. 1

Iriguchi et al., 2012

A B
850 1000
Paw oedema (m)

* * * **
500
425 *
Vehicle
MEST 300 mg/kg
DEX 1mg/kg 0
0
0 1 2 3 4 Vehicle 100 300 1 mg/kg
Time (h) after carrageenan injection MEST (p.o) DEX (s.c.)
(300g/paw) 2 hours after carrageenan (300g/paw)
C
1.0
Activity of MPO (D.O)

0.5 ***

0.0
Vehicle 100 300 1 mg/kg
MEST (p.o) DEX (s.c.)
2 hours after carrageenan (300g/paw)
 57

Fig. 2

Iriguchi et al., 2012

A B
1.5
1000

Activity of MPO (D.O)

Paw oedema (m)

800
1.0
600 **
** *
400 **
0.5
200

0 0.0
Vehicle 100 300 1 mg/kg Vehicle 100 300 1 mg/kg
Compound 2 (p.o) DEX (s.c.) Compound 2 (p.o) DEX (s.c.)
2 hours after carrageenan (300g/paw) 6 hours after carrageenan (300g/paw)

C D
1000 1.5
Activity of MPO (D.O)
Paw oedema (m)

800
1.0
600 * *
400
**
0.5
**
200

0 0.0
Vehicle 100 300 1 mg/kg
Vehicle 10 100 1mg/kg Compound 2 (p.o) DEX (s.c.)
Compound 2 (g/paw) DEX (s.c.)
2 hours after carrageenan (300g/paw) 6 hours after carrageenan (300g/paw)
 58

Fig. 3

Iriguchi et al., 2012

A
1000
Paw oedema (m)

800

600 ***
***
400 *** ***
***
200

0
Vehicle 3 4 5 6 DEX
(100 mg/kg, p.o.) (1 mg/kg, s.c.)
2 hours after carrageenan (300g/paw)

B
1.5
Activity of MPO (D.O)

1.0

*
0.5 ***

0.0
N V 3 4 5 6 DEX
(100 mg/kg, p.o.) (1 mg/kg, s.c.)
6 hours after carrageenan (300g/paw)
 59

Fig. 4

Iriguchi et al., 2012

A
1000
Paw oedema (m)

800
** *
600
***
400 ***
200

0
Vehicle 3 4 5 6 DEX
(10 g/paw) (1 mg/kg, s.c.)
2 hours after carrageenan (300g/paw)

B
2.0
Activity of MPO (D.O)

1.5

1.0 *
**
***
0.5 ***

0.0
N V 3 4 5 6 DEX
(10 g/paw) (1 mg/kg, s.c.)
6 hours after carrageenan (300g/paw)
 60

Fig. 5

Iriguchi et al., 2012

A
3
X 107 cells/cavity
Leucocytes

*
*
1

0
N V 4 3 DEX
(10 mg/kg, i.p) (1mg/kg,s.c)

Carrageenan (1%)

B
1.5
Proteins (mg/mL)

**
1.0 **
***

0.5

0.0
N V 4 3 DEX
(10mg/kg, i.p) (1mg/kg, s.c)

Carrageenan (1%)