UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

CARACTERIZAÇÃO DE UMA POSSÍVEL PROTEÍNA EFETORA DE

CERATOCYSTIS CACAOFUNESTA

ALINE LOPES D’AMATO

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Maio de 2022
 ALINE LOPES D’AMATO

CARACTERIZAÇÃO DE UMA POSSÍVEL PROTEÍNA EFETORA DE

CERATOCYSTIS CACAOFUNESTA

Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para obtenção do título de
Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética e

Biologia Molecular.

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Maio de 2022
 ALINE LOPES D’AMATO

CARACTERIZAÇÃO DE UMA POSSÍVEL PROTEÍNA EFETORA DE

CERATOCYSTIS CACAOFUNESTA

Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para obtenção do título de
Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética e

Biologia Molecular.

APROVADA: 31 de Maio de 2022

______________________________ _____________________________
Dr. Carlos Priminho Pirovani Dra. Claudia Fortes Ferreira
Orientador (EMBRAPA)

______________________________ _____________________________
Dra. Irma Yuliana M. Ocampo Dr. Ronan Xavier Correa
(UESC) (UESC)
 AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha avó, Elizabeth D’Amato que se dedicou e me ajudou muito

durante todo o meu mestrado;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani, por se fazer presente
e companheiro em todos os momentos presenciais e virtuais;
Aos amigos feitos dos laboratórios presentes no CBG;
Ao meu namorado Nino Sérgio, pelo carinho e apoio dentro do laboratório
como iniciação científica e no dia a dia;
Ao grupo proteômicos, que sempre me auxiliou de forma construtiva nas
pesquisas e apresentações;
A todos que contribuíram de forma direta ou indireta no trabalho;
Ao programa PPGGBM, funcionários do CBG e da UESC, pela manutenção
e auxílio durante todo o mestrado;
À CAPES–Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,
pela bolsa de estudo ofertada.
 ÍNDICE

LISTA DE TABELAS...................................................................................................... vi
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................... vii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS......................................................................... viii
RESUMO........................................................................................................................ ix
ABSTRACT..................................................................................................................... xi
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................... 4
2.1 Ceratocystis cacaofunesta..................................................................................... 4
2.1.1 Caracterização morfológica................................................................................ 5
2.1.2 Distribuição geográfica........................................................................................ 6
2.1.3 Murcha de Ceratocystis ou mal-do-facão no cacaueiro...................................... 6
2.2 Interação planta-patógeno.................................................................................. 9
2.2.1 Resistência das plantas em paralelo ao ataque patogênico............................... 10
2.2.2 Proteínas efetoras de fungos.............................................................................. 14
2.3 Ocorrência, histopatologia e perfil proteico do secretoma de C.
16
cacaofunesta.......................................................................................................
3. METODOLOGIA....................................................................................................... 18
3.1 Análises in sílico: predições da proteína candidata Cceff1................................. 18
3.2 Transformação de células em Escherichia coli................................................... 19
3.3 Expressão heteróloga em pequena escala e solubilidade.................................. 20
3.4 Indução a frio (18 °C) em grande escala............................................................. 21
3.5 Purificação por cromatografia de afinidade......................................................... 22
3.6 Purificação da fração insolúvel por extração desnaturante................................ 23
3.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE 1D)............................. 24
3.8 Determinação da concentração da proteína alvo............................................... 24
3.9 Clivagem da proteína de fusão Trx com trombina.............................................. 24
3.10 Análise por espectrometria de massas............................................................... 25
3.11 Teste de atividade da proteína candidata Cceff1................................................ 26
3.12 Teste de acúmulo de H₂O₂ da proteína candidata Cceff1.................................. 26
3.13 Dicroísmo circular (CD)....................................................................................... 27
4. RESULTADOS......................................................................................................... 28
4.1 Parâmetros computacionais e filogenéticos da proteína candidata Cceff1....... 28
4.2 Seleção das colônias por meio da transformação em E. coli............................. 33
4.3 Expressão das colônias obtendo a proteína heteróloga.................................... 34
4.4 Indução a frio da proteína rTrx-(His)6-Cceff1..................................................... 34
4.5 Purificação por íon metálico Ni2+ de afinidade.................................................... 35
4.6 Purificação por desnaturante Ureia e posterior renaturação.............................. 36
4.7 Clivagem da proteína de fusão........................................................................... 37
4.8 Identificação de peptídeos por espectrometria de massas................................. 37
4.9 Morte celular na aplicação da proteína Cceff1.................................................... 39
4.10 Produção de EROS com a proteína Cceff1........................................................ 42
4.11 Análise de Dicroísmo circular (CD)..................................................................... 43
5. DISCUSSÃO............................................................................................................ 44
6. CONCLUSÃO........................................................................................................... 57
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 58
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Propriedades físico-químicas da sequência proteica pelo Protparam e Compute

PI/MW.
Tabela 2. Confirmação da identidade da proteína de fusão rTrx-(His)6-Cceff1 por
espectrometria de massas.
Tabela 3. Confirmação da identidade da proteína clivada rCceff1 por espectrometria de
massas.

vi
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Descrição morfológica de Ceratocystis cacaofunesta isolado.

Figura 2. Doença Murcha de Ceratocystis.
Figura 3. Ciclo do mal do facão causado por Ceratocystis cacaofunesta.
Figura 4. Modelo em ziguezague do sistema imunológico da interação planta/patógeno.
Figura 5. Fusão da proteína recombinante rTrx-(His)6-Cceff1 no pET-32a.
Figura 6. Método de indução à frio em larga escala.
Figura 7. Análise por espectrometria de massas da proteína alvo.
Figura 8. Dicroísmo circular (CD).
Figura 9. Diagrama da reconstituição da proteína Cceff1 em C. cacaofunesta.
Figura 10. Dendograma incluindo a proteína Cceff1.
Figura 11. Medição da posição do peptídeo sinal e sítio de clivagem.
Figura 12. Diagrama de hidrofobicidade de Kyte & Doolittle.
Figura 13. Esquema de nível de desordem da proteína Cceff1.
Figura 14. Diagrama demonstrando o potencial de fosforilação da proteína alvo.
Figura 15. Homologia da proteína Cceff1 com domínio Alt a 1 pelo software Pfam.
Figura 16. Transformação em estirpe BL21(DE3) de E. coli.
Figura 17. Expressão heteróloga em estirpe de E. coli BL21(DE3) em SDS PAGE 12,5%.
Figura 18. Indução a frio (18°C) em estirpe de E. coli BL21(DE3) em SDS PAGE 12,5%.
Figura 19. Purificação da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 por cromatografia de afinidade líquida
em SDS PAGE 12,5%.
Figura 20. SDS PAGE 12,5 % da indução e purificação por extração da fração insolúvel da
proteína rTrx-(His)6-Cceff1 recombinante.
Figura 21. Clivagem da proteína de fusão utilizando Trombina vista em SDS PAGE 12,5 %.
Figura 22. Confirmação da identidade das proteínas recombinantes rTrx-(His)6-Cceff1 em
(A) e rCceff1 em (B) por espectrometria de massas.
Figura 23. Avaliação da ação biológica da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 a uma concentração
de 1,45 e 1,75 µmol L-1 em S. licopersicum (Micro Tom).
Figura 24. Avaliação da ação biológica da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 a uma concentração
de 2 e 3,7 µmol L-1 em S. licopersicum (Micro Tom).
Figura 25. Avaliação da ação biológica da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 a uma concentração
maior de 5 µmol L-1 em S. licopersicum (Micro Tom).
Figura 26. Avaliação da ação biológica comparando a proteína alvo fusionada e clivada em
Solanum licopersicum (Micro Tom).
Figura 27. Aumento do acúmulo de H2O2 na presença da proteína alvo fusionada a uma
concentração de 4,7 µmol L-1 em Solanum licopersicum (Micro Tom).
Figura 28. Aumento do acúmulo de H2O2 na presença da proteína alvo clivada a uma
concentração de 4,2 µmol L-1 em Solanum licopersicum (Micro Tom).
Figura 29. Espectro do dicroísmo circular da proteína rCceff1.
Figura 30. Teste comparativo de 48 horas com proteína clivada em 25°C e esquentada a
85°C por banho-maria, ambas em concentração 1,5 µmol L-1.

vii
 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

A: Ampere ng: Nanogramas

m: Nanômetros OD600: densidade óptica a 600 ƞm

DAB: 3-3’ diaminobenzidina pH: Potencial de hidrogênio

DTT: Dithiothreitol PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonil

(inibidor de protease)
IAA: Iodoacetamida
rpm: Rotação por Minuto
IPTG: Isopropil beta-D-
Tiogalactosídeo SDS: Sodium dodecyl sulfate/
Dodecil sulfato de sódio
kDa: Quilodalton
SDS-PAGE: SDS- polyacrylamide
LB: Luria Bertani gel electrophoresis/ eletroforese em
gel de poliacrilamida com SDS
µmol L-1: 10-6 molar (mol/L)
Trx: Tiorredoxina
mg: Miligramas
μg: Microgramas
mL: Mililitros
μL: Microlitros
MM: Marcador Molecular

viii
 RESUMO

D’AMATO, Aline Lopes, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Maio
de 2022. Caracterização de uma possível proteína efetora de Ceratocystis
cacaofunesta. Orientador: Carlos Priminho Pirovani. Coorientadora: Ariana Silva
Santos. Coorientador: Eric Roberto Guimarães R. Aguiar.

O fruto do cacaueiro tem grande importância como fonte de matéria prima para a
indústria do chocolate e outros derivados. Mas grandes perdas por doenças
fúngicas são constantemente presenciadas, como a murcha de Ceratocystis,
causada pelo fungo Ceratocystis cacaofunesta, pertencente ao complexo
Ceratocystis. Esse fitopatógeno coloniza o sistema vascular do cacaueiro e
prejudica o fluxo no xilema de tal modo que ocasiona a morte da planta
hospedeira. Nos últimos tempos, biomoléculas como proteínas efetoras,
secretadas por patógenos com o intuito de manipular a fisiologia do hospedeiro,
têm sido caracterizadas por apresentarem relação com a infecção. Dessa forma,
o objetivo foi a caracterização de uma potencial proteína efetora identificada no
secretoma do fungo C. cacaofunesta, anotada como hipotética nos bancos de
dados. A sequência completa da proteína alvo foi identificada a partir do
alinhamento de uma região do genoma de C. cacaofunesta com a sequência das
ORFs disponíveis no banco de transcritos de C. platani. Análises in silico
revelaram na proteína Cceff1 a presença de peptídeo sinal, com sítio de clivagem
predita MAA-AV entre os aminoácidos 19 e 20; tendência à hidrofilia; 54 dos
aminoácidos desordenados; 34 sítios de fosforilação; localização extracelular,
incluindo parede celular; e homologia como domínio AltA1, típico de alérgenos
fúngicos. A ORF sintética, excluindo a região do peptídeo sinal, com códons
otimizados para expressão em Escherichia coli (Biomatik), inserida nos sítios Nde
I/Xho I do vetor pET-32a, foi utilizada para transformação da estirpe BL21(DE 3). A
proteína de fusão com as “tags” de Trx e His foi induzida, purificada, dialisada e
quantificada para clivagem com a protease Trombina para remoção das “tags”. A
identidade tanto da proteína recombinante fundida de 40 kDa quanto da proteína
clivada com 26 kDa foram confirmadas por meio de análises por espectrometria

ix
de massas. Testes com Solanum licopersicum variedade Micro Tom foram
realizados por meio de micro spray com a proteína recombinante fundida desde
1,45 a 5 µmol L-1 e a proteína clivada a 4,2 µmol L-1. As folhas apresentaram
secamento das bordas e morte celular a partir de 48 h. Houve acúmulo de
espécies reativas de oxigênio com a proteína clivada e a proteína marcada com
Trx. A análise de dicroísmo circular (DC) mostrou estabilidade térmica da proteína
clivada e espectro compatível com a presença de estruturas secundárias. Nesse
sentido, a caracterização proteica desse potencial efetor irá abrir novas
possibilidades para intervenção biotecnológica.

Palavras-chave: Ceratocystis cacaofunesta, fungo, proteína efetora, proteômica,

cacaueiro.

x
 ABSTRACT

D’AMATO, Aline Lopes, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Maio
de 2022. Characterization of a possible effector protein of Ceratocystis
cacaofunesta. Advisor: Carlos Priminho Pirovani. Advisor Committee Members:
Ariana Silva Santos and Eric Roberto Guimarães R. Aguiar.

The cacao fruit is of great importance as a source of raw material for the chocolate
and other derivatives industry. But large losses due to fungal diseases are
constantly witnessed, such as Ceratocystis wilt, caused by the fungus Ceratocystis
cacaofunesta, belonging to the Ceratocystis complex. This phytopathogen
colonizes the vascular system of cacao and impairs the flow in the xylem in such
a way that it causes the death of the host plant. In recent times, biomolecules such
as effector proteins, secreted by pathogens to manipulate the physiology of the
host, have been characterized as being related to infection. Thus, the objective
was to characterize a potential effector protein identified in the secretome of the
fungus C. cacaofunesta, noted as hypothetical in the databases. The complete
sequence of the target protein was identified from the alignment of a region of the
genome of C. cacaofunesta with the sequence of ORFs available in the transcripts
bank of C. platani. In silico analysis revealed the presence of a signal peptide in
the Cceff1 protein, with a predicted MAA-AV cleavage site between amino acids
19 and 20; 54 of the disordered amino acids; 34 phosphorylation sites; extracellular
localization including cell wall; and homology with the AltA1 domain, typical of
fungal allergens. The synthetic ORF, excluding the signal peptide region, with
codons optimized for expression in Escherichia coli (Biomatik), inserted into the
Nde I/Xho I sites of the pET-32a vector, was used to transform the BL21(DE3)
strain. The fusion protein with the Trx and His tags was induced, purified, dialyzed
and quantified for cleavage with the protease Thrombin to remove the tags. The
identity of both the fused 40 kDa recombinant protein and the 26 kDa cleaved
protein were confirmed by mass spectrometry analyses. Tests with Solanum
licopersicum variety Micro Tom were performed by means of micro spray with the

xi
recombinant protein fused from 1.45 to 5 µmol L-1 and with the protein cleaved at
4.2 µmol L-1. The leaves showed drying of the edges and cell death after 48 h.
There was an accumulation of reactive oxygen species with the cleaved protein
and the protein labeled with Trx. Circular dichroism (DC) analysis revealed thermal
stability of the cleaved protein and a spectrum compatible with the presence of
secondary structures. In this sense, the characterization of this possible effector
will open new possibilities for biotechnological intervention.

Keywords: Ceratocystis cacaofunesta, fungus, effector protein, proteomic, cacao.

xii
1. INTRODUÇÃO

O gênero Ceratocystis engloba fungos do filo Ascomycota que infectam

diversas plantas no mundo. A disseminação desse gênero abrange as Américas,
Ásia e África (ENGELBRECHT, 2004). Essencialmente, plantas lenhosas têm
seus tecidos foliares invadidos por espécies de Ceratocystis e ocasionalmente
seus xilemas são obstruídos, apresentando como consequência seca e morte
progressiva (BAKER; HARRINGTON, 2004). Segundo análises, uma vez em que
há poucas diferenças morfológicas entre as espécies desse gênero de fungo, a
base de explicação é a evolução e divergência genética de espécies de
Ceratocystis (FERREIRA, 2009).
No Brasil, esses fungos patogênicos apresentam três espécies altamente
disseminadas, C. fimbriata, C. paradoxa e C. cacaofunesta (FIRMINO et al.,
2016). O fungo Ceratocystis cacaofunesta Engelbr. & T.C. Harr. (Engelbrecht &
Harrington, 2005), causa a doença Murcha de Ceratocystis no cacaueiro
(Theobroma cacao L.) exprimindo ampla relevância no âmbito socioeconômico.
Esse fungo extrai nutrientes seja antes ou durante a colonização e estabelece sua
infecção na planta por penetração direta através de ferimentos. Em um curto prazo
de tempo, sem transporte de água e nutrientes, a árvore inteira murcha e
apresenta morte súbita, indicando que o período entre os sintomas e a morte é
rápido (AMBROSIO et al., 2013; CABRERA et al., 2016).
Na interação planta-patógeno, muitos fungos parasitas, incluindo
estratégias necrotróficas, biotróficas ou hemibiotróficas, estabelecem a
proliferação e, posterior colonização das plantas. Nesse cenário, fitopatógenos
podem elicitar a imunidade desencadeada por patógeno (PTI) e lidar com a
resposta do vegetal; evitar a eliciação por meio do sequestro dos oligômeros do
patógeno que atuam como elicitor para a defesa da planta ou até mesmo suprimir
a imunidade inata da planta (LO PRESTI et al., 2015).
A respeito disso, o grupo de enzimas protease tem sido caracterizadas
em secretomas de fungos fitopatógenos. Diversas pesquisas revelam relação
entre a síntese dessas enzimas com a degradação da parede celular vegetal
facilitando a penetração e colonização dos hospedeiros. Além desse papel, as
proteases de fungos fitopatógenos com propriedades únicas e representadas em
maior parte pelas serino proteases, corroboram com o desenvolvimento

1
patogênico de fungos com a formação de estruturas infecciosas e adesão às
células hospedeiras, além de serem propostas como possíveis efetores (BROWN
et al., 2001; CHANDRASEKARAN et al., 2016).
Vários trabalhos mostraram correlação entre a atividade proteolítica e o
estabelecimento da doença entre fungos que acometem plantas. A revisão de
Chandrasekaran et al. (2016) contou com relatos como a protease extracelular
Cc155 como fator de virulência significativo de Colletotrichum coccodes por meio
da remoção por mutagênese converteu o patógeno virulento em um endófito não
patogênico (REDMAN; RODRIGUEZ, 2002); outra pesquisa abordou a subtilisina
fúngica AsES de Acremonium strictum com atividade elicitora extracelular
fundamental na indução de resposta de defesa do hospedeiro, incluindo morte
celular e acúmulo de EROS. Quando inibida com PMSF, a enzima proteolítica não
induziu resistência (CHALFOUN et al., 2013).
Ademais, como importante aspecto desse duelo bioquímico e fisiológico,
os fungos fitopatogênicos, incluindo a espécie C. cacaofunesta, exibem um
conjunto de mecanismos e moléculas manipuladoras. De acordo com Kamoun
(2006), sem dúvidas, as proteínas efetoras representam as principais
macromoléculas biológicas dedicadas à manipulação da estrutura e função da
célula hospedeira. Elas são sintetizadas com o intuito de alterar as funções
celulares de suas plantas hospedeiras, suprimir a percepção imune da planta,
bem como proteger o fungo permeando a infecção e guarnecendo meio propício
para o término de seu ciclo de vida (TORUÑO et al., 2016).
Como exemplo principal de proteínas manipuladoras, as proteínas
conservadas pertencentes à família da proteína cerato-platanina (CPP), presente
apenas em fungos filamentosos ou fungos com o crescimento de pseudo-hifa, são
importantes na interação patogênica. A efetora atua como eliciadora de resposta
de defesa gerando necrose do tecido vegetal e outros aspectos caracterizados
(GADERER et al., 2014). Ademais, homólogos de CPP foram identificados em
mais de 50 genomas de fungos incluindo os fitopatógenos Botrytis cinerea,
Magnaporthe grisea, Heterobasidion irregulare e Moniliophthora perniciosa com
dados experimentais indicando papel durante interação fungo-planta (BACCELLI,
2015).
A Cerato-platanina (CP) identificada em Ceratocystis fimbriata f. sp.
platani, com localização na parede celular atesta atividade indutora na síntese de

2
fitoalexina e/ou morte celular vegetal atuando como uma provável eliciadora de
respostas de defesa das plantas (BODI et al., 2004). O trabalho de Pazzagli et al.
(2009) evidenciou que a CP de Ceratocystis platani, hidrofóbica, secretada, com
resíduos de cisteína conservados tem atividade de fitotoxina, atua como efetora e
forma agregados ordenados em sua estrutura que interagem com superfícies
hidrofóbicas e aumentam a resposta de hipersensibilidade vegetal, sugerindo forte
envolvimento na interação hospedeiro-patógeno.
Já como exemplificação de C. cacaofunesta, o trabalho de Molano et al.
(2018) por meio de uma comparação recente do genoma de C. cacaofunesta e C.
fimbriata e busca de potenciais efetores usando parâmetros de acordo com
Klosterman et al. (2011) e de sinal de ligação entre proteínas secretadas
conseguiu identificar potenciais genes candidatos a efetores do proteoma de C.
cacaofunesta. Foi revelado proteínas relacionadas com presença na parede
celular, proteínas que poderiam induzir respostas vegetais (alérgeno Asp), que
poderiam estar envolvidas na resistência às respostas das plantas, como estresse
oxidativo (proteína da família oxigenase 2og-fe) e assim elucidando futuros
estudos funcionais.
Portanto, levando em conta a doença Murcha de Ceratocystis que
acomete o cacaueiro de inúmeras fazendas da América do Sul com genótipos de
cacau suscetíveis à doença, como o CCN-51 (PALADINES-REZABALA et al.,
2022) e a constante e crescente busca por agentes de biocontrole para controlar
fungos fitopatogênicos e induzir resistência natural em plantas contra esses
organismos (GOMES et al., 2016), bem como todos os tópicos supracitados, o
presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização de uma possível
proteína efetora do fungo C. cacaofunesta.
Os objetivos específicos foram predizer as características bioquímicas do
potencial efetor mediante análises de bioinformática e comparar in sílico com
outros efetores caracterizados; produzir e validar a proteína candidata em
laboratório a partir da transformação, expressão e purificação; confirmar por
espectrometria de massas a identidade da proteína expressa; investigar a
atividade bioquímica e fisiológica da proteína candidata por meio de bioensaios;
avaliar a produção de peróxido de hidrogênio e verificar a estabilidade do
candidato a efetor proteico clivado por dicroísmo circular em diferentes condições
de temperatura.

3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Ceratocystis cacaofunesta

A princípio, a espécie Ceratocystis fimbriata era descrita como patógeno

de diversas plantas lenhosas com aproximadamente 31 espécies de plantas
representando 14 famílias vegetais hospedeiras incluindo o Theobroma cacao.
Contudo, Baker et al. (2003) conduziram experimentos de inoculação e
propuseram que as populações locais de C. fimbriata se especializaram em um
ou mais hospedeiros influenciando em espécies nascentes com genótipos
especializados e tiveram propagação para novas áreas por humanos.
A partir das análises das sequências de rDNA-ITS, foi identificado
variações genéticas substanciais em algumas linhagens e interesterilidade com
outros membros dentro do clado latino-americano de C. fimbriata (BAKER et al.
2003), e em 2005, Engelberecht e Harrington descreveram o patógeno do
cacaueiro como uma nova espécie, Ceratocystis cacaofunesta. Nesse cenário,
foram encontradas diferenças morfológicas em explorações comparativas acerca
do tamanho da base do peritécio, da configuração dos esporos sexuais e da
presença ou ausência de conídios doliformes, estruturas assexuadas que
asseguram a disseminação do organismo (ENGELBERECHT; HARRINGTON,
2005).
Logo, o fungo C. cacaofunesta pertencente ao filo Ascomycota e subfilo
Pezyzomycotina foi agrupado no complexo de Ceratocystis fimbriata, que engloba
outras espécies de fitopatógenos como exemplo o Ceratocystis platani que
acomete a cultura do Sicômoro (ENGELBRECHT & HARRINGTON, 2005). O
complexo de espécies crípticas Ceratocystis com distribuição mundial inclui
fungos que penetram os tecidos hospedeiros por meio de ferimentos nos tecidos
lenhosos da planta e, por conseguinte, colonizam o sistema vascular presente em
plantas o que acaba por danificar o metabolismo vegetal e ocasionar sua murcha
e, posterior morte (VAN WIK, M. et al., 2010).

4
2.1.1 Caracterização morfológica

A partir do isolamento do holótipo no Brasil proveniente de Theobroma

cacao doente, Engelbrecht & Harrington (2005) descreveram as estruturas
morfológicas do fungo Ceratocystis cacaofunesta indicando que seus corpos de
frutificação do tipo peritécio são superficiais ou embutidos no substrato, com suas
bases marrom-escuras a pretas, globosas, apresentando 95–305 µm de largura
por 100–275 µm de altura e com haste marrom escuro a preto, reto, 310–1010 µm
de comprimento por 20–45 µm de largura na base e 12–25 µm de largura na
ponta. As suas hifas ostiolares foram anotadas como marrom-claras a hialinas,
não septadas, com paredes lisas e 30-125 µm de comprimento. Por sua vez, os
esporos sexuais chamados de ascósporos são hialinos, unicelulares e com 4,5–
6,5 µm de comprimento por 3,5–5,5 µm de largura e 3,0–4,0 µm de altura e se
acumulam em uma cor creme na haste do peritécio.
Em relação às estruturas responsáveis pela reprodução assexual, o fungo
apresentou seu endoconidióforo surgindo lateralmente de hifas vegetativas,
septado, com 40–295 µm de comprimento incluindo as células basais, 2,0–8,0 µm
de largura na base e, em adicional, os endoconídios doliformes cilíndricos e
unicelulares revelaram ser hialinos a marrom-claros, lisos e produzidos a partir
das células conidiogênicas denominadas fiálides nascidas próximo à base do
peritécio, sendo estas hialinas a marrom-claras. Já o aleurioconidióforo surge na
lateral do micélio, com 0–13 septos e com aleurioconídios marrons, globosos a
piriformes, de forma isolada ou em cadeias curtas (Figura 1).

Figura 1. Descrição morfológica do fungo Ceratocystis cacaofunesta isolado. a. Peritécio. b. Hifas

ostiolares. c. Ascósporos. d. Endoconidióforo cilíndrico. e. Endoconídios cilíndricos. f.
Aleuroconidióforo e aleuroconídios (ENGELBRECHT & HARRINGTON, 2005).

5
2.1.2 Distribuição geográfica

A incidência do gênero Ceratocystis foi dividida por três complexos, norte-

americano, latino-americano e asiático. A espécie hospedeira específica C.
cacaofunesta, a qual é adaptada para infectar o cacaueiro, foi claramente
reconhecida no clado da América latina (WOOD & LASS 2001). O agente causal
da Murcha de Ceratocystis teve seu primeiro relato em 1918 no Equador (RORER,
J. B. 1918). Em um primeiro momento, a doença não foi de grande relevância pois
a variedade de Theobroma cacao prevalente no Equador era resistente (BAKER
et al. 2003).
Contudo, em 1957, foi relatado por Desrosiers (1957), na Estação de
pesquisa de Pichilinque no Equador, uma forma mais virulenta do C. cacaofunesta
em variedades Crioulo de cacau (ARBELAEZ, 1957). A partir disso, ao longo dos
anos a doença foi relatada em diversos países da América do Sul como a
Colômbia, Brasil, Guiana, Peru, Trinidad e Tobago e Venezuela; na América
Central como a Costa Rica, Guatemala e México e na ilha caribenha do Haiti;
afetando inúmeras árvores de cacau e demonstrando a rápida propagação do C.
cacaofunesta (THOROLD 1975; WOOD & LASS 2001). Atualmente caracteriza-
se como uma das doenças emergentes do cacau na América central e do Sul
(ENGELBRECHT et al. 2007a).
No Brasil, o fungo foi identificado em 1978 na região amazônica
(BASTOS, 1978) encontrado em Rondônia. Na Bahia região que está fora da área
de distribuição nativa de T. cacao (ENGELBRECHT; HARRINGTON, 2007a), o
fungo foi constatado em 1997 em mudas por enxertia (BEZERRA, 1997) e em
1998 em plantas adultas (BEZERRA et al., 1998). Os isolados da Bahia tem sua
provável disseminação advinda de Rondônia, visto que a doença apareceu em
uma estação experimental baiana (BEZERRA, 1997) operada pela mesma
agência da estação experimental rondoniana.

2.1.3 Murcha de Ceratocystis ou mal-do-facão no cacaueiro.

O fungo C. cacaofunesta é o agente causal da Murcha de Ceratocystis,

uma doença que acomete a cultura do cacaueiro (Theobroma cacao L.),
resultando na morte desse hospedeiro. É uma das poucas espécies do gênero

6
Ceratocystis bem estabelecida e com especificidade de hospedeiro, apresentando
um risco significativo na produção do cacau (CABRERA et al., 2016). Nesse
contexto inicial, a disseminação da doença decorre da propagação dos esporos
do fungo através do vento, da chuva e corriqueiramente da ação humana que
utiliza ferramentas contaminadas em práticas de colheita e poda. Ainda nesse
cenário, a fixação dessa enfermidade vegetal se dá pela ação de pequenos
coleópteros do gênero Xyleborus spp., que ao produzirem galerias nos tecidos
lenhosos, disseminam tanto de forma direta, transportando propágulos aderidos
ao corpo; quanto indireta, no seu trato alimentar (Figura 2 e 3) (THOROLD, 1975;
OLIVEIRA E LUZ, 2005).
Esse fungo ascomiceto apresenta ascósporos bem específicos, liberados
por seus peritécios enegrecidos, cilíndricos e elipsoides. Com a invasão dos
ascósporos do C. cacaofunesta, pode-se notar nas plantas seus galhos e troncos
ressecados, acarretando a morte desse hospedeiro de forma lenta, ou a infecção
se inicia pela raiz da planta, o que gera uma morte instantânea (RIBEIRO et al,
1986). Nesse cenário, ocorre um estresse hídrico nas plantas hospedeiras e
doentes, brevemente explicado pelo crescimento das hifas ou da produção de
esporos pelo fungo. Essas estruturas infecciosas obturam as perfurações dos
elementos traqueais no interior dos vasos da planta hospedeira. Ademais, a ação
enzimática promovida pelo fungo parasita ocasiona um aumento na viscosidade
na seiva vegetal o que também é considerado um estresse nos componentes dos
tecidos do xilema (PASCHOLATI et al., 2008) (Figura 3).
Quando há o aparecimento dos sintomas, diante de um sistema vascular
vegetal destruído, a planta hospedeira já apresenta muitos danos e o controle
torna-se extremamente difícil (RODRIGUES et al., 2018). Logo, durante o passar
dos anos houve um aumento no uso de cultivares resistentes e no
desenvolvimento de preventivos eficientes no manejo da doença. A partir disso,
diversas técnicas buscam combater o desenvolvimento filamentoso desse
microrganismo. Dessa forma, o eixo biotecnológico e proteômico tem analisado e
investigado proteínas secretadas pelo fungo C. cacaofunesta, que apresentam
capacidade de alterar o mecanismo das plantas hospedeiras e tencionar uma
colonização eficaz.

7
Figura 2. Murcha de Ceratocystis. a. coleóptero do gênero Xyleborus spp. b. Serragem fina na
entrada do besouro para o tronco. c. Lenho do cacaueiro com lesões pelo complexo Xyleborus-
Ceratocystis. d. Cacaueiro doente por Ceratocystis cacaofunesta (RIVERA, 2016).

Figura 3. Ciclo do mal do facão causado pelo fungo Ceratocystis cacaofunesta em árvores de
cacau (Figura baseada no artigo de PALADINES-REZABALA et al. 2022).

8
2.2 Interação planta-patógeno

No decorrer da evolução, plantas e micro-organismos mudam

geneticamente de forma isolada ou paralela. As plantas contêm ricas fontes de
nutrientes e energia. Por outro lado, seres como fungos parasitas apresentam
grande capacidade de influenciar no processo evolutivo de seus hospedeiros.
Dessa forma, ambos estabelecem conexões extremamente delicadas quando se
destaca o duelo bioquímico e fisiológico que ocorre em uma possível colonização
dos tecidos vegetais (HOGENHOUT et al., 2009). Fungo fitopatógenos podem
entrar através de ferimentos ou desenvolver estruturas infecciosas
especializadas, por meio de diferenciação celular, penetrando os tecidos vegetais.
Por conseguinte, a colonização pode ser no espaço extracelular conhecido como
apoplasto ou no citoplasma vegetal (PETRE; KAMOUN, 2014).
Em busca de fortalecer sua nutrição, fungos fitopatógenos desenvolvem
inúmeros mecanismos de ataque incluindo a secreção de moléculas
especializadas que corrompem a função da célula vegetal, a fim de penetrar e
colonizar seus tecidos. Em contrapartida, para combater a tentativa de invasão
desse patógeno, as plantas desenvolveram inúmeros sistemas imune de defesa
e de resistência, tanto moleculares e genéticos, quanto físicos e químicos. A
constante pressão entre ambos tem sido demonstrada pela contínua produção
tanto de efetores de virulência dos fungos, quanto de proteínas de defesa das
plantas. Nessa perspectiva, componentes do fluido apoplástico da folha ou da
seiva do xilema de plantas infectadas caracteriza-se como informações cruciais
sobre as interações moleculares subjacentes a várias doenças de plantas (DALIO
et al., 2014).
Há um consenso que demonstra que quanto maior for o conhecimento
dos aspectos da interação patógeno-hospedeiro maiores são as chances de se
obter cultivares resistentes (LODHA & BASAK, 2012; SINGH et al., 2015). Assim,
os atuais estudos funcionais buscam, por meio da biologia molecular, da
bioinformática com suas análises in sílico e da expressão gênica na interação
planta-patógeno, compreender de forma detalhada como ocorre o
reconhecimento dos patógenos pela célula hospedeira vegetal. Além disso,
investigar e detalhar os mecanismos de resistência ou de suscetibilidade
estabelecidos tem guarnecido o surgimento de modelos evolutivos relacionados

9
com a imunidade das plantas e de estratégias para ampliar a produtividade
vegetal de forma ambientalmente precisa (SCHENK et al. 2012).

2.2.1 Resistência das plantas em paralelo ao ataque patogênico.

As plantas fortaleceram diversos mecanismos de defesa induzíveis contra

parasitas incluindo os fungos fitopatogênicos. De forma primária, a atuação
desses mecanismos é desde física até biomolecular e, embora sejam abordados
separadamente, podem se desenvolver de forma isolada ou em conjunto, visto
que, na prática, há uma complexidade na separação desses efeitos de defesa das
plantas (DALLAGNOL, 2018). Dessa forma, uma primeira resposta a ser abordada
é a barreira física contra a penetração de micro-organismos nos tecidos vegetais.
A primeira linha de defesa da planta é a proveniente da cutícula, da parede
celular e, em adicional, do citoesqueleto. A cutícula, apesar de sua estrutura ser
variável entre alguns vegetais, contém essencialmente cutina, ceras e
hidrocarbonetos e atua como obstáculo físico-químico impedindo a invasão direta
de parasitas, especialmente espécies fúngicas (REINA-PINTO; YEPHREMOV
2009). Nesse contexto, para um fungo ou outro micro-organismo conseguir
penetrar a planta é necessário primeiro reduzir a resistência física por meio da
secreção de cutinases, enzimas que degradam a cutina e permeiam a aderência
do conídio e do tubo germinativo do fungo na superfície da planta (SERRANO et
al., 2014). Ademais, a cutícula também apresenta respostas de defesa dinâmica
com circuitos de sinalização e moléculas elicitoras (AUYONG et al., 2015).
Outrossim, a parede celular, presente logo abaixo da cutícula, representa
uma barreira físico-química bem caracterizada devido a sua composição
complexa com celulose, hemicelulose, pectina e lignina. Sua estrutura dinâmica
permite reorganização interior quando sofre perturbações bióticas ou abióticas a
fim de que seus danos sejam minimizados (HAMANN, 2012). Como exemplo, no
trabalho de Cano-delgado et.al. (2003), mutantes de Arabidopsis deficientes em
celulose exibiram um aumento na lignificação de sua parece celular.
Cada componente básico para a formação da parede celular do vegetal
promove por parte do micro-organismo parasita a secreção de enzimas
específicas, tais como celulases, xilanases, poligalacturonases e outras. Logo, o
nível de suscetibilidade da planta ao ataque de patógenos depende da

10
complexidade de cada componente da parede celular, da concentração desses
no órgão da planta e da idade do tecido vegetal (DALLAGNOL, 2018).
O citoesqueleto representa uma rede de filamentos da proteína actina,
microtúbulos e pontes filamentosas responsáveis pelo formato, estrutura e
organização do citoplasma vegetal (YUN et al., 2003). Os filamentos de actina
como principais representantes têm papel na defesa contra invasões,
especialmente contra fungos, e desempenham um papel essencial no movimento
(fechamento e abertura) estomático (DAY et al., 2011; JANDA et al., 2014).
Ademais, o citoesqueleto é essencial na resposta da planta contra penetração de
patógenos por meio de sua reorganização e atuação no local da infecção
transportando compostos antimicrobianos, calose e componentes de fortificação
da parede celular (PORTER; DAY 2016).
Em sequência, existem mecanismos fitotóxicos que os micro-organismos
necessitam controlar para se estabelecer na planta hospedeira, visto que, essa
barreira bioquímica apresenta diversos metabólitos secundários que atuam como
antimicrobianos e compostos tóxicos sendo necessário que patógenos
desenvolvam mecanismos de detoxificação (AHUJA et al., 2012). Dois exemplos
são as fitoantecipinas, produzidas de forma constitutiva pela planta mesmo na
ausência de micro-organismo, atuando no comprometimento da bicamada lipídica
da membrana do parasita acarretando a formação de poros e perda da função
biológica; e as fitoalexinas, pertencentes a um grupo heterogêneo de baixo peso
molecular, as quais são secretadas quando expostas a algum estresse,
manifestando amplas atividades antifúngicas, dentre elas, efetivação de danos na
membrana celular, redução na permeabilidade da parede celular do fungo e
indução da morte programada da célula (DIXON 2001; DALLAGNOL, 2018).
Além da barreira física e química no sistema das plantas, de forma
concomitante, há defesas moleculares dessas que operam para ativar respostas
e sinalizações sistêmicas (NEWMAN et al., 2013). Diante da produção de
moléculas conservadas pelo micro-organismo, que atuam como elicitoras,
componentes celulares e até como fator de virulência, denominadas padrões
moleculares associados a microrganismo/patógeno (MAMP/PAMP), as plantas
sintetizam no retículo endoplasmático e transportam para a membrana plasmática
proteínas chamadas de receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) para
reconhecer esses elicitores (DALLAGNOL, 2018).

11
 As PRRs são divididas em duas famílias: receptor tipo quinase (RLK),
contendo um domínio de ligação extracelular, um domínio transmembrana e um
domínio quinase intracelular de sinalização; ou receptor tipo proteína (RLP) que
não apresenta apenas o domínio intracelular. A partir do reconhecimento dos
elicitores pelos receptores PRR da planta, ocorrem sucessivos eventos e sinais
para expressão gênica que resulta em uma resistência chamada de imunidade
desencadeada por patógenos (PTI) (FRESCATADA-ROSA et al., 2015; LEE et
al., 2017).
Dentre as defesas desencadeadas pelas plantas na presença de
patógenos, a chamada resposta de hipersensibilidade (HR) ou reação de
hipersensibilidade em plantas é classificada por ser uma resposta rápida e
localizada, ocorrendo no sítio de infecção do patógeno, podendo ocasionar morte
local de células no local de penetração do parasita (DODDS; RATHJEN 2010;
TRDÁ et al., 2015). Envolvidos com essa resposta, pode-se observar o acúmulo
de espécies reativas de oxigênio (EROs), biossíntese de hormônios sinalizadores,
em especial, o ácido salicílico, ácido jasmônico ou etileno, a indução de genes de
defesa relacionados com a produção das proteínas relacionadas à patogênese
(PR proteínas), biossíntese de compostos contendo nitrogênio, terpenoides,
fenóis e flavonoides que podem resultar no acúmulo de fitoalexinas, entre outros
(UMA et al., 2011; DALLAGNOL, 2018).
Quando patógenos adaptados à defesa da planta estão envolvidos, há a
implicação de proteínas efetoras produzidas por esses tendo codificação por
genes de virulência (DODDS; RATHJEN 2010). As proteínas efetoras são
altamente variáveis e suprimem a imunidade desencadeada por patógenos (PTI),
podendo modificar a fisiologia celular do hospedeiro. Contudo, as plantas
demonstram um sistema que identifica a presença das moléculas efetoras por
meio de receptores específicos denominados proteínas R, codificados por genes
R. Essas proteínas com ligação de nucleotídeos e domínios ricos em leucina
(NLRs) na presença do cognato efetor fica no núcleo interagindo com fatores de
transcrição ou com proteínas do citoplasma para iniciar a cadeia de sinalização e
a expressão das defesas (QI; INNES, 2013; LI et al., 2015).
No momento em que se inicia a detecção do efetor pelas proteínas R, é
desencadeada cascatas de sinalização, expressão de genes de defesa e a reação
de hipersensibilidade, sendo essa resistência chamada de resposta imune

12
desencadeada por efetor (ETI) (TRIGIANO et al., 2010). A ETI é considerada
como uma das principais defesas do hospedeiro e classificada como resistência
vertical ou qualitativa, a qual todas as ações são conferidas por um gene
(monogênica) ou poucos genes (oligogênica), não existindo graus intermediários
de resistência, sendo somente reação de suscetibilidade ou de resistência. Essa
resistência também associa-se à teoria gene-a-gene de Flor (1971), que para
cada gene responsável por uma reação de resistência no hospedeiro, existe um
gene complementar no patógeno, que é responsável por uma reação de
avirulência destacando a especificidade do reconhecimento entre a proteína R e
sua cognata proteína efetora (CAMARGO 2011).
As proteínas R ou NLRs podem ativar a ETI por meio da interação direta
ou indireta com os efetores. A direta é denominada como modelo receptor-ligante
e ocorre o reconhecimento imediato do efetor pela receptora NLR do vegetal. Por
outro viés, o reconhecimento indireto é mediado por um monitoramento das
proteínas R, ou com proteínas do hospedeiro alvo da ação do efetor (modelo
guarda), ou com proteínas que mimetizam o alvo do efetor (modelo decoy)
(KUSHALAPPA et al., 2016). Sob essa ótica, afirmam-se que qualquer substância
produzida por organismo estranho e desconhecida pelo vegetal pode atuar como
molécula elicitora. Logo, as proteínas R compreendem um sistema de vigilância
que tem sua conservação dependente do seu potencial evolucionário e da
adaptação do patógeno. Diante desse duelo planta-patógeno, parasitas tem o
potencial efetor ao passo que as plantas hospedeiras evoluem seus genes R para
detecção precisa (Figura 4) (JONES; DANGL, 2006). Portanto, programas de
melhoramento vegetal utilizam, muitas vezes, os genes R de plantas por
apresentarem alto efeito no fenótipo do vegetal, a fim de obter genótipos com mais
resistência vertical (STUART et al., 2013).

13
Figura 4. Modelo em ziguezague ilustra o sistema imunológico da planta com interação
patogênica. Neste esquema, a resistência ou suscetibilidade é proporcional a [PTI-ETS 1 ETI]. Na
fase 1, as plantas detectam padrões moleculares associados a microorganismos/patógenos
(MAMPs/PAMPs, diamantes vermelhos) por meio de PRRs para desencadear a imunidade
desencadeada por PAMP (PTI). Na fase 2, os patógenos bem-sucedidos secretam efetores que
interferem com a PTI ou, de outra forma, permitem a nutrição e a dispersão do patógeno,
resultando em suscetibilidade desencadeada por efetores (ETS). Na fase 3, um efetor (indicado
em vermelho) é reconhecido por uma proteína NB-LRR, ativando a imunidade desencadeada por
efetor (ETI) que muitas vezes ultrapassa um limite para indução de morte celular hipersensível
(HR). Na fase 4, são selecionados os isolados de patógenos que perderam o efetor vermelho e
talvez tenham ganhado novos efetores por meio do fluxo gênico horizontal (em azul) - esses
podem ajudar os patógenos a suprimir a ETI. A seleção favorece novos alelos NB-LRR da planta
que podem reconhecer um dos efetores recém-adquiridos, resultando novamente em ETI
(Traduzido de Jones & Dangl (2006)).

2.2.2 Proteínas efetoras de fungos

Para alguns fungos há uma relação direta entre o tipo de interação que
ele realiza e o tamanho de seu secretoma, o que indica o conjunto de proteínas
expressas e secretadas no espaço extracelular. À nível de exemplificação, fungos
parasitários possuem uma maior proporção de proteínas secretadas quando
comparados com fungos mutualísticos. As proteínas secretadas são fatores
primordiais na interação fungo-hospedeiro incluindo, em particular, as efetoras
com o alvo direcionado aos diferentes compartimentos subcelulares da planta
hospedeira (LOWE; HOWLETT, 2012).
Fungos fitopatógenos contém genes que codificam proteínas efetoras que
a depender do hospedeiro apresentam distintas funções, como exemplos

14
correlação com a patogenicidade ou com a ativação de resistência. Os efetores
podem ser secretados ou não e representam “moléculas liberadas ou associadas
a um organismo que modificam a fisiologia de outro organismo” (DALIO et al.,
2014). Quando alteram a estrutura e função da célula hospedeira, o que facilita a
infecção, são reconhecidos como fatores de virulência ou toxinas; quando
reconhecidos pela planta e desencadeiam respostas de defesa pelo hospedeiro
são fatores de avirulência (Avr) (SELIN et al., 2016).
A elucidação referente ao local alvo das proteínas efetoras foram
apoplásticas, quando secretadas pelo patógeno e acumuladas na superfície da
célula ou nos espaços intercelulares; ou citoplasmáticas, quando podem se
translocar pela membrana celular e apresentar interação direta com meio
intracelular (BLOCK et al., 2008; DJAMEI et al., 2011). Já a abordagem do
transporte ou direcionamento das proteínas efetoras fúngicas inclui em geral a
rota de secreção eucariótica no espaço intercelular da planta hospedeira ou na
matrix extrahaustorial (DALLAGNOL, 2018).
Essas moléculas quando são secretadas, apresentam domínios de
translocação N-terminal, que são encontrados após o peptídeo de sinal secretor
geral (SELIN et al., 2016). Ademais, é provável que existem inúmeros meios para
que ocorra a translocação das efetoras no citoplasma da planta hospedeira
(PETRE; KAMOUN, 2014) e que efetores intracelulares podem portar motivos de
sequência envolvidos com a translocação dentro do citoplasma do hospedeiro
(TORUÑO et al., 2016).
Durante a ação fitopatogênica dos fungos, a secreção de proteínas
efetoras tem sua ordem e intensidade controladas de acordo com as distintas
fases de infecção e colonização, incluindo a necessidade de alteração fisiológica
da planta. A respeito disso, algumas ações dos efetores tanto na inibição da
defesa da planta quanto na inibição do reconhecimento da infecção pela planta
incluem inibir enzimas no apoplasto, inibir ativação de PRRs, inibir cascatas de
sinalização, modificar transcriptoma correlato com respostas de defesa,
reprogramar transcrição, degradar componentes e/ou proteínas de defesa e
interferir na secreção de proteínas e no tráfego vesicular (GÖHRE & ROBATZEK,
2008; DALIO et al., 2014).
Regularmente, proteínas efetoras são pequenas proteínas secretadas
contendo ≤ 300 aminoácidos, baixo peso molecular, alta expressão infecciosa e,

15
geralmente, ricas em cisteína com estruturas terciárias estabilizadas por pontes
dissulfeto. Esta última característica é típica de efetores apoplásticos pois
possivelmente aumenta a estabilidade efetora no apoplasto da planta, o qual é
rico em proteases. Além disso, outro critério comumente aplicado para definir
efetores é a ausência de proteínas ortólogas detectáveis; contudo, algumas
efetoras são conservadas ou possuem domínios funcionais conservados (LO
PRESTI et al., 2015; WANG et al., 2020a).
Diversas estratégias potenciais contra fitopatógenos é a prevenção da
secreção efetora, bem como o combate da internalização dessas proteínas nas
células do hospedeiro (WHISSON et al., 2007). Contudo, em primeiro plano é de
grande importância as pesquisas de identificação e caracterização do secretoma
dos patógenos, uma vez que contendo as proteínas efetoras secretadas, é
possível reunir um grande acervo de potenciais efetores (HACQUARD et al.,
2012).
Em vista disso, um exemplo de proposições de bioinformática como
prováveis candidatas a efetoras são as pequenas proteínas ricas em resíduos de
cisteína preditas para secreção (WANG et al., 2020a). Entretanto, nem todas as
proteínas secretadas ricas em cisteína são efetoras e nem todo efetor é pequeno
e rico em cisteína. Para isso, a fim de evitar a exclusão de potenciais efetores
novos projetos incluíram análises in silico para identificar repertório efetor.
Algumas das propriedades buscadas são a presença de sinal de secreção, genes
induzidos in planta, presença de um motivo efetor conhecido ou um sinal de
localização nuclear, genes com longas regiões intergênicas, repetições internas
(SAUNDERS et al., 2012; NEMRI et al., 2014; SPERSCHNEIDER et al., 2015b;
SELIN et al., 2016).
Com isso, a partir dos aspectos já bem estabelecidos e dos novos
avanços em predições e experimentações de candidatos a efetor, há então o forte
auxílio na revelação de mecanismos de patogenicidade de inúmeros fungos
fitopatógenos e desenvolvimento de novas estratégias de controle sustentável
(DALIO et al., 2018; ZHANG et al., 2020).

2.3 Ocorrência, histopatologia e perfil proteico do secretoma de Ceratocystis

cacaofunesta

16
 Diante da alta disseminação do fungo Ceratocystis cacaofunesta no
estado da Bahia, foram iniciadas pesquisas com o intuito de compreender a
doença que esse fungo causa. Construindo um histórico com o C. cacaofunesta,
o primeiro estudo é o de Almeida et al. (2005) que evidenciou a presença da
doença Murcha de Ceratocystis em 42 fazendas de 22 municípios distribuídos em
distintos agrossistemas da Bahia. O estudo também revelou que as variedades
de cacau que foram acometidas pelo fungo incluíram TSH 516, TSH 1188 e
CCN51.
Na sequência, em 2012 foi conduzido na Bahia um experimento de
histopatologia com o isolado Cc20 do fungo C. cacaofunesta inseridos em duas
variedades de cacau: CCN51 e TSH1188, para analisar o desenvolvimento das
estruturas reprodutivas do fungo, o padrão de colonização fúngica, bem como as
respostas anatômicas desses dois genótipos. Os resultados demonstraram que o
genótipo resistente (TSH1188) revelou pouca ou nenhuma colonização em
contraste com o genótipo susceptível (CCN51), além de que o suscetível
apresentava muitas células circundando os vasos do xilema e no resistente
constatou-se uma reação de defesa da planta próximo ao xilema, sugerindo um
provável mecanismo de resistência genética (SANTOS et al., 2012).
Em 2015, o isolado Cc20 do fungo foi utilizado juntamente com
fragmentos de ramos dos dois genótipos de T. cacao (TSH1188 e CCN51) para
descrever os perfis proteicos do secretoma de C. cacaofunesta por meio de
indução in vitro. Foi realizado extrações proteicas dos tratamentos induzido por
TSH1188 e induzido por CCN51 e identificação por espectrometria de massas.
Entre os resultados obtidos houve um extrato total com 29 spots do secretoma do
fungo identificados e classificados. Dentre elas foi identificada a cerato-platanina
expressa em contato com o indutor do genótipo resistente TSH1188, sugerindo
que devido a presença dessa proteína efetora houve uma batalha imunológica
entre o patógeno e a planta hospedeira (MALHEIRO, 2015).
Em continuidade, o estudo de Dubón-Morales (2017), utilizando também
o isolado Cc20 do fungo e os genótipos TSH1188 e CCN51, analisou os perfis de
proteínas secretadas durante a interação. O induzido por CCN51 (susceptível)
teve a maior contagem de spots (335) comparado com o controle (147) e o
induzido por TSH1188 (153) o resistente. Além disso, a pesquisa concluiu que os
genótipos de cacaueiro contrastantes TS1188 e CCN51 induziram diferenças

17
moleculares e fisiológicas em C. cacaofunesta, e que as proteínas
diferencialmente expressas e anotadas podem estar relacionadas ao processo
infeccioso causado pelo fungo (DUBÓN-MORALES, 2017).
Com rendimento proteico satisfatório, a indução in vitro obtendo a
secreção de proteínas durante a interação planta-patógeno e o estudo de
secretoma realizado por SDS Page permite aplicar a abordagem da biotecnologia
para identificar proteínas secretadas por fungos fitopatógenos fornecendo
informações acerca da caracterização de novos efetores fúngicos. Em virtude
desses conhecimentos abordados, o presente projeto selecionou no trabalho de
Dubón-Morales (2017) uma das proteínas identificadas a partir da interação do
genótipo de cacau suscetível CCN51 com o C. cacaofunesta. A proteína anotada
como hipotética proveniente do extrato do secretoma do fungo foi manipulada
para posterior caracterização computacional e experimental.

3. METODOLOGIA

3.1 Análises in silico: predições da proteína candidata Cceff1

A partir das análises do perfil proteômico do secretoma do fungo

Ceratocystis cacaofunesta no trabalho de Dubón-Morales (2017) foi selecionada
uma ORF que tinha como tradução uma proteína hipotética do fungo C. platani. A
sequência proteica de C. platani foi comparada com o fragmento genômico de C.
cacaofunesta, o qual encontra-se como dado bruto nos bancos de dados. A ORF
da proteína alvo nomeada de Cceff1 de C. cacaofunesta foi reconstituída com
base na ORF da proteína de C. platani. Para esses fins, foi manuseado os
servidores SOFTBERRY INC (gene finder) e Six frame translation e o programa
BLAST do https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Em posse da sequência proteica Cceff1 de C. cacaofunesta, foi realizado,
utilizando o Muscle no Mega x 10.1 software (KUMAR et al., 2018), um
alinhamento da proteína alvo com as 20 proteínas hipotéticas selecionadas pela
identidade, Score e E-value no BLASTp do NCBI. Em seguida foi proposto a
montagem de um dendograma no MEGA baseado no método Maximum
Likelihood (ML) (WHELAN, S. & GOLDMAN, N., 2001) associado em 1000
repetições pelo esquema Bootstrap (FELSENSTEIN, 1985). A existência de

18
peptídeo sinal foi analisada com o programa SignalP
4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SingnalP/) e com o Phobius prediction
(https://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl). Com as ferramentas do ProtParam e
do Compute PI/MW disponíveis no servidor Expasy Proteomic Tools
(http://www.expasy.org/tools/) foi predito propriedades físico-químicas e com o
Protscale foi predito a curva de hidrofobicidade.
Para a predição de desordem na sequência da proteína foi utilizado o
programa PONDR Score (http://www.pondr.com/) e para buscar possíveis sítios
de fosforilações foi utilizado o NetPhos 2.0 que juntamente com o serviço Deeploc-
1.0 fazem parte do site department of Health Technology - DTU Health Tech.
Posteriormente, o programa Pfam foi utilizado para verificar a presença de
domínios funcionais conservados. Por meio do software Psort e do serviço
Deeploc-1.0 foram preditos os sinais de localização funcional da proteína e, por
fim, com o servidor DiANNA 1.1 web (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) foi
buscado possíveis ligações dissulfeto entre as seis cisteínas da proteína Cceff1.

3.2 Transformação de células em E. coli.

A ORF sintética da proteína Cceff1 (sem região codificadora do peptídeo

sinal) de Ceratocystis cacaofunesta com códons otimizados para expressão em
bactéria, clonada no nos sítios de restrição Nco I e Xho I do vetor pET-32a (+) foi
produzida pela BIOMATIK. Essa construção visa a expressão da proteína
recombinante fundida com 109 aminoácidos da tioredoxina derivada do vetor, o
que facilita a expressão em bactéria de proteínas ricas em cisteínas. Entre a
tiorredoxina (Trx) e a proteína efetora foi localizado um sítio de Trombina, um sítio
de Enteroquinase (ambos derivados do vetor e um sítio de clivagem da protease
Pl-Pro de Sars-Cov-2 (Figura 5), cujos códons foram inseridos imediatamente
antes do início da ORF. O vetor possui promotor T7, resistência a Ampicilina e
sequências His • Tag® e S • Tag ™ cliváveis para detecção e purificação. O
plasmídeo recombinante pET-32a(+)rTrx-(His)6-Cceff1 foi inoculado em estirpe
BL21(DE3) de E. coli, mediante procedimento de transformação por choque
térmico. A princípio, foi adicionado 1 µL (aproximadamente 30 ƞg) do DNA
plasmidial recombinante pET-32a(+)rTrx-(His)6-Cceff1 à 200 µL de célula
competente BL21(DE3) que foi retirada do estoque mantido a -80 °C e

19
descongelada em gelo. Ato contínuo, as células permaneceram durante 30
minutos no gelo e prontamente foram submetidas ao banho-maria a 42 °C por 2
minutos, efetivando então, o choque térmico bacteriano. Logo após, a amostra
mantida no gelo recebeu 1mL de meio LB e foi incubada por 1h a 37 °C, para
expressão da resistência. Completado o período, a cultura foi centrifugada por 1
minuto a 5000 rpm e teve seu pellet ressuspenso em 200 µL de meio LB e, em
seguida, foi inoculado em placa de petri, com auxílio de uma alça de Drigalski,
contendo meio LB-ágar e antibiótico adequado (Ampicilina 50 µg mL -1). Um
controle negativo foi realizado em placa similar, contudo, contendo amostra de
célula competente sem o DNA plasmidial recombinante. Em conclusão, as placas
foram estocadas em uma estufa durante 16 h a 37 °C a fim de garantir o
crescimento das colônias bacterianas transformadas com o DNA recombinante
nas placas com meio seletivo contendo antibiótico.

Figura 5. Fusão da proteína recombinante rTrx-(His)6-Cceff1.

3.3 Expressão heteróloga em pequena escala e verificação da solubilidade

Um total de três colônias isoladas de E. coli na cultura transformada com

o plasmídeo recombinante foram selecionadas. Cada colônia foi inoculada
separadamente em 3 mL de meio LB acrescido com 3 µL do antibiótico Ampicilina
100 µg mL-1 dispostos em três tubos Falcon distintos e foram incubados a 37 ºC
sob agitação de 200 rpm por 16 horas. No dia seguinte, cada tubo foi centrifugado
a 5000 rpm por 10 minutos a 4 ºC para remoção do meio saturado, gerando um
pellet bacteriano. Cada pellet foi ressuspendido em 5 mL de meio LB novo
novamente acrescido com 5 µL do antibiótico Ampicilina 100 µg mL-1 e, as três

20
culturas foram agitadas até atingir OD600 entre 0,5-0,7 m. Foram coletados
extratos totais da expressão de cada colônia de 1 mL em microtubos e, nos 4 mL
restantes de cada tubo Falcon, a expressão foi induzida mediante a adição de
IPTG na concentração de 0,4 mmol L-1. Depois desse momento foi realizado um
estoque para cada colônia coletando pequenas alíquotas e adicionando glicerol
50 % e rapidamente congelando-os em nitrogênio líquido. Após o período de 4 h
a 37 °C foi coletada três alíquotas de 1 mL em microtubos para compor o controle
positivo de cada respectiva colônia de indução com IPTG. As amostras coletadas
foram centrifugadas à 13.000 rpm por 2 minutos e seus pellets gerados foram
ressuspendidos em 400 µL de tampão de lise (Binding Buffer 1x composto de 4mol
L-1 de NaCl, 160 mmol L-1 de TRIS-HCl e 40 mmol L-1 de imidazol + lisozima 50
µg mL-1), e a mistura incubada por 30 min a 30 ºC. Após isso, as amostras foram
transferidas para o gelo e ultrassonicadas com pulsos de 8 segundos “on” e 20
segundos “off’, utilizando o parâmetro amplitude 70 % em ultrassonicador (Pgex
30) até perder a viscosidade promovendo o rompimento total das membranas.
Depois desse processo, foram coletados 30 µL de cada cultura lizada, que foram
identificadas separadamente como: extrato total sem IPTG e extrato total com
IPTG para cada colônia; sendo que esses extratos foram acrescidos com 90 µl de
água pura e 30 µL de tampão de amostra 5x. Os 370 µL restantes da cultura
induzida foram centrifugados a 12.000 rpm por 15 min para separação das frações
solúvel e insolúvel também devidamente etiquetadas e acrescidas com tampão
de amostra 5x para visualização em SDS-PAGE 1D 12,5 % a fim de verificar
expressão e solubilidade da proteína recombinante.

3.4 Indução a frio (18°C) em grande escala

Para obtenção da proteína de interesse purificada, o primeiro passo foi

selecionar um dos três estoques permanentes do clone de expressão propagado
em E. coli preservados em glicerol 50 %. Em seguida, foi coletado 5 µL do estoque
da colônia 3 e inoculado em tubo Falcon de 50 mL contendo 5 mL de meio de
cultura Circlegrow acrescido do antibiótico Ampicilina 100 µg mL-1. O pré-inóculo
foi incubado a 37 °C, sob agitação de 180 rpm por 16 horas. No dia seguinte, o
conteúdo do tubo foi centrifugado a 5.000 rpm por 10 minutos a 4 ºC para remoção
do meio saturado e, seu consequente pellet foi inoculado em dois enlermeyers de

21
200 mL de meio Circlegrow acrescidos com o mesmo antibiótico citado acima e
mantido a 37 ºC sob agitação de 180 rpm por 4 h, até atingir a OD600 entre 0,5-0,7
m. Ao atingir a absorbância anotada, as culturas foram colocadas em contato
com gelo por 15 minutos e, em seguida, foi adicionado IPTG na concentração de
0,4 mmol L-1 e foram incubados a 18 ºC sob agitação de 180 rpm por 16 horas
para realizar indução a frio (Figura 6). No terceiro dia, o total de meio de cultura
de 400 mL foi dividido em alíquotas de 100 mL e centrifugados a 10.000 rpm,
obtendo quatro pellets que foram utilizados em cada purificação da proteína
recombinante. As amostras foram confirmadas em SDS PAGE 1D a 12,5 %.

Figura 6. Método de indução à frio em larga escala.

3.5 Purificação por cromatografia de afinidade

Para o início da purificação, o precipitado selecionado foi ressuspenso em

10 mL de tampão de lise (Binding Buffer 1x + lisozima 50 µg mL-1) e mantido por
30 min em temperatura ambiente. Logo após, a suspensão foi colocada em
contato com o gelo e foi submetida a lise mecânica com o processador
Ultrassônico (Pgex 130) com sonda de 6 mm de diâmetro com ciclos de 10 pulsos,
intercalado com 25 s de repouso no gelo para resfriamento por 20 minutos a 70
% de amplitude. Depois dessa etapa, o produto gerado foi centrifugado por 40
minutos à 9.500 rpm a 4 ºC e o pellet formado, referente à fração insolúvel, foi

22
armazenado a -20 °C, enquanto o sobrenadante correspondente à fração solúvel,
foi coletado para purificação por cromatografia de afinidade utilizando coluna de
níquel HisTrap FF crude (GeHealthcare) que foi anteriormente carregada com Ni2+
mediante protocolos e recomendações do fabricante. O sobrenadante foi utilizado
na coluna, e a proteína recombinante que possui uma cauda de histidina foi eluída
de acordo com o aumento da concentração de imidazol contidas nas frações (50
a 500 mmol L-1 do eluente). As frações coletadas foram submetidas à diálise
contra tampão Tris-HCl pH 7,0 para a dessalinização. E a proteína purificada e
dialisada foi quantificada utilizando o seu coeficiente de extinção. As amostras
foram confirmadas em SDS PAGE 1D A 12,5 % corado com azul de comassie
coloidal (NEUHOFF et al., 1988).

3.6 Purificação da fração insolúvel por extração desnaturante

Outra técnica aplicada para o isolamento da proteína Cceff1 foi a

precipitação da fração insolúvel e constante remoção da fração solúvel e
contaminantes. Iniciou-se com a solubilização do pellet insolúvel com 40 mL do
reagente binding buffer 1x com Ureia 6 mol L-1 e 200 µL de lisozima. O conjunto
em um tubo falcom foi mantido em temperatura ambiente por 30 minutos e
invertido ocasionalmente. Após o período o material foi sonicado durante 10
minutos em uma amplitude de 70 % em um ritmo 10 s “on”/ 25s “off” e, logo em
seguida, a amostra foi centrifugada por 20 minutos em rotação máxima de 15.000
RPM. O sobrenadante foi armazenado para controle em SDS PAGE 1D e o pellet
gerado passou por esse procedimento mais três vezes. Após a repetição, o pellet
produzido foi resuspendido em 50 mL da solução de tampão Tris-HCl 10 mmol L-
1 pH 7 com glicerol 5% e Ureia 6 mol L-1 e teve sua suspensão sonicada por 10
minutos e centrifugada por 20 minutos. Por fim, o sobrenadante limpo contendo a
proteína alvo foi dialisado para remover a Ureia presente. A molaridade caiu de 6
mol L-1 para 0,5 mol L-1 e um processo de retirada da solução de diálise e adição
de tampão Tris-HCl puro 10 mmol L-1 pH 7 a cada três horas totalizando
aproximadamente 10 trocas de diálise e a renaturação proteica. As amostras
foram confirmadas em SDS PAGE 1D A 12,5 % corado com azul de comassie
coloidal (NEUHOFF et al., 1988).

23
3.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE 1D)

Para visualização em gel, as amostras alvo de cada procedimento foram

preparadas com 20 µL de amostra específica acrescida de tampão de amostra 5X
(β-Mercaptoetanol 5 %, Tris-HCl 0,02 mol L-1 pH 6,8, SDS 4 %, glicerol 27 %, azul
de bromofenol 1 %) correspondente a 20 % do volume de amostra. Posteriormente
foram desnaturadas junto com o marcador Low Molecular 27 Weight Marker de
14-97 kDa (GE Healthcare) a uma temperatura de 95 °C durante 8 min
aproximadamente e depositadas nos poços do SDS-PAGE 12,5 % sob as
seguintes condições: 30 A por 170 min em um equipamento Mighty Small II Mini
Vertical Electrophoresis Unit SE250 (Hoefer). Após a corrida, o gel foi colocado
em tampão de fixação (40 % etanol, 10 % Ácido acético) durante 20 min e corado
durante 1 dia em 0,08 % de Coomassie coloidal G-250 (NEUHOFF et al., 1988).
Os géis dos procedimentos necessários foram digitalizados usando
ImageScanner II (Amersham, GE Healthcare).

3.8 Determinação da concentração da proteína alvo

A quantificação da proteína alvo foi realizada através da medida de

absorbância a 280 m. Com o coeficiente de extinção molar da proteína fusionada
e da clivada, ambas preditas com o ProtParam, foi aplicada a fórmula da Lei de
Lambert-Beer:
A=ɛ*l*c
Em que A é a absorbância encontrada pelo SOFTMAX PRO a 280 m; ɛ
é o coeficiente de extinção molar em mol-1 cm-1; l é o caminho óptico da cubeta
em cm; c é a concentração proteica em mol L-1. Para a proteína de fusão ɛ =52.410
mol-1 cm-1 e após clivagem com trombina, ɛ =38.305 mol-1 cm-1. Foi assumido 1
cm para o caminho óptico.

3.9 Clivagem da proteína de fusão Trx com trombina

Para testar a termoestabilidade e realizar futuros experimentos, a proteína

alvo candidata a efetora foi clivada usando a serino protease trombina por meio

24
de seu sítio derivado do vetor de expressão pET-32a. O experimento utilizou 50
µL de trombina em cada mL de proteína purificada e dialisada. A mistura foi
mantida por 1h em banho maria a 37 °C e depois refrigerada por 24 h. As amostras
coletadas foram em parte armazenadas para controle e parte purificada em coluna
de níquel HisTrap FF crude (GeHealthcare) para otimizar a purificação e a
caracterização. As amostras foram confirmadas por SDS PAGE 1D A 12,5 %.

3.10 Análise por Espectrometria de massas

Tanto a proteína alvo fusionada com Trx e quanto ela clivada purificadas
e dialisadas e identificadas no SDS-PAGE foram excisadas com bisturi,
reduzidas com DTT, alquiladas com IAA e a digestão proteolítica foi realizada de
acordo com Shevchenko et al. (2007). Os peptídeos passaram por uma extração
em solução de acetonitrila 50 % e ácido fórmico 5 % e concentrados em
speedvac para um volume final de 20 uL. A solução contendo digestão
proteolítica foi analisada por cromatografia de fase reversa em Agilent LC 1290
Infinity II acoplado ao QTOF 6545 (Agilent). As sequências dos peptídeos obtidas
foram comparadas em banco de dados do ncbi (Figura 7).

Figura 7. Análise de identificação por espectrometria de massas da proteína rTrx-(His)6-Cceff1

e rCceff1. a. Amostras no decorrer do tratamento de spot. b. Amostras no dispositivo do
espectrômetro de massas Agilent LC 1290 Infinity II com QTOF 6545B (Agilent). c. Amostras
computadas para a identificação.

25
3.11 Teste de atividade biológica da proteína candidata rCceff1

Para analisar a presença ou não de sintomas causados na planta pela

proteína e verificar um possível efeito biológico da potencial efetora, foi borrifado
500 µL da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 fusionada (1,45 até 3,7 µmol L-1) e após
clivagem a rCceff1 (4 µmol L-1) em folhas de Solanum lycopersicum variedade
Micro Tom, com 4 semanas após o plantio. Foi dispersado como controle negativo
500 µL do tampão Tris-HCl a 10 mmol L-1 em pH 8,0, coletado da última diálise da
proteína alvo, como utilizado no trabalho de GARCIA et al., (2007). Em seguida,
as folhas embebidas foram isoladas separadamente e fotografadas em fundo
preto nos tempos de 0, 16, 24, 32, 48 e 72 horas nos primeiros testes e nos tempos
de 0, 2, 4, 6 e 8 dias após a absorção. Os sintomas e os controles negativos
registrados foram organizados de modo comparativo.

3.12 Teste de acúmulo de H₂O₂ em folhas de Micro tom tratadas com a Cceff1

Para avaliar o envolvimento da proteína Cceff1 na geração de EROS em

folhas de Solanum lycopersicum (tomate) variedade Micro Tom, foi realizado a
técnica de visualização do peróxido de hidrogênio. Houve dois testes, o primeiro
contou com a proteína recombinante fundida rTrx-(His)6-Cceff1 a uma
concentração de 4,7 µmol L-1 e o segundo com a proteína clivada rCceff1 em
concentração de 4,2 µmol L-1. Três folhas de S. lycopersicum foram borrifadas
com as proteínas separadamente e como controle negativo três folhas da planta
foram borrifadas com tampão Tris-HCl 10 mmol L-1 pH 8. Após 24 horas de
tratamento foram coletados discos foliares, que foram imersos em 1 mg mL-1 de
DAB e HCl, pH 3,8. Em seguida, os discos foliares foram submetidos ao vácuo
por aproximadamente 30 min e, após esse período, foram incubados no escuro
por 24 horas. Posteriormente, os discos foram fervidos em etanol 96 % por 20
min, sendo em seguida lavados com etanol 50 % até sair toda a clorofila. O
resultado foi observado através de fotografias em lupa.

26
3.13 Dicroísmo circular (CD)

Por meio do espectropolarímetro Jasco-815 acoplado ao dispositivo com

temperatura controlada Peltier PTC-423S/15, foi investigada espectro de
dicroísmo circular e a estabilidade térmica da proteína clivada rCceff1. Um volume
de 400 µL da proteína foi usado em uma concentração de 5 µmol L-1 e como
controle negativo foi usado o tampão Tris-HCl (10 mmol L-1 , pH 7,4) da última
diálise da proteína. Para a análise do espectro da proteína foi feita uma varredura
na velocidade de 50 ƞm min-1 e intervalo de coleta de 1,0 ƞm. As leituras foram
realizadas nas temperaturas de 25 e 95 ºC, usando uma cubeta de quartzo
polarizada de 1 mm de percurso óptico. Os espectros obtidos foram resultados
das médias de 6 repetições consecutivas de varreduras (Figura 8). O programa
utilizado para a leitura dos espectros foi Spectra Manager (JASCO), e os dados
dos espectros gerados foram analisados no programa K2D3 para estimar a
porcentagem de estrutura secundária da proteína recombinante rCceff1 já clivada.
Um teste final foi aplicado em plantas de Solanum licopersicum variedade Micro
Tom, o qual a proteína teve sua temperatura elevada em banho-maria 85 ºC por
10 min.

a b

Figura 8. Dicroísmo circular (CD). a. Cubeta em quartzo (QS) com 1 mm; b. Exterior do
espectropolarímetro Jasco-815; c. Peltier PTC-423S/15; d. Interior do Jasco-815 que recebe a
cubeta de quartzo.

27
4. RESULTADOS

4.1 Parâmetros computacionais e filogenéticos da proteína candidata Cceff1

Diante da indisponibilidade de busca e identificação de proteínas do fungo

C. cacaofunesta, os peptídeos gerados na análise do secretoma desse fungo no
trabalho de Dubón-Morales (2017) foram anotados a partir do genoma acessível
de C. platani. Portanto, a reconstituição da ORF de C. cacaofunesta foi resultado
de uma busca do locus em seu genoma (>PEJQ01000015.1:368052-368457
Ceratocystis cacaofunesta strain C1593 scaffold10, whole genome shotgun
sequence) tendo como base a ORF de C.
platani(>lcl|LBBL01000312.1_mrna_4977[locus_tag=CFO_g4809][product=hypot
heticalprotein][location=complement(join(67026..67275,67335..67741))][gbkey=
mRNA]) (Figura 9).

Figura 9. Diagrama da reconstituição da proteína Cceff1 em C. cacaofunesta. A sequência

proteica com número de acesso NCBI: KKF92851.1 de C. platani (1) identificada no trabalho de
DUBÓN-MORALES (2017) foi utilizada para obtenção de sua ORF (2) para seleção de região
368052-368457 do genoma de C. cacaofunesta (3) por homologia e alinhamento, e posterior
resgate da ORF da proteína Cceff1 em C. cacaofunesta (4) e sua sequência peptídica (5).

28
 A partir da remontagem da sequência proteica alvo oriunda do genoma de
C. cacaofunesta foi possível reunir estratégias genéticas, bioquímicas e
bioinformáticas para obtenção dos resultados acerca da caracterização da
possível proteína efetora, bem como do fitopatossistema da doença murcha de
ceratocystis do cacaueiro. Desse modo, um dendrograma foi gerado (Figura 10)
do alinhamento das 20 sequências peptídicas com a proteína candidata em seus
respectivos clados, evidenciando a proximidade das proteínas do gênero
Ceratocystis incluindo a proteína Cceff1 de C. cacaofunesta.
Em seguida, foram geradas informações acerca da sequência da proteína
Cceff1, predizendo características biológicas e funcionais. A princípio, com o
SignalP-4.1 foi identificada a posição do peptídeo sinal entre os aminoácidos 1 a
19 com seu sítio de clivagem entre os aminoácidos 19 e 20 (Figura 11) e sua
tabela complementar, e com o programa PHOBIUS foi predito que a partir do
aminoácido 19 até o 217, a proteína caracteriza-se como não citoplasmática.

Figura 10. Dendograma gerado pelo método de máxima verossimilhança (WHELAN, S. &
GOLDMAN, N., 2001). Agrupamento de 20 sequências peptídicas alinhadas com a proteína Cceff1
por meio de 1000 repetições (bootstrap). Em vermelho destaca-se o grupo do gênero Ceratocystis.

29
Figura 11. Predição da posição do peptídeo sinal e sítio de clivagem usando a previsão SignalP 4.1.

As características físico-químicas para a proteína rTrX-(His)6-Cceff1 e

para a rCceff1 madura (sem o peptídeo sinal) preditas com os programas
Protparam e Compute PI/MW estão listadas na tabela 1.

Tabela 1. Propriedades físico-químicas da sequência proteica analisada pelo Protparam e

Compute PI/MW.

O índice de hidrofobicidade/hidrofilicidade por Kyte & Doolittle mostrou

que a proteína Cceff1 apresenta a maior parte dos seus aminoácidos hidrofílicos
que se encontram abaixo da pontuação zero sendo o mínimo K posição 174
marcando -2.478. O peptídeo sinal com seu máximo em S posição 6 com 2.356
demonstrou-se altamente hidrofóbico até o aminoácido A na posição 19 com
1.389 e houve quatro picos máximos de hidrofobia nos aminoácidos M posição 38
com 0.967; A posição 83 com 0.822; S posição 124 com 1.333; e L posição 146
com 1.644 preditos com o programa ProtScale (Figura 12).

30
Figura 12. Diagrama de hidropatia de Kyte & Doolittle da porção N-terminal da proteína Cceff1.

A Cceff1 apresenta duas regiões de desordem em [20]-[34] sendo A e V;

e o maior segmento desordenado [181]-[217] sendo V e S totalizando 24 % de
seus aminoácidos acima da linha limiar para desordem, sendo 54 aas
considerados desordenados (Figura 13), conforme predições realizadas com o
software PONDR.
Possíveis fosforilações em 15 serinas, 14 treoninas e 5 tirosinas que
compõem a proteína Cceff1 são evidenciadas com o NetPhos-2.0 (Figura 14). Um
total de 34 resíduos de aminoácidos tem potencial para fosforilação, perfazendo
um total de aproximadamente 16 % da proteína. Nenhum sítio de acetilação foi
predito na Cceff1, mediante análise com o “NetAcet-1.0”.

31
Figura 13. Curva de predição de desordem da proteína Cceff1 com 24 % de seus aminoácidos
em desordem distribuídos em três regiões, [1]-[2] marcando M e V; [20]-[34] marcando A e V; e
[181]-[217] sendo V e S.

Figura 14. Diagrama demonstrando o potencial de fosforilação de 34 resíduos de aminoácidos da

proteína Cceff1.

A proteína Cceff1 tem secreção extracelular incluindo parede celular, bem

como característica solúvel por meio da predição dos softwares Psort e Deeploc-
1.0. Em seguida, foi correspondido com alta significância de homologia da
proteína alvo com uma família de alérgenos fúngicos denominada AltA1. Um total
de 107 aminoácidos conservados distribuídos em uma escala de probabilidade
perfazendo o reconhecimento de 49,3 % da proteína com e-value de 7,8e-10 por
intermédio do Pfam (Figura 15).
Foi predita a formação de três ligações dissulfeto entre as seguintes
sequências peptídicas da proteína Cceff1: EEVLPCMEPSL – SSGWMCNPKQF;
SAPIECSGHTT – DQWFDCQGTIS; KIPLVCTASEQ – VYRQDCKSPEN por meio
do servidor DiANNA 1.1 web.

32
Figura 15. Homologia da proteína Cceff1 com domínio Alt a 1 baseada na probabilidade do
software Pfam.

4.2 Seleção das colônias por meio da transformação de células em E. coli

A transformação contou com um total aproximadamente de 47 colônias

mostradas nas placas a.1 e a.2 (Figura 16) em que foram utilizados o plasmídeo
recombinante para a transformação por choque térmico da estirpe BL21 em meio
seletivo. As placas b.1 e b.2, correspondentes ao controle negativo não
apresentaram colônias.

a.1 a.2

b.1 b.2

Figura 16. Transformação de pET-32a-Cceff1 estirpe BL21(DE3)de E. coli. a.1 e a.2 Placa positiva
contendo meio LB-ágar, ampicilina, células competentes e vetor resultando no crescimento de
colônias selecionadas. b.1 e b.2 Placa negativa de meio LB-ágar e células competentes sem
crescimento de colônias.

33
4.3 Expressão das colônias obtendo proteína heteróloga.

Os extratos proteicos das três colônias da estirpe BL21(DE3)

transformadas, quando analisados em SDS-PAGE, revelam uma banda de
aproximadamente 40 kDa compatível com massa molecular predita para a
proteína Trx-(His)6-Cceff1 recombinante (Figura 17). A proteína fundida acumula
predominantemente na fração insolúvel do extrato bacteriano.
Diante do peso molecular de aproximadamente 40 kDa predito para a
fusão pET-32a com a proteína recombinante adicionado sítios proteolíticos,
tioredoxina e seis histidinas para purificação (~1,7 kDa), foi possível comparar
entre o controle negativo para IPTG e uma banda diferencialmente expressa no
controle positivo para IPTG na altura de 40 kDa. Além disso, foi verificado acúmulo
da proteína na fração solúvel (FS) e na fração insolúvel (FI) do extrato bacteriano.

Figura 17. Teste de expressão heteróloga em estirpe de E. coli BL21 (DE3) em SDS PAGE 12,5%.
Marcador (M); Extrato total sem (-) IPTG e com (+) IPTG; fração solúvel (FS) e fração insolúvel
(FI) das 3 colônias selecionadas a partir da placa de transformação em E. coli. Em aprox. 40kDa
a proteína de fusão rTrx-(His)6-Cceff1.

4.4 Indução a frio da proteína rTrx-(His)6-Cceff1.

Na indução em larga escala, o primeiro ponto que foi levado em

consideração foi a insolubilidade constatada na expressão em pequena escala por
SDS PAGE 12,5 %. Logo, a partir do estoque de glicerol realizado com a colônia
3 da transformação em E. coli foi realizada uma indução a frio com a temperatura

34
reduzida a 18 °C no tempo de indução com IPTG. Como resultado na figura 18, a
proteína induzida foi identificada em ambas as frações solúvel e insolúvel, apesar
se ser mais forte na insolúvel.

Figura 18. Indução a frio (18 °C) em estirpe de E. coli BL21 (DE3) em SDS PAGE 12,5 %.
Marcador (M); Extrato total sem (-) IPTG e com (+) IPTG; fração solúvel (FS) e fração insolúvel
(FI) da colônia selecionada do estoque glicerol (colônia 3). Em aprox. 40kDa a proteína de fusão
rTrx-(His)6-Cceff1.

4.5 Purificação da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 por cromatografia de afinidade.

A partir da obtenção dos pellets de indução foi realizado a ruptura celular

bacteriana por processos químicos e depois mecânicos para purificar o
sobrenadante (fração solúvel) contendo a proteína heteróloga do fungo C.
cacaofunesta. Por meio da técnica de cromatografia por afinidade de metais de
transição catiônicos, a proteína de fusão com uma cauda de histidina foi eluida à
medida que a concentração do imidazol aumentou visto que a proteína apresentou
sua maior eluição na concentração de 250mmol L-1 (Figura 19).

35
 Figura 19. Purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade em SDS PAGE
12,5 %. Marcador(M); Extrato total(ET); Fração não interagida(FNI); amostras eluídas com as
concentrações de imidazol variando de 50 a 500 mmol L-1). Em aprox. 40kDa a proteína de fusão
rTrx-(His)6-Cceff1 pura.

4.6 Purificação da fração insolúvel da proteína rTrx-(His)6-Cceff1.

Com o pellet da fração insolúvel formando os corpos de inclusão foram

realizados a ruptura celular, clarificação por centrifugação, solubilização e
renaturação da proteína alvo. O isolamento proteico pôde ser comprovado por
SDS PAGE 12,5 % na altura próxima de 40 kDa (Figura 20).

Figura 20. SDS PAGE 12,5 % da indução e purificação por extração da fração insolúvel da
proteína Cceff1 recombinante. Marcador (M); Controles com (+) IPTG e sem (-) IPTG; fração
solúvel (FS) e fração insolúvel (FI) da indução; Amostra 1 sobrenadante armazenado durante
processo de precipitação e limpeza do material contendo proteína alvo e outros contaminantes;
amostras 2-5 com a proteína de fusão rTrx-(His)6-Cceff1 em 40 kDa obtida pura após diversas
precipitações.

36
4.7 Clivagem da proteína de fusão rTrx-(His)6-Cceff1 com Trombina.

Após entrar em contato com a protease trombina durante 24horas, a

proteína rTrx-(His)6-Cceff1 foi clivada como mostra o SDS PAGE 12,5 % (Figura
21). As amostras foram comparadas com a proteína de fusão a fim de evidenciar
a clivagem. A clivagem passou a ser denominada rCceff1.

Figura 21. Clivagem da proteína recombinante rTrx-(His)6-Cceff1, utilizando Trombina, vista em

SDS PAGE 12,5 %. Marcador(M); Nas amostras 1-6 a proteína de fusão com aproximadamente
40 kDa; A amostra 7 corresponde à proteína clivada com aproximadamente 26 kDa; Amostras 8 e
9 proteína rCceff1, após ser eluída na coluna de cromatografia.

4.8 Identificação da proteína por espectrometria de massas.

A análise dos espectros de massas da proteína fundida rTrx-(His)6-Cceff1

tratada com tripsina resultou em um total de 14 peptídeos sequenciados, com uma
cobertura de 53 % dos resíduos de aminoácidos da proteína (Figura 22, Tabela
2). A análise da rCceff1por espectrometria de massas resultou em um total de
cinco peptídeos com uma cobertura de 33 % da proteína (Figura 22, Tabela 3).

37
Figura 22. Confirmação da identidade das proteínas recombinantes rTrx-(His)6-Cceff1 em (A) e
rCceff1 em (B) por espectrometria de massas. A sequência da tiorredoxina está sublinhada. A
sequência da Cceff1 está em negrito. Os peptídeos trípticos sequenciados por espectrometria de
massas estão em vermelho (e em azul quando subsequentes), sempre com o último aminoácidos
sendo uma lisina (K) ou arginina (R).

Tabela 2. Confirmação da identidade da proteína de fusão Trx-(His)6-Cceff1, purificada por

cromatografia de afinidade, por espectrometria de massas.

38
Tabela 3. Confirmação da identidade da proteína rCceff1 purificada por cromatografia de
afinidade, por espectrometria de massas.

4.9 Morte celular na aplicação da proteína Cceff1

A fim de investigar possível atividade biológica da proteína rCceff1, foi

analisado o resultado de sua aplicação por microspray em folhas de S.
licopersicum da variedade Micro Tom. Em um primeiro teste a uma concentração
de 1,45 µmol L-1 e 1,75 µmol L-1 da proteína alvo fusionada rTrx-(His)6-Cceff1,
foram detectadas pequenas lesões no tecido foliar (Figura 23). O período desse
primeiro ensaio, com 24h foi possível identificar o início de uma possível morte
celular e com 48h uma evidência da seca nas regiões marginais das folhas. Em
um segundo ensaio, folhas de tomate foram submetidas a uma concentração de
2 e 3,7 µmol L-1 da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 (Figura 24). Um terceiro teste
(Figura 25) foi aplicada a proteína rTrx-(His)6-Cceff1 a uma maior concentração
de 5 µmol L-1 observando em 24h um forte acometimento das folhas com clorose
e posterior morte celular. Esses ensaios mostraram sintomas mais expressivos ao
decorrer de um período de acompanhamento maior no teste da Figura 26
comparativa, com a proteína de fusão rTrx-(His)6-Cceff1com 4 µmol L-1 e a
proteína clivada rCceff1 com 4,2 µmol L-1.

39
Figura 23. Avaliação da ação biológica da proteína rTrx-(His)6-Cceff1em Solanum licopersicum
(Micro Tom). Controle negativo com a aplicação por microspray do tampão TRIS-HCl 10 mmol L-1
da última diálise da proteína alvo. Testes com a proteína a concentração de 1,45 e 1,75 µmol L-1
avaliados em 5 tempos subsequentes (0 h, 16 h, 24 h, 32 h e 48 h).

Figura 24. Avaliação da ação biológica da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 em Solanum licopersicum

(Micro Tom). Controle negativo com a aplicação por microspray do tampão TRIS-HCl 10 mmol L-1
da última diálise da proteína alvo. Testes com a proteína a uma concentração de 2 e 3,7 µmol L-1
avaliados em 4 períodos subsequentes (0 h, 16 h, 24 h e 48 h).

40
Figura 25. Avaliação da ação biológica da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 em Solanum licopersicum
(Micro Tom). Controle negativo com a aplicação por microspray do tampão TRIS-HCl 10 mmol L-1
da última diálise da proteína alvo. Testes com a proteína a uma concentração maior de 5 µmol L-1
avaliados em 3 períodos subsequentes (0 h, 16 h e 24 h).

Figura 26. Avaliação da ação biológica comparando a proteína fusionada rTrx-(His)6-Cceff1 e a

clivada rCceff1 em Solanum licopersicum (Micro Tom). Controle negativo com a aplicação por
microspray do tampão TRIS-HCl 10 mmol L-1 da última diálise da proteína alvo. Testes com a
proteína a concentração de 4 e 4,2 µmol L-1 avaliados em períodos maiores subsequentes de 0,
2, 4, 6 e 8 dias.

41
4.10 Acúmulo de peróxido de hidrogênio (H2O2)

A proteína fusionada rTrx-(His)6-Cceff1 em uma concentração de 4,7 µmol

L-1 quando comparada com o tratamento com tampão e com água, provocou
aumento na produção de peróxido de hidrogênio no tecido foliar de Micro Tom
(Figura 27). O segundo ensaio com a proteína já clivada rCceff1 em uma
concentração de 4,2 µmol L-1 evidenciou discos também com acúmulo na
produção de EROs quando comparada com o tampão e água (Figura 28).

Figura 27. Aumento do acúmulo de H2O2 na presença da proteína rTrx-(His)6-Cceff1 a uma

concentração de 4,7 µmol L-1 em Solanum licopersicum (Micro Tom).

Figura 28. Aumento do acúmulo de H2O2 na presença da proteína rCceff1 a uma concentração de
4,2 µmol L-1 em Solanum licopersicum (Micro Tom).

42
4.11 Análise de dicroísmo circular (CD)

Com os dados obtidos da análise do comprimento de onda de 190 a 240

m em elipticidade geralmente relatada em miligraus (mdeg), foram gerados dois
espectros nas temperaturas de 25 °C e 95 °C. Os espectro apresentaram pico
mais alto entre os comprimentos 194/195 e o mais baixo entre 209/211 m (Figura
29). Os espectros nas temperaturas de 25 e 95 °C foram similares, indicando que
a proteína rCceff1 é termoestável. A proteína rCceff1 pré-aquecida a 85 oC
provocou sintomas similares ao provocado pela proteína não aquecida, contudo
necessita de futuras repetições em uma maior concentração proteica (Figura 30).
Com o programa K2D3, foram introduzidos os espectros da proteína alvo
clivada da varredura de 190 a 240 m e predito a porcentagem das estruturas
secundárias. Houve aproximadamente 24 % da proteína com Alfa hélice e 22 %
com fita Beta.

Figura 29. Espectro de dicroísmo circular da proteína rCceff1.

43
Figura 30. Teste comparativo de 48 horas com proteína clivada rCceff1 em 25 °C e pré-aquecida
por 10 min a 85 °C, ambas em concentração 1,5 µmol L-1.

5. DISCUSSÃO

Diante da gravidade da doença ocasionada pelo fungo Ceratocystis

cacaofunesta em plantações de cacau e do seu difícil controle, investigações
moleculares têm se tornado excelentes meios para entender melhor a murcha de
ceratocystis em cacaueiro e possivelmente combatê-la. A disponibilização e
manipulação dos genomas de diversos organismo acoplados a técnica de DNA
recombinante potencializou os estudos das proteínas efetoras e sua atividade
crucial na fitopatogenicidade de diversos fungos. Logo, a constante caracterização
de candidatos a efetores tem sido difundida em grupos de pesquisa no sentido de
desenvolver o potencial fito terapêutico a partir do reconhecimento e manipulação
do efetor (ZHAO et al., 2018; PALADINES-REZABALA et al., 2022).
O sequenciamento do DNA de diversas espécies, incluindo os genomas
de espécies fúngicas que ocasionam fitopatologias, é uma premissa essencial
atualmente utilizada nas investigações biológicas. Com o alinhamento de
sequências alvo a partir de bancos de dados anotados com alta confiabilidade é
possível prever similaridades e identificar a filogenia molecular de uma sequência
(CHOWDHURY; GARAI, 2017). Já as técnicas da proteômica associadas aos
procedimentos da genômica e da biotecnologia permitem uma maior

44
compreensão de por exemplo, processos de doenças e dos organismos
causadores (ANDERSON et al., 1998).
Nesse trabalho, a partir de projetos anteriores que envolviam tratamentos
e extrações do secretoma do fungo C. cacaofunesta de meio de cultura com
extrato de cacau foi dada continuação com a seleção de uma proteína secretada
com sequência homóloga no fungo C. platani. Dessa forma, com explorações e
alinhamentos no genoma do fungo C. cacaofunesta, a ORF da proteína candidata
a efetora foi reconstituída, a proteína foi expressa em bactéria e confirmada por
espectrometria de massas e, em seguida, foi empregada em bioensaios com
planta modelo e verificação da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO),
a fim de confirmar a hipótese de que se trata de uma proteína efetora.
Um total de 20 sequências proteicas mais próximas da proteína de C.
cacaofunesta aqui nomeada de Cceff1 foram selecionadas por meio de BLAST.
Em seguida, com o alinhamento foi construída uma história evolutiva no Muscle
do MEGA X (KUMAR et al., 2018) em formato de dendrograma pelo modelo de
Whelan & Goldman (2001) que incluiu a máxima verossimilhança, uma
abordagem com melhores estimativas do processo evolutivo maximizando a
probabilidade dos dados de interesse. Já a montagem dos ramos do dendograma
contou com o conseso bootstrap abordado por Felsenstein J. (1985), que incluiu
1000 réplicas necessárias para representar a evolução dos táxons investigados.
Os grupos formados com o dendograma inclui fungos do filo Ascomycota incluindo
espécies fitopatogênicas como exemplo os gêneros Colletotrichum, Sphorotrix,
Fusarium e Ceratocystis. Além disso, todas as proteínas eram anotadas como
hipotéticas sem função caracterizada.
No mesmo nível de relevância, a busca do peptídeo sinal da proteína
Cceff1 foi crucial para análises in silico. Os peptídeos de sinal são curtos e
localizados no N-terminal de proteínas, conduzindo sinais a fim da secreção
dessas (OWJI et al., 2018). As proteínas efetoras são direcionadas a partir da
célula para o retículo endoplasmático, são clivadas por co-tradução e quando
madura são secretadas pelo Golgi. Além disso, os peptídeos de sinal participam
do reconhecimento de proteínas receptoras de plantas envolvidos com genes de
avirulência (DALIO et al., 2017; ZHANG et al., 2020).
Para Garg et al. (2016), é de suma importância identificar as propriedades
físico-químicas de uma proteína alvo pois essas características refletem

45
possivelmente a sua funcionalidade e estrutura. Para auxiliar na caracterização e
evolução molecular da proteína candidata, alguns parâmetros foram investigados
e deduzidos com plataformas de bioinformática.
O ponto isoelétrico (pI) da proteína Cceff1 compreende o valor do pH que
a molécula não carrega carga elétrica líquida e, com isso, ambas as cargas
positivas e negativas são idênticas. Além disso, em um pH abaixo do seu pI as
proteínas são carregadas positivamente e em um pH acima do seu pI são
negativas (TOKMAKOV; KUROTANI; SATO, 2021). Na prática, o pI calculado é
utilizado na otimização do pH do tampão em etapas subsequentes de troca iônica
(WINGFIELD, P.T. 2015), como exemplo a definição do pH tampão da diálise da
proteína purificada, a fim de evitar precipitações.
O índice de instabilidade revela de forma indireta a estabilidade
metabólica da proteína. A escala de estabilidade indica que valores inferiores a
40 pode classificar a proteína como estável, já valores superiores a 40 preveem
uma proteína instável (GURUPRASAD, et al., 1990). Em ambas as condições da
proteína sendo fusionada ou clivada o índice de instabilidade foi menor que 40,
classificando-a como estável. Já o coeficiente de extinção da proteína fornece
base para estimar a concentração molar mediante uma absorbância de 280 ƞm.
Esse comprimento de onda é fortemente absorvido pelas proteínas e a lei de
Lambert-beer fornece tal relação matemática (GRIMSLEY; PACE, 2004).
A determinação da hidropaticidade dos aminoácidos da proteína Cceff1
foi a partir de um programa computacional que utiliza escala baseada na partição
dos solutos entre água e solventes apolares de Kyte & Doolittle (1982). A maior
porção proteica tem seus aminoácidos hidrofílicos, com a exceção do peptídeo
sinal predominantemente hidrofóbico e quatro picos de hidrofobia ao longo da
cadeia polipeptídica. A curva de hidropaticidade exibe a distribuição dos resíduos
polares e apolares da sequência proteica alvo de forma empírica (KYTE;
DOOLITTLE, 1982).
A proteína candidata apresentou dois picos de desordem, o primeiro no
início da sequência e o segundo no final totalizando 54 aminoácidos
desordenados. De acordo com Marín et al. (2013), regiões de desordem intrínseca
em uma proteína são segmentos flexíveis que não apresentam estrutura
secundária em condições fisiológicas mas podem dobrar-se com estímulo em
interações proteína-proteína. Essas regiões demonstram poucos resíduos

46
hidrofóbicos resultando em alta heterogeneidade sequencial e estrutural de
proteínas.
Proteínas efetoras são intrinsecamente desordenadas o que pode ser
crucial na translocação efetora, evasão do sistema imune inato e no mimetismo
da função do hospedeiro. Visto que as interações planta-patógeno são dinâmicas
de forma evolutiva e fisiológica, efetores fúngicos apresentam essa característica
de desordem por meio de forte seleção evolutiva positiva (YANG et al., 2020).
A presença de modificações pós-traducionais em proteínas de fungos
pode atuar em vários processos biológicos como virulência e morfologia. A
proteína Cceff1 apresenta predição de alta taxa de fosforilação, a qual é
classificada como reversível e chave molecular de forma regulatória em
mecanismos celulares, metabolismo, ciclo celular e patogenicidade
(ALBATAINEH; KADOSH, 2016). Proteínas efetoras afetam o metabolismo e
imunidade de plantas hospedeiras e muitas são fosforiladas, como por exemplo,
para atuar na supressão de defesa da planta (LEI et al., 2020). Além disso, as
modificações preditas nas regiões intrinsecamente desordenada das proteínas
apresentam maior probabilidade de ocorrer do que aquelas de regiões enoveladas
que se tornam inacessíveis.
A predição computacional de secreção subcelular, reconhecimento de
domínio ou motivo conservado específico de fungos fitopatógenos, bem como a
presença do peptídeo sinal são critérios fortes para indicar uma proteína como
candidata efetora secretada (CSEP) (DALIO et al., 2018). A proteína Cceff1
evidenciou secreção extracelular para a parede celular, bem como regiões
conservadas do domínio ou família Alt a1 que engloba os fungos ascomicetos do
gênero Alternaria, com algumas espécies sendo patógenos vegetais.
A homologia dessa região gênica define uma família estrutural de
proteínas diferenciadas. Um relato mostrou que em Alternaria proteínas com essa
região estão localizadas na parede celular dos esporos desses fungos mediando
a patogenicidade bem como, a existência de um padrão intramolecular de ligações
dissulfetos em todos os homólogos de Alt a 1, visto que os resíduos de cisteína
são altamente conservados (CHRUSZCZ Et al., 2012).
O primeiro membro de Alt a 1 foi o AA1 de A. alternata sendo fonte do
nome da família. Seus homólogos evidenciam germinação de esporos, indução
de necrose e acúmulo de ERO e expressão de genes de defesa. Diversos genes

47
AA1 com atividade elicitora foram reconhecidos em mais de 70 espécies de fungos
como exemplo em Alternaria brassicicola, Magnaporthe oryzae e Verticillium
dahliae, correlacionados com a necrose e murcha vegetal (ZHANG et al., 2019).
A proteína Cceff1 apresenta seis cisteínas com capacidade de formação
de ligações ou pontes dissulfeto. Muitos efetores fúngicos são ricos em cisteínas
com seus grupos tiol da cadeia lateral oxidando e formando as ligações dissulfeto
intramoleculares (YU et al., 2022). Essas ligações covalentes executam a
importante função de estabilidade e do correto dobramento das proteínas.
Outrossim, constata-se também que essa estabilidade conferida pela ligação tem
correlação com proteínas que geralmente são secretadas para o meio extracelular
(SEVIER; KAISER, 2002).
Efetores de avirulência relacionados com indução de morte celular
apresentam a característica em comum de resíduos de cisteína (LIU et al., 2012).
Como exemplo, a proteína RsSCR10 rica em cisteína do fitopatógeno
necrotrófico, Rhizoctonia solani, teve sua atividade elicitora confirmada. Ela
desencadeou morte celular e explosão oxidativa no tabaco, além de confirmar
efeito importante de dois resíduos de cisteína sobre a função indutora (NIU et al.,
2021).
Uma outra abordagem refere-se ao fato de que ligações dissulfeto
promovem a solubilidade das proteínas que as contém. A ligação tem uma parte
polar orientada para superfície externa da proteína participando de reações e
outra parte apolar para o interior atuando na formação de ligações entre
aminoácidos distintos. Entretanto, a respeito da caracterização de proteínas
hipotéticas candidatas a efetoras, suas aplicações necessitam de altos
rendimentos proteicos por meio de sistemas heterólogos, o que para efetores com
muitas ligações dissulfeto pode ser dificultado devido ao não alcance de sua
estrutura naturalmente dobrada no citoplasma bacteriano (YU et al., 2022).
Há um equilíbrio de estado redox nas ligações dissulfeto formadas.
Normalmente, os polipeptídeos das proteínas fúngicas expressas no citoplasma,
um meio redutor em sistema eucariótico são enviados ao retículo endoplasmático
para finalizar seu enovelamento. Contudo, os procariotos não apresentam essa
estrutura, mas sim, o periplasma que compreende um compartimento que se
reduz propício para agir como agente oxidante e formar as ligações dissulfeto
(DE MARCO, A., 2009). As bactérias apresentam duas vias de translocação para

48
o periplasma: a secreção geral ou via Sec e a translocação de arginina dupla ou
via Tat, ambas atuam por meio da membrana plasmática. Além disso, a proteína
deve contar com a presença de um peptídeo de sinal N-terminal que é removido
assim que passa através do Sec-translocon (FREUDL, R. 2018).
Porém, controvérsias são abordadas a respeito de escolher o periplasma
para trabalhar com proteínas recombinantes em laboratório. Tal metodologia
conta com gargalo e baixo rendimento na expressão proteica relacionado ao limite
de transportadores na passagem pela membrana citoplasmática e facilidade na
sobrecarga da proteína (GACIARZ et al., 2017). Comumente, genes que codificam
proteínas recombinantes são expressão em um nível muito alto e com isso, a
proteína carrega o peptídeo sinal que pode saturar a capacidade do Sec-
translocon afetando de forma negativa, seja na formação de biomassas, seja nos
rendimentos da produção proteica pura (KARYOLAIMOS et al., 2019).
Portanto, a expressão da proteína foi no citoplasma, utilizando a ORF
sintética a partir do nucleotídeo 61, eliminando assim, o peptídeo sinal da proteína
Cceff1. O citoplasma bacteriano é um compartimento subcelular com grande
eficiência na acumulação de proteínas recombinantes. Uma proteína obtida
solúvel e funcional é o alvo das pesquisas de biotecnologia atualmente
(SØRENSEN; MORTENSEN, 2005). Contudo, o citoplasma compreende um
ambiente oxidado que atua como agente redutor, o que contrapõe a catalisação
das ligações dissulfeto de proteínas ricas em cisteínas, as quais podem então ser
degradadas ou acumuladas em corpos de inclusão perdendo sua funcionalidade
(NOVAGEN, 2003).
Para isso, foi adotada a estratégia de ligar a ORF de interesse com outro
gene já bem expresso em E. coli, gerando uma proteína fusionada. Nesse sentido,
a tiorredoxina (Trx)derivada do vetor pET-32 a foi fusionada à extremidade amino
da Cceff1. A Trx como proteína redox localizada no citoplasma e com alta
termoestabilidade, tem a capacidade de se reduzir e catalisar a formação de
ligações dissulfeto no citoplasma bacteriano e, também, tende a tornar-se
proteínas ligadas a ela mais solúveis quando ambas estão fundidas. Além do
mais, quando super expressada em vetores plasmidiais, a Trx pode acumular
cerca de 40 % de todas as proteínas celulares no sobrenadante (LA VALLIE et al.,
1993; STEWART et al., 1998).

49
 O sistema pET aplicado nesse trabalho foi desenvolvido para clonagem e
expressão proteica recombinante em E. coli. O gene alvo codificante da proteína
Cceff1 foi clonado em plasmídeo pET contando com o promotor T7Lac, da região
de clonagem da fita codificante, bacteriófago T7 e a origem de replicação fl (+)
para produção de DNA fita simples por meio de fago auxiliar e a T7 RNA
polimerase a qual é extremamente seletiva e tem a maior parte dos seus recursos
celulares convertidos em expressão do gene alvo. Adicionalmente, os diversos
vetores plasmidiais pET apresentam sequências adjacentes na clonagem que
codificam marcadores peptídicos para aprimorar e isolar a proteína alvo
(MIERENDORF et al., 2000; NOVAGEN, 2003).
A seleção do vetor, do hospedeiro e dos marcadores foi visando a máxima
expressão da proteína Cceff1 na fração solúvel. A série vetorial selecionada para
esse projeto foi pET 32a(+) compatível com o marcador de fusão Trx • Tag ™ a
fim de catalisar as ligações dissulfeto e creditar maior solubilidade na proteína
Cceff1 (STEWART et al., 1998). O marcador de fusão His • Tag® também foi
acrescentado com o propósito de facilitar a purificação da proteína candidata por
cromatografia de afinidade, tanto solúvel quanto insolúvel pois a afinidade pode
ser realizada sob ambientes totalmente desnaturantes (MIERENDORF et al.,
2000).
A combinação entre vetores elaborados para expressão bacteriana
citoplasmática em hospedeiros permissivos para formar ligações dissulfeto pode
aprimorar o dobramento proteico. Logo, para a transformação, a cepa hospedeira
selecionada foi BL21(DE3), pois contendo a mutação para Trx, teoricamente, pode
produzir maiores níveis de proteína Cceff1 solúvel. Para mais, BL21 é deficiente
nas proteases Lon e OmpT com funções de degradar, respectivamente proteínas
estranhas e extracelulares, e utilizando essa cepa não ocorreu perda de
plasmídeo pois há uma interrupção da metilação e degradação de DNA devido a
uma mutação hsd presente em sua cepa parental (ROSANO; CECCARELLI,
2014).
A partir da clonagem de DNA com o gene alvo (BIOMATIK), o vetor
plasmidial que codifica a proteína candidata e resistência à ampicilina foi
transformado em E. coli quimicamente competentes por meio da estirpe
BL21(DE3). Com o choque térmico aplicado foi possível aumentar a
permeabilidade da membrana celular bacteriana facilitando a inserção do DNA

50
plasmidial para que os mecanismos intracelulares da bactéria pudessem
decodificar a sequência e, assim, super expressar a biomolécula desejada de
forma recombinante (LI et al., 2007).
A expressão da proteína heteróloga contou com a indução bioquímica
utilizando o isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Sob o promotor T7
direcionando a transcrição gênica e com o gene controlado pelo operador lac, o
IPTG foi adicionado para induzir a expressão da proteína. Diante do conhecimento
de que a proteína repressora Lac, codificada pelo gene LacI, regula o acesso à
sequência de codificação e, consequente, transcrição do DNA alvo a adição do
IPTG no meio de cultura desencadeou a produção e indução da RNA polimerase
T7 endógena de E. coli ligada ao operon, que por sua vez transcreveu o DNA alvo
no plasmídeo bacteriano e super expressou a sequência peptídica da candidata.
Tal fato se concretizou devido à analogia estrutural não metabolizável da
alolactose pela molécula de IPTG, que atua como indutor do operon (BRIAND et
al., 2016; GOMES et al., 2020).
A análise do extrato proteica de bactéria transformada com pEt-32a-
Cceff1 em SDS PAGE 12,5 % mostrou a presença da proteína rTrx-(His)6-Cceff1
na fração solúvel, contudo, alto nível de acúmulo nas frações insolúveis. No
citoplasma, as proteínas podem se encontrar como corpos de inclusão que são
agregados não ordenados devido ao desdobramento ou mau dobramento
(GACIARZ et al., 2017). Técnicas para indução e purificação da proteína Cceff1
foram aplicadas, como a tentativa de expressão na fração solúvel em baixas
temperaturas seguida de purificação por cromatografia de afinidade e o
isolamento dos corpos de inclusão e posterior redobragem in vitro da proteína.
Além da fusão com a Trx, a indução em larga escala da proteína Cceff1
propensa à agregação foi em temperatura reduzida de 18 ºC. Ao contrário da
indução comum de 37 ºC, a indução a frio auxiliou na direção da expressão da
sequência proteica recombinante de forma solúvel pois essa técnica limita a
agregação, reação que é favorecida em temperaturas mais altas. Tal fato se
explica pois há uma forte dependência das interações hidrofóbicas com altas
temperaturas. Entretanto, há uma redução na quantidade de biomassa para se
obter proteína solúvel. A diminuição da concentração proteica celular favorece seu
dobramento (SØRENSEN; MORTENSEN, 2005).

51
 Na sequência, o isolamento da proteína alvo marcada com a “tag” de poli-
histidina foi por meio de cromatografia de afinidade a quelato de níquel. O princípio
utilizado para a purificação foi o de afinidade de biomoléculas por íons metálicos.
Os íons metálicos imobilizados em resina são responsáveis pela adsorção das
proteínas e essa afinidade foi explorada na separação da proteína rCceff1.
Segundo Bresolin et al. (2009) um agente quelante com pares de elétrons
promove a formação de um centro de adsorção ao ser acoplado em uma matriz
sólida por ligações covalentes e que imobiliza um íon metálico por ligações de
coordenação em seus átomos de nitrogênio, oxigênio ou enxofre de sua estrutura.
O íon metálico se torna quelatado e o centro de adsorção de biomoléculas se
forma com sítios livres para interação.
O agente quelante utilizado foi o TRIS (carboximetil)etilenodiamina, que
contém cinco pares de elétrons sendo polidentado e demonstra alta estabilidade
em ligações de coordenação quelatando o íon Ni2+. Por sua vez, o íon metálico foi
o Ni2+ comumente manipulado em purificação de proteínas com resíduos de
histidina, o qual interage com o nitrogênio aromático do grupamento imidazol
presente nesse aminoácido (PORATH; OLIN, 1983).
A partir do princípio da tecnologia do DNA recombinante, a proteína
Cceff1 marcada com a “tag” ou “cauda” de histidina, que apresenta as espécies
doadoras de elétrons, interagiu em solução com o íon metálico Ni2+ quelatado e
imobilizado. Essa afinidade diferencial se deve as ligações de coordenação
reversíveis entre o quelato e o grupamento superficial da histidina que é o
imidazol. Logo, a proteína na fase móvel é adsorvida e as outras partículas
eluídas. A biomolécula passou por uma eluição de afinidade ou dessorção isolada
para o meio pelo método de adição de um agente competidor na fase móvel por
um gradiente linear. O imidazol com forte afinidade e interação pelo sítio de
ligação do íon metálico compete com a proteína e a dessorve. Por fim, o último
procedimento contou com a remoção desse agente competidor do meio com a
proteína eluída. A diálise com o Tris-HCl tamponante em equilíbrio iônico reduziu
consideravelmente o imidazol (BRESOLIN et al., 2009).
Um segundo método de purificação foi extraindo a fração insolúvel da
proteína alvo por soluções detergentes e desnaturantes acompanhadas de
sonicação, centrifugação e redobragem in vitro. De acordo com Mierendorf et al.
(2000), a vantagem desse procedimento consiste no fácil isolamento da proteína,

52
proteção da proteína contra o ataque proteolítico e proteínas tóxicas em formato
inativo não inibe o crescimento celular. Contudo, a efetividade da redobragem em
proteína ativa é relativa e pode ser fraca.
A interação dos corpos de inclusão com os ácidos nucleicos bacterianos
faz com que estes se localizem no pellet após a retirada da fração solúvel. Esse
agregado contém três camadas: clara sendo superior e menos densa
correspondendo a membrana externa bacteriana e fragmentos de
peptideoglicano; intermediária contendo a proteína do corpo de inclusão e escura
compactada no fundo do tubo equivalente a células intactas. Os primeiros passos
combinando rompimento celular bacteriano mecânico e enzimático é vantajoso
para evitar células não quebradas mantidas na extração da proteína insolúvel pura
(WINGFIELD 2015).
A proteína insolúvel foi extraída com a ureia, um agente catrópico
desnaturante de proteína com foco em interromper as interações proteína-
proteína, promovendo a desagregação e desdobramento dos monômeros. O uso
da ureia contou com removedor de cianato, o tampão à base de Tris, a fim de
evitar a carbamilação da proteína (STARK et al., 1960). As centrifugações tiveram
o objetivo principal de clarificação do pellet, removendo a maior quantidade de
contaminantes e mantendo a proteína insolúvel. Já a solubilização da proteína foi
mantida com o glicerol, um aditivo co-solvente que atua reduzindo agregação
intermolecular entre as superfícies hidrofóbicas proteicas. Por fim, o redobramento
proteico contou com uma diálise com gradiente de ureia reverso, retirando o
desnaturante em condições mínimas de agregação proteica possibilitando a
correta catalisação das ligações dissulfeto (WINGFIELD 2015).
A tecnologia de espectrometria de massas (S) aplicada a peptídeos foi
utilizada na identificação da proteína fusionada rTrx-(His)6-Cceff1 e da clivada
rCceff1. O espectrômetro de massas contém uma fonte de íons, analisador de
massas, detector e um sistema de dados obtidos. O fundamento aplicado incluiu
em primeiro plano proteínas purificadas sendo convertidas em conjuntos de
peptídeos. Essa reação deve ser catalisada com enzimas que promovam
clivagem de proteínas em regiões específicas (SHEVCHENKO et al., 2007). A
enzima utilizada foi a tripsina que cliva a cadeia polipeptídica especificamente na
região C-terminal dos aminoácidos lisina (K) e arginina (R) (FURLANI et al. 2020).
Assim, os peptídeos logrados foram ionizados e levados ao massas.

53
 As amostras foram analisadas baseando-se no eficiente método de
contagem total de íons ou intensidade total registrada com LC-MS, identificando
e quantificando peptídeos específicos. A fonte de íons presente ioniza os
peptídeos preservando a sua estrutura e os transfere para análise em fase
gasosa. Há uma relação entre a massa e a carga (m/z) das espécies ionizadas
em fase gasosa a qual é aplicada pelo analisador de massa separando os íons
formados. E em conclusão, os resultados correlatos a massa molecular e a
sequência de aminoácidos dos peptídeos são aplicados em softwares de busca
para identificar as proteínas em bancos de dados (CANTU et al., 2008). Para a
confirmação da identidade da rCCeff1 foi criado um banco específico a partir da
sequência proteica fusionada.
Nos aspectos de aplicação da proteína alvo, apesar das plantas não
apresentarem defesa móvel ou sistema imunológico adaptativo, elas progrediram
um sistema imune inato para reconhecimento e resposta contra patógenos,
incluindo indução de respostas antimicrobianas, explosão oxidativa, deposição de
calose, reforço da parede celular e aumento na expressão gênica (WANG et al.,
2020a). Logo, tendo em vista o desencadeamento de uma resposta de
hipersensibilidade em uma possível imunidade desencadeada por efetores,
alguns dos efeitos fundamentais é o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e
a morte celular programada (SPOEL; DONG, 2012).
A partir da aplicação da proteína rCceff1 em S. licopersicum, ocorreu de
maneira concomitante a produção de lesões necróticas a partir das bordas foliares
evoluindo para deformações no limbo e a maior indução de peroxidação e o
acúmulo de H2O2 nos discos foliares, podendo apresentar uma forte conexão
entre uma resposta de hipersensibilidade da planta modelo na presença da
proteína elicitora.
Em um estudo de Dalio et al. (2017) foi abordado que efetores
necrotróficos podem incluir as fitotoxinas capacitadas em degradar parede celular
e que podem ser gerais ou específicas de hospedeiros. Muitas plantas são
sensíveis a essas toxinas identificadas como componentes cruciais na
patogênese, as quais acabam sendo classificadas como grandes efetores de
fungos necrotróficos por apresentarem atributos de genes de avirulência. Quando
as plantas são suscetíveis há um reconhecimento dessas toxinas que iniciam

54
morte celular tendo como exemplo fungos do gênero Alternaria com esse
mecanismo classificado como principal em seu sucesso patogênico.
Como representação semelhante de estudos de caso, uma revisão a
respeito de efetores fúngicos apoplásticos que induzem morte celular vegetal
incluiu proteínas efetoras do domínio CFEM com cisteínas conservadas e
exclusivo dos fungos, com exemplares em Magnaporthe oryzae, Fusarium
graminearum e Botrytis cinerea exibindo clorose e morte celular programada; e
também proteínas da família NLP com domínio comum NPP1 e presente em
oomicetos, fungos e bactérias, com o exemplo em Fusarium oxysporum
demonstrando indução de necrose, expressão de gene PR e produção de ERO
(LI et al., 2020).
Em seguida, a análise de dicroísmo circular (CD) ou também denominada
espectroscopia de luz polarizada foi um procedimento aplicado para investigar a
estrutura secundária de proteínas e peptídeo, além de testar o comportamento
proteico em diferentes temperaturas. Os espectros de proteínas na região
ultravioleta (180/250ƞm) ocorrem por transições eletrônicas de grupos amida. O
dicroísmo circular corresponde a moléculas que quando são opticamente ativas
absorvem luz circular polarizada com dois estados de momento angular um para
a esquerda (LHC) e outro circular direita (RHC), visto que tal efeito se deve a
diferentes índices de refração rotacionando o plano de polarização da luz
(FASMAN, 1996).
Uma das aplicações com a ferramenta CD foi buscar possíveis mudanças
na conformação da proteína Cceff1 em função da temperatura, ou seja, como a
estrutura secundária da biomolécula poderia mudar. Conceitualmente, esse teste
pode demonstrar informações termodinâmicas da proteína como a entalpia e a
energia livre de Gibbs de desdobramento. Assim, a investigação inicial da
conformação nativa da proteína para experimentos a 25 °C e 95 °C validou a sua
estabilidade térmica mostrando a sobreposição dos espectros em temperatura
ambiente e temperatura elevada (GREENFIELD, 2006). Com isso, foi realizado
um teste em plantas de S. licopersicum variedade Micro Tom que evidenciou
sintomas e, consequentemente a forma biologicamente ativa da proteína mesmo
após pré-incubação por 10 min a 85°C. Próximos experimentos precisam ser
realizados sob alta concentração molar.

55
 Ademais, outra análise incluiu que os elementos estruturais secundários
apresentam espectros característicos, como a α-hélice com bandas negativas em
222 e 208 ηm e uma banda positiva em 193 ηm; folhas β-pregueadas com bandas
negativas em 218 ηm e positivas em 195 ηm e proteínas desordenadas com
elipticidade baixa acima de 210 ηm e bandas negativas em 195 ηm e proximidades
(GREENFIELD, 2006). Assim considerado, a proteína Cceff1 conta com a
presença de α-hélice e folhas β-pregueadas, com base no seu espectro de CD.
A respeito disso, Sonah et al. (2016) revelou que a identificação de
estruturas secundárias semelhantes pode ser uma abordagem promissora na
identificação de efetores funcionais. Por exemplo, pesquisas relataram efetores
com o motivo RxLR com abundância de alfa-hélices curtas no terminal C, o que
demonstra que a compreensão da relação das estruturas das moléculas efetoras
pode melhorar a identificação de efetores conservados.

6. CONCLUSÃO

o A proteína Cceff1 apresenta características computacionais fortes de

candidata a efetora como peso molecular entre 5 e 50 kDa, peptídeo sinal,
secreção subcelular incluindo parede celular, ligações dissulfeto conservadas,
homologia em domínio patogênico Alt a 1, desordens intrínsecas, fosforilações
e poucos aminoácidos hidrofóbicos;
o A proteína Cceff1 é expressa na fração solúvel e insolúvel do extrato de E.
coli;
o O procedimento de purificação por extração da fração insolúvel com
desnaturação por ureia e, posterior dobramento é eficaz para a proteína Cceff1;
o A proteína Cceff1 em 40 e 26 kDa do SDS PAGE foi identificada por
espectrometria de massas;
o A clivagem da proteína com sítio de protease fusionado foi eficaz com a serino
protease Trombina, em condições específicas;
o A aplicação da proteína causou morte celular e acúmulo das espécies reativas
de oxigênio (ERO);
o A proteína Cceff1 é estável em maiores temperaturas e apresenta estrutura
secundária α-hélice e folhas β-pregueadas de acordo com o CD.

56
 Diante dessas investigações foi possível iniciar a caracterização da forte
candidata a proteína efetora Cceff1. Sua capacidade de causar morte celular e
desencadear produção de espécies reativas de oxigênio mostrou forte indução
de respostas de defesa da planta. Como perspectiva, próximos experimentos
devem testar o efeito da proteína sobre a taxa de fotossíntese, extravasamento
de eletrólitos, aplicação da proteína em concentração molar acima de 5 µmol L-
1 para ampliar as informações acerca da possível função elicitora da proteína
Cceff1 de C. cacaofunesta, bem como a identificação de seu potencial alvo em
plantas modelos.

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