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São Cristóvão-SE
2010
Daniele Silva dos Santos
de Pós-Graduação em Química da
São Cristóvão
2010
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
90 f. : il.
CDU543.06
Este trabalho é dedicado a
DEUS, pela enorme força
e a coragem inexplicável
durante esses dois anos de
mestrado!
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu querido orientador Prof. Dr. Paulo Cesar de Lima Nogueira que
proporcionou a realização desse trabalho, depositando sua confiança e
acreditando em mim, o que me fez acreditar em mim mesma.
Página
LISTA DE FIGURAS...................................................................... i
RESUMO....................................................................................... ix
ABSTRACT.................................................................................... x
1. INTRODUÇÃO............................................................................ 01
(CG/EM).......................................................................................... 11
2. Referência Bibliográfica.......................................................... 17
2.2 Alquilamidas.............................................................................. 18
4. Parte Experimental..................................................................... 24
4.1 Materiais..................................................................................... 24
4.2 Reagentes................................................................................ 25
melhoramento genético................................................................. 28
4.8.1 Linearidade.............................................................................. 31
4.8.3 Precisão.................................................................................. 33
4.8.4 Exatidão................................................................................... 34
5. Resultados e Discussão............................................................ .. 35
5.6.1 Especificidade....................................................................... 57
5.6.2 Linearidade........................................................................... 58
5.6.4 Precisão................................................................................ 61
5.6.5 Exatidão................................................................................. 61
6. Conclusão................................................................................... 62
7. Referências............................................................................... 63
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 7: (2E,7Z)-N-isobutil-2,7-tridecadieno-10,12-dienamida............. 19
Figura 8: (7Z)-N-isobutil-7-trideceno-10,12-dienamida.......................... 19
Figura 9: (2E,6Z,8E)-N-isobutil-2,6,8-decatrienamida............................ 19
13
Figura 31: Espectro de C-RMN DEPT 135 do espilantol ampliado
entre 17.5-47.5 ppm (100 MHz, CDCl3)................................................ 53
13
Figura 32: Espectro de C-RMN DEPT 135 do espilantol ampliado
entre 122-147 ppm (100 MHz, CDCl3)............................................... 53
Página
CG Cromatografia a Gás
S Fator de escalonamento
tr Tempo de retenção
δ Deslocamento químico
RESUMO
Spilanthes acmella (L.) Murray (Asteraceae) é uma planta nativa da América do Sul
conhecida popularmente como jambú. Esta planta é usada como condimento em pratos
típicos da Região Norte como o tacacá e o pato no tucupi e tem aplicação na medicina
tradicional para tratar dor de dente, estomatite e doenças da garganta. Além disso,
várias propriedades terapêuticas foram relatadas para S. acmella tais como antiviral,
antibacteriana, anti-séptica, diurética, antiinflamatória e cicatrizante. Espilantol é o
constituinte majoritário das flores desta espécie, o qual está associado a várias
atividades biológicas: analgésica, larvicida, inseticida, antimicrobiana, fungicida, etc.
Atualmente, extratos de jambú e o espilantol são usados como ingredientes para
cosmético antienvelhecimento. Diante do exposto, este trabalho relata o
desenvolvimento de um método analítico por CLAE-DAD para determinação de
espilantol em amostras de S. acmella. Neste estudo foram utilizadas amostras dos
acessos de S. acmella (planta inteira fresca e suas partes: folhas, caules e
inflorescências frescas e secas) cultivadas e coletadas no Campus Rural da UFS. As
condições de análise utilizando o sistema CLAE-DAD Shimadzu LC 20A Prominence
foram: coluna analítica C18 Luna® (250 mm x 4,6mm, 5 m) Phenomenex; eluição
gradiente no modo reverso, utilizando como fase móvel MeOH(B): H2O(A): 85% (A) por
6 min., 85-100% (A) por 1 min., 100% (A) por 5 min.; 100-85% (A) por 1 min.; 85% (A)
por 10 min; vazão 1,0 mL/min; volume de injeção 25 µL e os cromatogramas obtidos
em =230 nm. Espilantol foi usado como padrão de referência (t r=5,1 min). O método
foi validado conforme RE n o 899/03 (ANVISA). A linearidade foi determinada pela curva
de padrão externo (r2=0,9997) e por adição de padrão (r 2=0,9995). O limite de
quantificação e de detecção foram 0,7 e 0,1 µg/mL, respectivamente. A repetibilidade
apresentou coeficientes de variação (CV%) entre 0,21 a 2,85% e a exatidão, expressa
como percentual de recuperação, variou de 100,2 a 103,3%. O método foi aplicado em
41 amostras de S. acmella incluindo amostras oriundas de melhoramento genético. As
amostras da flores seca e do acesso J-05 apresentaram o maior teor de espilantol
(101,2 µg/mL e 120,5 g/mL, respectivamente). Esse trabalho apresenta uma
contribuição ao controle de qualidade de extratos de S. acmella.
Palavras-chave: Asteraceae, Spilanthes acmella, espilantol, CLAE-DAD.
ABSTRACT
CH3
N
H CH3
H 3C
O
H
H H
OH
HO OH
O
HO O
OH
H H
OH
CH3
OH
CH3 H
O H 3C
HO
O H 3C
HO O
O H 3C
O H OH
OH O
O
Ac O
HO
HO H
H 3C O CH3
HO CH3
HO CH3
CH3 O CH3
Ser simples;
Ser rápida;
Ter custo baixo;
Fornecer extratos relativamente livres de interferentes;
Ter recuperação alta, com boa exatidão e precisão, para os analítos de
interesse.
Em geral, o procedimento de EFS contém cinco etapas:25,26
iv) limpeza da coluna para retirar os interferentes menos retidos que o analito;
2.2 Alquilamidas
HC CH3
N
H
H 3C
Figura 7: (2E,7Z)-N-isobutil-2,7-tridecadieno-10,12-dienamida
HC CH3
N
H
H 3C
Figura 8: (7Z)-N-isobutil-7-trideceno-10,12-dienamida
O
CH3
H 3C
N
H
H 3C
Figura 9: (2E,6Z,8E)-N-isobutil-2,6,8-decatrienamida
O
CH3
HC N
H
H 3C
H 3C CH3
N
H
H 3C
O
Figura 11: (2E, 7Z)-N-isobutil-2,7-decadienamida
O
CH3
HC N
H
H 3C
HC
N
H
O
O
CH3
HC N
H
H 3C
O
CH3
H 3C N
H
H 3C
2.3 Espilantol
O espilantol, [(N-2-metilpropil)-2,6,8-decatrienamida ou N-isobutil-
2E,6Z,8E-decatrienamida)] (FIGURA 9), é uma alquilamida alifática de fórmula
molecular C14H23NO, descrita como um óleo viscoso ardente, de coloração
amarelo pálido a amarelo claro, que produz um efeito anestésico e de
formigamento sobre a língua.52 É o maior constituinte encontrado nas espécies
Spilanthes e apresenta atividade inseticida contra ovos e larvas de Culex e
mosquitos de Aedes. É tradicionalmente usado em tratamento de dores de
dente, estomatite, e doenças de pele.58 Também tem sido muito usado na
fabricação de cosméticos, como cremes para higiene pessoal, em produtos
anti-rugas e relaxantes musculares.58
Delarcina e colaboradores59 desenvolveram um processo de preparação
de extrato de jambú livre de clorofila aplicado em diversas composições
cosméticas. Flammer e colaboradores60 patentearam formulações de produtos
de higiene pessoal tais como xampus, sabonetes e cremes contendo espilantol
na formulação como princípio ativo potencializando a sensação de refrescância
de seus produtos.
4.1 Materiais
Os espectros de RMN 1H e 13
C foram obtidos em um espectrômetro
Bruker (Rheinstetten, Alemanha), modelo Avance de 9,4 Tesla, operando a 400
MHz para freqüência do hidrogênio e 100 MHz para o carbono, utilizando-se
uma sonda de 5 mm BBI e/ou BBO e mantendo-se a temperatura constante de
298 K, durante todos os experimentos. Utilizou-se como referência interna o
TMS (tetrametilsilano). Os deslocamentos químicos ( ) foram expressos em
partes por milhão (ppm) e as multiplicidades dos sinais foram indicadas
seguindo a convenção: s (simpl eto), d (dubleto), dd (duplo dubleto), t (tripleto),
dt (duplo tripleto), m (multipleto). Estes experimentos foram realizados através
de colaboração com o Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do
DQ/UFSCar através de colaboração com o Prof. Dr. Antonio Gilberto Ferreira.
4.2 Reagentes
Equação 1:
onde:
S = escalonamento
4.8.1 Linearidade
Equação 2:
onde:
= desvio padrão
coeficiente angular.
Equação 4:
Onde:
= desvio padrão
coeficiente angular
4.8.3 Precisão
Equação 5:
Onde:
X= concentração teórica
5. Resultados e Discussão
a b
1
1
1
c
1
c
a 1 b
a)
1
b)
c)
Inflorescência fresca
Folha fresca
Caule fresco
Inflorescência seca
Folha seca
Caule seca
V10
V05
V04
V03
N07
N03
N02
N01
1
J- 05
J- 03 J- 04
J- 06 J- 07 J- 08
1
1 1
J- 10 J- 12
J- 09
1
1 1
1
J- 13 J- 14 J- 16
J- 17 J- 19 J- 21
1 1
J- 23 J- 25 1 J- 26
1 1
1 J- 27 J- 28 J- 29
1
J- 33 J- 36
J- 31
1 1
1
J- 38 J- 40 J- 4x
1
1 1
a 1
149
167
41 81 OH⁺
A
b
s
N
o H
r
b
â
n
ci
a
(m/z)
143.61
129.96
129.45
127.66
126.69
124.10
77.33
77.01
76.70
46.86
32.10
28.59
26.38
20.13
18.31
0.00
8
5
3 O 1'
2'
10 3'
1
N
9 7 6 4 2
H
4'
143.61
129.96
129.45
127.66
126.69
124.10
8 3 O
1
N
7 6 4 2
H
7
8
6
3 4 2
170.0 165.0 160.0 155.0 150.0 145.0 140.0 135.0 130.0 125.0 120.0
ppm (f1)
13
Figura 30: Espectro de C-RMN do espilantol ampliado entre 120-170 ppm
(100 MHz, CDCl3).
46.86
32.10
28.59
26.38
20.13
18.31
5 O 1' 3'
10
N 3'
4 2'
H
5
4
1' 2'
10
47.5 45.0 42.5 40.0 37.5 35.0 32.5 30.0 27.5 25.0 22.5 20.0 17.5
ppm (f1)
13
Figura 31: Espectro de C-RMN DEPT 135 do espilantol ampliado entre 17.5-
47.5 ppm (100 MHz, CDCl3).
143.62
129.97
129.45
127.66
126.69
124.10
8 3 O
7
N 6
8
2
7 6 2
9 H 9
3
147.5 145.0 142.5 140.0 137.5 135.0 132.5 130.0 127.5 125.0 122.5
ppm (f1)
13
Figura 32: Espectro de C-RMN DEPT 135 do espilantol ampliado entre 122-
147 ppm (100 MHz, CDCl3).
Figura 34: Espectro de 1H-RMN do espilantol ampliado 5,33-6,83 ppm (400
6
3´ e 4´
0.0000
1.7228
0.9181
0.9348
1.7390 0.95
1.7692 5.2504
1.7701
1.7856 5.2772
5.33
0.0
1.8140
1.8308
2.2530
6.81 1.06
2.2691
N-H
2.2841
5.50
Figura 33: Espectro de 1H-RMN do espilantol (400 MHz, CDCl3).
2.2984 5.4707
2.3149
5.6573
2.3317
2´ e 10
5.06
5.6739
2.3515
5.6911
3.1347
9
5.52 5.7111
5.67
3.1508 5.7282
1.07
4e 5
3.1670 2.5
5.7450
5.2504
5.7678
5.2590 1.10
5.2677 2.23 5.7713
5.2772 5.7745
1´
5.83
5.2943 5.8060
2
5.8095
3´
5.4707
5.6573
5.6739 5.9476
1.00
5.6911
4´
6.00
5.9749
2´
5.7111
7
5.7282 6.0019
5.7450
1´
5.0
5.7678
6
0.95
5.7713
N
H
N
H
1.06
5.7745 6.2570
6.17
1
5.8060 2e 9 1.07
1.10 6.2605
O
O
1
2
0.92 0.92
5.9749 6.2883
8
8
8
6.0019 6.2914
6.33
3
3
8
8
6.2942
8
6.2570
3
8
8
1.01
6.2605 6.2975
4
8
8
6.2636 6.3010
6.2846 6.3254
5
8
6.2883
8
7.5
6.50
6.2914
6
6.2942
6.2975
6.3010
7
6.3254
7
6.7907
MHz, CDCl3).
8
8
8
6.67
8
6.8067
6.8233
6.8288
9
8
8
9
6.8448 6.7907
6.8615 6.8067 1.01
7.2642 6.8233
6.83
10
88
6.8288
ppm (f1)
10.0
ppm (t1)
6.8448
3
6.8615
5.7 Validação do método
5.7.1 Especificidade
A especificidade do método cromatográfico pôde ser determinada pela
comparação dos perfis cromatográficos obtidos da solução padrão (FIGURA
35-a) e dos extratos de S. acmella (FIGURA 35-b), demonstrando a
inexistência de quaisquer interferentes nos cromatogramas, independente da
amostra analisada.
a)
1
b)
22 695018,3 98,9
42 1366516,6 102,1
62 1976863,3 100,2
82 2566376,6 98,4
102 3266603,3 100,7
122 3876920,0 99,9
b)
a) Padrão externo Adição de padrão
Padrão Exteno
4000000 y= 3705,01 + 31762,0x 6500000 y=236958+ 31563,05945x
r= 0,9997 ADIÇÃOr=
DE0,9995
PADRÃO
3500000 6000000
3000000 5500000
2500000 5000000
4500000
Área
2000000
ÀREA
1500000 4000000
1000000 3500000
500000 3000000
0 2500000
c)
3000000
2500000 PADRÃO EXTERNO
2000000
1500000
1000000
500000
0
Concentração (µg/mL)g/mL)
CONCENTRAÇÃO(
Figura 36: Curvas analíticas: a) curva por padrão externo, b) curva de adição
de padrão e c) comparação entre as duas curvas obtidas por adição de padrão
e por padrão externo para o método da quantificação de espilantol em
amostras de S. acmella.
5.6.5 Exatidão
2 2,1 105,0
62 63,25 102,01
N07 21,53
N03 23,83
N02 15,08
N01 12,31
V10 95,41
V05 80,09
V04 79,24
V03 74,83
inflor. seca 110,21
folha seca 67,68
caule seca 14,16
inflor. Fresca 98,41
caule fresco 2,54
folha fresca 14,46
0 20 40 60 80 100 120
Concentração (µg/mL)
J-4X 4,82
J-40 82,42
J-38 3,95
J-36 11,76
J-33 8,79
J-31 6,83
J-29 45,95
J-28 8,67
J-27 90,75
J-26 85,95
J-25 6,29
J-23 7,51
J-21 24,75
J-19 10,04
J-17 13,34
J-16 1,09
J-14 2,62
J-13 122,08
J-12 3,72
J-10 5,21
J-09 49,81
J-08 8,78
J-07 7,61
J-06 8,94
J-05 120,5
J-04 35,98
J-03 12,77
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