HPLC-Troubleshooting Desde a Perspectiva do Desenvolvimento de Metodo: Como Evitar os 12 Problemas mais Frequentes Atraves do um Desenvolvimento de Metodos Inteligente

Objectivo
Demonstrar que a maior parte dos problemas podem ser derivados de um desenvolvimento de metodos menos bom nao somente da coluna ou do instrumento. Dar dicas de HPLC troubleshooting seguindo um processo de desenvovimento de metodos inteligente. Responder a algumas questoes:
Porque escolher uma determinada coluna? Porque escolher um determinado comprimento de onda? Porque tampao fosfato 10 mM? Porque acetonitrilo? Proque utilizar certos fluxos e tamanhos de amostras? Qual o papel da temperatura neste processo? Quais sao as melhores ferramentas para uma dada separacao?

Evitar trabalhar nos limites da tecnica

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Resumo
-Os 12 problemas mais frequentes da HPLC -Como enfrentar as diferentes opcoes do processo do desenvolvimento do metodo -Que poderia acontecer se escolhecemos de outra maneira - as vezes mas escolhas -Relacionar cada passo do desenvolvimento com os 12 problemas mais frequentes da HPLC

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Introducao os 12 problemas mais frequentes

Ma resolucao Pico distorcidos Baixa retencao dos compostos polares Tempo para desenvolver o metodo Separacao de pares criticos High throughput (rendimento) Cada um destes problemas poder ser ultrapassado com a utilizacao de estrategias e ferradamentas adequadas
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Diferentes polaridades na amostra Fiabilidade/Robustez Estabilidade das colunas Limites de deteccao reduzidos Scale-up para preparativa

Separacao

A Cromatografia basea-se nas interaccoes diferenciais entre os analitos e o solvent com a fase estacionaria Tipos de interaccoes Dispersivas (hidrofobicas) Polares (dipolo, pontes de H) Ionicas Os metodos devem ser desenvolvidos com base no funcionamento destas interaccoes e no seu mecanismo de controlo e tambem incluindo os limites impostos pelos parametros fisicos: Solubilidade Estabilidade

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Desenvolvimento de Metodos
- Esquema Geral: Compreender os objectivos do metodo: - Ensaio e somente necessario capturar e resolver um dado analito - Pureza e necessario capturar e resolver todas as impurezas da amostra Compreender as propriedades do analito - Ionizacap pKa, - Solubilidade logP/logD, - Absorcao no UV deteccao O processo: - Escolhar a coluna - Escolher a fase movel - Testar e analizar os resultados - Adaptar as condicoes - Testar e analizar os resultados
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I. A escolha da coluna e os 12 problemas

As polaridades da amostra sao muito amplas
Correcto balanco de interaccoes

Forma do pico
- Actividade do silanol

Robustez/fiabilidade
- Estabilidade da coluna

Retencao de compostos polares

- Disponibilidade da interaccoes polares e ionicas

Compatibilidade com a MS
- Baixo sangramento da coluna

Tempo para desenvolver o metodo

- A ferramenta certa acelera o trabalho

Baixo limite de deteccao

- Eficiencia

Scale-up to prep
- Disponibilidade das dimensoes preparativas e de tamanhos de particulas

Separacao dos pares criticos

- Disponibilidade das interaccoes necessarias

High throughput
- Menor dimensao = Analise mais rapida - Selectividade superior = Analise mais rapida

Resolucao
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- Retencao, eficiencia e selectividade

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Definicao de resolucao

N k' D 1 4 1 k' D
Selectividade Retencao

Eficiencia
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N numero de pratos teorico K`- factor de capacidade (coef particao) D - ratio dos k

Exemplo de eficiencia da coluna

Ascentis C18
1. Norfloxacin 2. Ciprofloxacin 3. Lomefloxacin

Outra C18

4 Min

10

4 Min

10

Fase movel: Fluxo: Detector: injeccao: Norfloxacin

HN N N O F

85:15, 10 mM Fosfato potassico monobasico (pH 3.0 com H3PO4): CH3CN 1 mL/min; temp.: 35 C UV aa 254 nm 10 L; 50 g/mLde cada amostra Ciprofloxacin
HN N N O F O OH

Lomefloxacin
HN N F N O F O OH

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OH

Retencao
Compostos de anfetaminas resolvidos numa coluna F5 depois de recuperados de volume morto de uma coluna C18
Methcathinone Co-eluicao Ephedrine

C18

Impureza de Ephedrine

F5 (pentafluorophenyl phase)

Condiicoes Discovery HS F5 e HS C18, 15cm x 2.1mm, 3m; CH3CN:acetato amonico, pH 6.8 (70:30); 200L/min; 35C; esi (+) deteccao, 2L cada amostra, concentracao 25g/mL
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Exemplo do Factor de Separacao ou Selectividade (D)

2 1
1 2

Ascentis RP-Amide

Fase polar eter

4 3 5 6 7

6 7

6 Min

10

12

14

4 Min

Catechol Resorcinol
OH OH

OH

OH

1. Resorcinol 2. Catechol 3. 2-methyl resorcinol 4. 4-methyl catechol 5. 2,5-dimethyl resorcinol 6. 3-methyl catechol 7. 4-nitro catechol

3 5

4 7 6

C18

Fase movel: 75:25, 20 mM acido fosforico (pH 2.0 nao ajustado):acetonitrilo Fluxo: 1.5 mL/min; temp.:30C Detector.: UV, 270 nm Injeccao: 25 L; 50 g/mL em 20 mM acido fosforico pH 2.0 11
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Interaccoes
A retencao e resultado da varios tipos de interaccoes
- Dispersivas: Interaccoes electronicas transientes - Polares: permanenes, dipolos induzidos, pontes de hidrogenio - Ionicas: Intereaccoes de cargas permanentes

As Interaccoes dispersivas sao dominantes em sistemas de fase reversa As fases polares, devido ao seu design, tem interaccoes polares e ionicas Escolha da fase correcta para as interaccoes necessarias num dado metodo de separacao
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Exemplo problema geral de eluicao

VWD1 A, Wavelength=220 nm (DSB\14183813.D) mAU 250 3.923

OH

N
200

piroxicam 2AMP
1.693

NH N S O O
100 150

CH3

H2N

1.445

1.991 2

1.865

50

min

Condicoes: Coluna: Discovery C18, 15 cm x 4.6 mm, 5um Fase movel: 10 mM KH2PO4, pH 2.5, Acetonitrilo (55:45, v/v) Deteccao: UV @220nm
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Exemplo problema geral de eluicao resolvido

mAU

NH N S O O CH3

200

piroxicam 2AMP

150

100

N
50 1.803

H2N
0 0 1

2.479

4.610

OH

VWD1 A, Wavelength=220 nm (DSB\14183815.D)

min

Condicoes: Coluna: Discovery HS F5, 15 cm x 4.6 mm, 5um Fase movel: 10 mM KH2PO4, pH 2.5, Acetonitrilo (55:45, v/v) Deteccao: UV @220nm
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Maior selectividade devido as interaccoes polares

HO
OH
OH

O
OH

O H

cannabinol cannabidiol

'9-tetrahydrocannabinol
HO H

Peak IDs 1. Cannabidiol m/z, 315.5 2. Cannabinol m/z, 311.4 3. '9-tetrahydrocannabinol m/z, 315.5 4. '8-tetrahydrocannabinol m/z, 315.5
1

C18
2 34

Ascentis RP-Amide
2

'8-tetrahydrocannabinol

3 4

15

10 Time (min)

20

30

10 Time (min)

20

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Acelarar o processo de desenvolvimento de metodos

Receives request, available information and samples

Determines most appropriate starting point (usually C18)

Modifies conditions (%organic, organic component, pH)

Acceptable

Not acceptable

Done

Add ion-pair, ion suppression reagents, etc. (force-feed)

Change Stationary Phase

Modify as new data and/or formulations develop

Geralmente uma ma escolha

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Tailing dos picos

O tailing dos picos e causado pelas interaccoes secundarias com a superficie do silanol das colunas C18 As fases C18 nao foram concebidas para tirar partido das vantagens destas interaccoes nao temos controlo Somente parte da populacao de analitos esta sujeita a esta interaccao; portanto, ocorre tailing Uma fase C18 desactivada por base significa que ha menos silanois disponiveis para actuar com as bases As fases polares tiram mais partido das vantagens das interaccoes dos silanois

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Origem do tailing dos picos

+ Ha uma maior retencao de alguns analitos devido ao interaccoes de troca-ionica com silanois ionizados da superficie o Tailing

Tempo
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Origem do tailing dos picos

Somente parte dos analitos tem acesso aos silanois + + + +
OOH

+ + + +
O-

+ +
O

+ + +
OH O-

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Analise de antihistaminicos
1. Maleic acid 2. (+/-)-chlorpheniramine 3. (+/-)-brompheniramine 4. Triprolidine

Ascentis C18

(+/-)-Chlorpheniramine
N

N Cl

6 Min

10

12

14

C18 Convencional

Fase movel: 75:25, 10 mM fosfofato potassico monobasico (pH 3.0 w com H3PO4): CH3CN Fluxo: 1 mL/min Temperature 35 C: Detector.: UV at 254 nm Injeccao: 10 L Amostra: 10 g/mLcada na mesma fase movel
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6 Min

10

12

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Uso de diferentes polaridades numa coluna: F5

Todas as moleculas de analito tem o mesmo acesso a moleculas ionizadas da superficie . +
F F F F F F F

F F F F F

F F

F F

+ +

+ +

+
F F

F F

+ +
O-

O-

O-

O-

O- O-

O-

O- O-

O- O-O-

O-

O- O-

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Picos numa coluna F5

+ Pico mais largo devido a uma cinetica mais longa Maior retencao de todas as moleculas do analitco devido as interaccoes de troca ionica com os silanois ionizados da superficie

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Tempo

Alcaloides da efedra
H3C NH OH H3C H3C H3C N OH H3C CH3 NH2 OH

ephedrine H3C NH OH H3C

methylephedrine

norephedrine

CH3 OH NH2 HO CH3 OH HN

pseudoephedrine

norpseudoephedrine

synephrine

D.S. Bell and A. D. Jones, J. Chromatogr. A., submetido

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Alcaloides da efedra
Condicoes Coluna: Discovery HS F5, 15 cm x 4.6 mm, 5m particles Cat. No.: 567416-U Fase movel: 4mM ammonium acetate in 90:10, CH3CN:water Fluxo: 1 mL/min Temperatura.:45C Detector.: UV at 215 nm Injeccao.: 10L Amostra: 10Pg/mL em 40:60, fase movel:CH3OH

Identificacao 1. norephedrine 2. synephrine 3. methylephedrine 4. ephedrine 5. pseudoephedrine

0 10 Time (min) 20

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Solucoes para minimizar o tailing dos picos

- Um pH mais baixo minimiza a populacao de silanois ionizados (pKa 46) Ha sempre silanois ionizados Os valores publicados de pKa sao medias O solvente do sistema tem sempre algum impacto no pKa dos silanois A maior proporcao de compostos organicos = maiores valores de pKa dos silanois Os fenomenos quimicos da fase estacionaria tambem afectam os valores de pKa do silanol - A solvatacao a superficie tambem e alterada - As vezes e melhor permitir as interaccoes de troca ionica em vez de tentar impedi-las - Algumas fases estacionarias, tais como as fases embebidas de amida polar, levam a melhoria da forma do pico porque mascaram os silanois ionizados da superficie

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Melhoria da forma do pico usando fases de amida

Coluna : Fase movel: Ascentis C18 or RP-Amide, 10 cm x 4.6 mm I.D., 3 m A-Agua 2 B- CH3CN, C- 0.1% TFA em agua Temperatura: 40 C Fluxo gradiente, 1.5 mL/min Deteccao : UV at254 nm 1 3 Volume de injeccao.: 10 L Amostra: :solucoes teste em acetonitrolo:agua Min %A %B %C 0 85 5 10 10 0 90 10 0 2 4 12 0 90 10 4 12.5 85 5 10
4

5 6

6 Time (min)

10

4 Time (min)

10

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II. Fase movel: o modificador organico e os 12 problemas

Resolucao - Retencao, eficiencia, selectividade Forma do pico - Actvidade do silanol Retencao de compostos polares - Disponibilidade das interaccoes polares Tempo para desenvolver o metodo - A ferramenta certa acelera o trabalho Separacao de pares criticos - Disponibilidade das interaccoes necessarias High throughput
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As polaridades da amostra sao muito amplas

- Correcto balanco de interaccoes Fiabilidade/robustez Estabilidade da coluna Compatibilidade com Espectrometria de massas - Consideracoes da fase movel Baixos limites de deteccao - Requirementos da fase movel - Eficiencia Scale-up to prep

II. Fase movel modificador organico

Modificador organico: Porque o acetonitrilo, por exemplo ???
E usado para controlar a retencao baseando-se nas interaccoes dispersivas - Pode afectar as interaccoes polares - Escolhas: acetonitrilo, metano, tetrahidrofurano - Porque estes solventes?
Baixa viscosidade elimina problemas de pressao Baixa absorvancia no UV problemas de deteccao Misciveis com agua

- Pode-se usar outros?

Claro que sim, mas com algumas penalidades
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Fase movel modificadores organicos

- Evitar baixo conteudo em compostos organicos com fases C18 normais (colapso da fase)
Se for necessario usar uma fase com muito baixo conteudo em organicos, e necessario usar uma fase que seja 100% estavel com fases organicas

- Evitar usar elevadas concentracoes de solventes organicos quando e necessario usar tampoes inorganicos (solubilidade) - Evitar concentracoes superiores a 20% THF com tubos PEEK
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100% Estaveis em agua

HO HO O O O O dehydroascorbic acid
1. Dehydroascorbic acid 2. Ascorbic acid

HO HO HO

O OH

1
ascorbic acid

1.0

2.0 Time (min)

3.0

4.0

5.0

Coluna: Fase movel: Fluxo: Temperatura: Detector. Injeccao:

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Ascentis RP-Amide, 15cm x 4.6mm, 5m 25mM fosfato potassico monobasico (pH 3.0 com H3PO4) 1mL/min 35C UV, 230nm 10L

III. Modificadores da fase movel: os tampoes e os 12 problemas

Resolucao
- Retencao, eficiencia e selectividade

As polaridades da amostra sao muito amplas

- Correcto balanco de interaccoes

Forma do pico
- Actividade dos silanois

Fiabilidade/robustez Compatibilidade com Espectrometria de Massas

- Requerimentos da fase movel

Retencao de compostos polares

- Disponibilidade das interaccoes polares

Tempo para desenvolver o metodo

- A ferramenta certa acelera o trabalho

Baixos limites de deteccao

- Requerimentos da fase movel - Eficiencia

Separacao de pares criticos

- Disponbilidade das interaccoes
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Scale-up to prep

High throughput

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Fase movel - o tampao

Tampoes
- Os analito ionizaveis fazem com que o controlo de pH seja um must - Os tampoes, por definicao, ajudam a controlar o pH, mas somente ao redor do seu pKa - Um problema comun e o uso de um tampao errado para um dado pH

Regra ajustar o pH +/- 1 unidade de pH ao redor do pKa do tampao

- Em algumas situacoes e necessario usar um tampao que nao seja o mais correcto
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Controlar a retencao em RP-HPLC: pH

Os acidos sao mais nao polares a um baixo pH, onde estao protonados. As bases sao mais nao polares a pH elevados, onde nao estao protonadas
Efeito do pH sobre a hidrofobicidade de uma acido (A) e uma base (B)
Retencao da fase reversa (hidrofobicidade )

AH

BH+
BH+ + OH- <--> B + H2O

AA- + H3O+ <--> AH + H2O

Fases moveis acidicas

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Fases moveis basicas pH

Sais e tampoes para HPLC

Tampao Acetato Amonio Borato 1 Borato 2 Borato 3 Citrato 1 Citrato 2 Citrato 3 Formato Oxalato 1 Oxalato 2 Fostato 1 Fosfato 2 Fosfato 3 Trietilamina Acido Trifluoroacetico TRIS* *Tris(hydroxymethyl)aminomethane pka 4.75 9.24 9.24 12.7 13.8 3.13 4.76 7.56 3.75 1.27 4.27 2.15 7.20 12.3 10.72 0.5 8.08

Qualidades Transparente ao UV Puro Livre de particulas Nao reactivo Miscivel com outros solventes e base Compativel com o LC/MS(volatil)

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IV. A temperatura e os 12 problemas

Resolucao
- Retencao, eficiencia e selectividade

As polaridades da amostras sao muita amplas

- Balanco correcto de interaccoes

Forma do pico
- Actividade dos silanois - Disponibilidade para as interaccoes polares

Fiabilidade/Robustez Compatibilidade com MS

- Ter a fase movel em consideracao

Retencao dos compostos polares Estabilidade da coluna

Tempo para desenvolver o metodo

- A ferramenta certa acelera o trabalho

Limites de deteccao baixos

- Consideracoes da fase movel - Eficiencia

Separacao dos pares criticos

- Disponibilidade das interaccoes necessarias
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Scale-up to prep

High throughput

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IV. Temperatura
Todas as separacoes devem ser feitas a uma temperatura controlada
- Especialmente quando as interaccoes ionicas sao prevelantes. - Especialmente quando se usam colunas de elevado conteudo em carbono

A falta de controlo de temperatura resulta em

- Baixa reproducibilidade - Dificuldades de resolucao mesmo em mudancas de selectividade

Geralmente escolhe-se 35C porque e geralmente superior ao temperatura ambiente e nao e alterado pelas mudancas de temperatura no laboratorio Fazer o ensaio dentro dos limites permitidos
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Fase movel (continuacao) Escolha do tampao

- Controlar a ionizacao do analito E a ionizacao dos silanois ter em conta ambos - Geralmente, 10mM e suficiente. Mas, se for maior, os picos serao melhores devido a uma melhor uso das interaccoes secundarias - Ter em conta a percentagem dos componentes organicos e a solubilidade do tampao - Uso de tampoes organicos volateis para espectrometria de massa (acetato ou formato de amonia) - Os contra-ioes sao tambem muito importante mediam as interaccoes de troca ionica
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- Ter em conta pH DEPOIS de misturar com os compostos organicos

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V. Volume de injeccao e composicao da amostra

Geralmente afecta a forma do pico e a robustez do metodo
- A separacao basea-se em estabelecer um equilibrio - Quando as amostras sao injectadas o equilibrio e perturbado - E necessario atingir um balanco entre o volume de injeccao e os limites de deteccao - Por regra, e preferivel uma maior concentracao e um pequeno volume sao preferiveis. - A maior parte dos injectores tem uma capacidade de 1 a 100PL
Trabalhar longe dos limites Usar volumes calibrados/qualificados
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V. Volume de injeccao e composicao da amostra

Recomenda-se usar para a amostra um solvente tao proximo quanto possivel do da fase movel. Problemas muito frequentes
- O solvente da amostra deve ser mais fraco do que o solvente de eluicao da fase movel - Solventes errados podem resultar em cancelas - O efeito pode ser limitado pelo uso de pequenos volumes

Amostras contaminadas!
- Usar colunas guarda ou filtros - Saber quando substituir
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Em conclusao..
Embora muitos dos problemas da HPLC estao relacionados com o instrumento (fugas, detectores avariados, volume morto da coluna), uma grande percentagem deles estao devidos a um desenvolvimento do metodo menos bom Compreender o porque dos componentes criticos e o conhecimento do leque de opcoes e critico para o troubleshooting

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Em conclusao....
Os problemas sao geralmente evitaveis com um desenvolvimento de metodos correcto e inteligente Uma coluna adequada em conjunto com a fase movel e os parametros externos (I.e. temperatura sao essenciais) E altamente recomendavel fazer um screening de colunas no justamente ao principio do desenvolvimento do metodo Usar o sistema mais simples Nao trabalhar nos limites
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Agradecimentos
Dave Bell Carmen Santasania Hillel Brandes Hugh Cramer Shawn Wyatt

Obrigado pela vossa atencao!

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