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CROMATOGRAFIA A LQUIDO DE ALTO DESEMPENHO (HPLC)

um tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sobre altas presses. Ela tem a capacidade de realizar separaes e anlises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade.

DESCRIO GERAL DE HPLC A amostra dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatogrfica preenchida com a fase estacionria (FE) Um solvente (FM) bombeado com vazo constante e desloca os componentes da mistura atravs da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades As substncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. J as substncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal eltrico o qual registrado, constituindo um cromatograma.

APARELHAGEM

O cromatgrafo tem os seguintes componentes principais: Reservatrio de eluente (FM) Bomba Injetor Pr-coluna Coluna de 250 4 mm (Merck, Lichrosphere RP-18) Detector de ultravioleta, = 225 nm Registador/integrador (Aquisio de dados).
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AMOSTRA A amostra colocada no loop da vlvula de injeo por meio de uma seringa (ver figura 2), quando esta est em posio de carga (posio: load). Rodando o manpulo da vlvula para a posio de injeo (posio: inject), d-se uma alterao no trajeto do eluente no interior desta e a amostra ento arrastada para a coluna. O eluente, que continuamente bombeado para a coluna, vai arrastar os componentes da amostra (designados vulgarmente por solutos) primeiro para o topo e depois ao longo da coluna.

Figura 2 - Representao esquemtica da vlvula de injeco e do processo de introduo de amostras na coluna de HPLC. (A) Introduo da amostra no loop da vlvula, (B) Introduo da amostra na coluna.

Se os solutos tiverem alguma afinidade pela fase estacionria da coluna, ao longo desta vo-se estabelecer sucessivos equilbrios de distribuio dos solutos entre a fase mvel (o eluente) e a estacionria. Se as constantes de distribuio
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para os diversos solutos forem suficientemente diferentes, estes iro deslocarse ao longo da coluna a velocidades diferentes, saindo da coluna separados uns dos outros. Em seguida os componentes da amostra passam a um detector, que neste trabalho consiste num espectrofotmetro de UV/Vis com uma clula de fluxo especialmente desenhada para permitir a medida da absorvncia da soluo que nela passa sem que se d alargamento significativo da zona de lquido onde est cada um dos solutos. Um registador, que est ligado ao detector, permite obter automaticamente o sinal enviado por este o qual, em primeira aproximao, proporcional concentrao do componente na soluo que passa nesse instante atravs da clula do detector. A representao grfica do sinal enviado pelo detector em funo do tempo que decorreu desde a injeo da amostra na coluna constitui o que se designa por cromatograma da mistura. Sendo conhecido o caudal de eluente, se necessrio pode transformar-se a escala de tempos em volumes de efluente.

FASES ESTACIONRIAS As FE so constitudas de material slido, granulado, finamente dividido e densamente empacotado dentro de um tubo feito de material inerte, normalmente ao. O material slido pode estar revestido ou ligado quimicamente a um lquido. TIPOS DE FASES ESTACIONRIA FE SLIDA FE POR EXCLUSO FE POR TROCA INICA FE POR BIOAFINIDADE FE QUIMICAMENTE LIGADA NORMAL REVERSA

FASE ESTACIONRIA QUIMICAMENTE LIGADA So as fases mais importantes da cromatografia lquida Obtidas pela reao dos grupos silanois da slica com compostos contendo grupos polares (Fase Normal) ou no polares (Fase Reversa). Na Fase Quimicamente Ligada, a slica gel, atravs dos grupamentos Si - OH, se liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade qumica. A Cromatografia de Fase Ligada subdividida em Fase Normal e Fase Reversa de acordo com a polaridade dos grupos funcionais ligados slica gel.
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As notveis propriedades deste tipo de material fazem da Cromatografia de Fase Ligada a mais utilizada em todo o mundo. Para a produo das Fases Quimicamente Ligadas, a slica gel submetida a um processo de hidrlise formando grupos silanis SiOH, grupo quimicamente ativo no qual se ligar o grupo funcional atravs de reaes de silanizao, utilizando organosilanos (ex: dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais, dependendo do nmero de grupos no silano que pode reagir. Obtm-se fase monomrica ou polimrica. Infelizmente, devido a efeitos estricos, muitos grupos SiOH reagempermanecendo ativos e provocando encaudamento dos picos. no

Ligao qumica tradicional usando silano monofuncional alcana um mximo de 50% ou uma densidade de ligante de ~4mol/m2. Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como Endcapping.

Endcapping Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais necessrio um passo secundrio de ligao para cobrir esses grupos ainda presentes na slica. O processo denominado endcapping efetua-se em geral com trimetilclorosilano(TMS). Ainda assim restam grupos silanol livres As slicas usuais s podem ser utilizadas na faixa de pH 2 8, pois os grupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a slica se dissolve em fase mvel contendo gua em pH maior que 8. Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos bsicos, limitao de pH, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizados atravs de desenvolvimentos mais recentes, tais como: slica de alta pureza, partculas hibridas, slica tipo C(slica hidreto) e novas qumicas ligantes.

FASE ESTACIONRIA NORMAL: Grupos Funcionais Polares so ligados matriz de slica. A tcnica, em geral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsoro. Grupos funcionais mais comuns: diol, ciano, amino. REVERSA: Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais ligados base de slica so apolares. Os analitos so atraidos para a superficie pelos seus grupos funcionais no polares. O analito mais polar elui primeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e fenila so os mais utilizados. O grupo octadecil responsvel pela maioria das separaes em fase reversa.

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FASE MVEL

O sucesso da separao cromatogrfica s possvel se for aplicada uma FM correta a uma FE conveniente. A escolha da composio da FM leva em conta vrios fatores, tais como: Propriedades fsico-qumicas que afetam a solubilidade, partio e adsoro e, portanto, a separao Propriedades fsicas que afetam a possibilidade de deteco dos componentes Propriedades fsicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores e coluna Propriedades que afetam a segurana (toxidez e inflamabilidade) Custo

Os seguintes parmetros devem ser considerados para uma escolha adequada da FM: Viscosidade Compressibilidade Presso de vapor Toxidez ndice de Refrao Corte de UV (cut off) espectro de absoro UV -VIS Miscibilidade de solventes e outras caractersticas importantes Fora dos Solventes

Cuidados especiais devem ser tomados na escolha dos solventes: Os componentes devem se dissolver na FM para que sejam transportados atravs da coluna Imiscibilidade com a FE Inrcia qumica com a FE e os componentes da amostra Pureza condizente com o detector utilizado. Mistura de solventes devem produzir solues homogneas fator importante nas anlises por gradiente (o mesmo cuidado deve ser tomado na troca de solventes; em caso de troca de dois solventes imiscveis, deve-se usar um solvente intermedirio solvel em ambos). Sistemas no miscveis prejudicam o desempenho da bomba, da coluna e induzem rudos no detector alm de alterar os tempos de reteno e prejudicar anlises quantitativas.

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Vantagens e limitaes da CLAE Vantagens Menor tempo de anlise Alta resoluo Resultados quantitativos Boa sensibilidade Versatilidade Automao Limitaes Alto custo da instrumentao Alto custo de operao Pouco usada para anlises qualitativas Falta de detector universal sensvel Necessidade de experincia no seu manuseio

BIBLIOGRAFIA
http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/546 http://www.cg.iqm.unicamp.br/material/qa582/hplc-Fracassi.pdf http://www.crq4.org.br/sms/files/file/conceitos_hplc_2010.pdf

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