1.

Campos de aplicação
2. Conceitos de Cromatografia
3. Tipos e modos de cromatografia
4. Classificação
5. Mecanismo de Separação
6. Componentes do Cromatográfo Líquido
7. Fase Móvel
8. Análise Qualitativa e Quantitativa
9. Paramêtros Cromatográficos
10. Atividade Prática
 Indústria Analito

Açúcares, ácidos, aminoácidos,

Alimentos parabenos, peptídeos,
proteínas, vitaminas

Aminoácidos, metabólitos,
Clínicas
peptídeos, proteínas

Farmacêutica Princípios ativos

Química Polímeros

Tintas Biocidas, resinas, tensoativos

 Método físico-químico de separação de misturas.
 Utilização de uma fase móvel e uma fase estacionária.

 A interação seletiva do analito com as fases permitem a

separação;
 O equilíbrio de distribuição determina a velocidade que
cada componente migra através do sistema.
 Pela diferença de velocidades se separam os
componentes presentes na amostra.
 O principal objetivo da cromatografia é separar
individualmente os diversos componentes de uma
mistura de substâncias, seja para identificação,
quantificação ou obtenção de uma substância pura
para os mais diversos fins.
 Tal separação acontece com a migração da amostra
através de uma fase estacionária (coluna) por
intermédio de um fluido (fase móvel).
 Após a introdução da amostra no sistema
cromatográfico, os componentes da amostra se
distribuem entre as duas fases e viajam mais
lentamente que a fase móvel devido ao efeito
retardante da fase estacionária.
 Cromatografia

Cromatografia Cromatografia
de Gás Líquida

Coluna "Fechada" Coluna "Aberta"

HPLC e GPC

Fase Normal Fase Reversa Troca Iônica Exclusão TLC = Papel

SEC Camada Delgada

GPC: Orgânica GFC: Aquosa

 Adsorção: afinidade a fase móvel;
 Partição: solubilidade a algumas das fases líquidas;
 Troca Iônica: atração e retenção pelas cargas;
 Exclusão: Tamanhos diferentes de moléculas
separados na fase estacionária;
 Bioafinidade: afinidade de compostos biológicos a
fase estacionária.
A migração através da coluna depende das
solubilidades dos solutos na fase móvel e
estacionária;
Mais solúvel na fase móvel, mais rápido migrará
pela coluna;
Mais solúvel na fase estacionária, mais
lentamente migrará pela coluna.
Pela diferença de velocidades se separam os
componentes.
Reservatório
Injetor Detector
Fase Móvel

Aquisição de
Bomba Coluna
Dados
 Reservatório de Fase Móvel (Frasco);
 Desgaseificador;
 Bomba;
 Injetor;
 Coluna Cromatográfica;
 Forno de Coluna;
 Detector;
 Registrador de dados (computador).
 Utilizar frascos ou recipientes de vidro
borossilicato ou material inerte;
 A cor do recipiente deve ser trabalhada para
evitar a degradação da fase móvel;
 Utilizar filtro para retenção de partículas (2 a
5 micras)
 Devem ser limpos periodicamentes para
evitar a formação de fungos, acúmulo de
sujeira e particulado.
 Retiram gases (ou bolhas) que estão diluídos
na fase móvel através de tubulações feitas a
partir de uma membrana permeável a gases
mas não a líquidos;

 Evita a formação de bolhas quando ocorre a

mistura de solventes (Gradiente);
 Bombas mecânicas recíprocas;
- Movimentação de pistão ou diafragma
 Vazão contínua sem pulsos;
 Inércia química aos solventes;
 Componentes extremamentes resistentes a
pressões, atritos e dissolução. Uso de safira e
rubi;
 Velocidade de fluxo variáveis de 0,1 a
10ml/minuto;
 Pressões de 0 – 6000psi.
 Isocrático: Mantém a composição de fase
móvel constante durante toda a análise;
indicado para amostras simples com
compostos de polaridades diferentes porém
próximos;

 Gradiente: A composição da fase móvel muda

durante a análise. Indicado para amostras
complexas com compostos de uma ampla
faixa de polaridade.
 Quanto a mistura de solventes:
 SIMPLES – Capacidade de bombeamento de
uma linha de solvente diferentes;
 BINÁRIA – Capacidade de bombeamento de
até duas linhas de solventes diferentes;
 TERNÁRIA - Capacidade de bombeamento de
até Três linhas de solventes diferentes (3
bombas simples);
 QUARTENÁRIA- Capacidade de bombeamento
de até quatro linhas de solventes diferentes;
 MANUAL- a amostra é injetada no loop do
equipamento pelo próprio analista (exige
experiência e o tempo é limitado a
permanência do analista no laboratório);

 AUTOMÁTICO – a amostra é acondicionada

em vials e o próprio aparelho coleta e injeta a
amostra
 menor erro analítico,
 ganho em tempo de trabalho (24 horas),
 Maior capacidade de injeção de amostras.
 As colunas cromatográficas são constituídas
de material sólido, granulado, finamente
dividido e densamente empacotado dentro de
um tubo feito de material inerte,
normalmente aço. O material sólido pode
estar revestido ou ligado quimicamente a um
líquido.
 Fase Normal;
 Fase Reversa;
 Troca Iônica;
 Partição;
 Analítica;
 Preparativa;
 Análise Quiral etc,

OBS: A coluna é selecionada durante o

desenvolvimento do método analítico.
 Grupos Funcionais Polares são ligados à
matriz de sílica.

 GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS:

* DIOL
* CIANO
* AMINO
 Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos
funcionais ligados à base de sílica são
apolares. Os analitos são atraidos para a
superficie pelos seus grupos funcionais não
polares. O analito mais polar elui primeiro,
seguidos pelos outros em ordem decrescente
de polaridade. Os grupos butil, octil,
octadecil e fenila são os mais utilizados. O
grupo octadecil é responsável pela maioria
das separações emfase reversa.
 Mantém constante a temperatura da coluna;

 Evita a alteração dos tempos de retenção

devido a modificação da temperatura
ambiente;

 Optimização dos parâmetros de separação

através da elevação da temperatura da
coluna.
 Absorção UV e Visível;
 Fotodiodos;
 Fluorescência;
 Índice de Refração;
 Eletroquímico;
 Espectrometria de massas;
 Ressonância Magnética Nuclear.
 Aproximadamente 50% de todos os
problemas de análise e com o equipamento
têm origem na fase móvel!
 Reagentes inadequados >> a coluna e o
equipamento são sempre culpados;
 Solventes devem ser grau de pureza HPLC ou
HPLC/UV.
 grau técnico, p/síntese, resíduos de
pesticidas, p/análise, ou UV não servem!
Preparo:

 Água deve ser grau HPLC (ultra-purificador)

◦ Usar água destilada / osmose reversa (RO) /
RO + eletro-deionização para alimentar o
ultra-purificador.
◦ Livre de bactérias (esterilizada por
membrana 0,22 mm).
◦ Resistividade >18 megohm. A leitura
somente indica o teor de ÍONS !
◦ Teor de orgânicos <20 ppb para análises
normais.
Preparo:

 A fase móvel deve ser preparada diariamente;

 Medir os componentes separadamente e
depois misturar, e só depois executar da
filtração.
- Adicionar componentes voláteis
(amônia,TFA, etc.) depois de filtrar com
vácuo.
 Nunca misturar um componente com outro,
avolumando para o volume final.
Preparo:
 Um erro de apenas 1% no teor de orgânico
pode ocasionar uma mudança de 5-15% no
tempo de retenção dos picos.
 Soluções tampões são utilizadas para manter
o pH, eliminar a atividade biológica ou
controlar as interações ácido-bases;
 Evitar o uso prolongado dessas soluções, pois
podem causar precipitações e entupimentos
 Controle de pH:
◦ Acertar o pH do tampão aquoso antes da
mistura com a parte orgânica
Filtração:
 Partículas em suspensão:
◦ Alto risco de riscar os selos e pistões da
bomba, danificar os selos do injetor, e
entupir os filtros da coluna e o leito de
recheio.
 A filtração é extremamente importante para
promover a retirada de material particulado e
e evitar o entupimento de filtros e tubulações
do sistema;
 Filtrar a fase móvel por membrana de 0,45
mm ou 0,22mm.
Degaseificação:

 Aumenta a reprodutibilidade da análise e a

estabilidade do detector;
 Este procedimento pode ser feito por três
maneiras:
1. Borbulhamento com hélio;
2. Banho de Ultra-som;
3. Por equipamentos degaseificadores;
4. Vácuo;
5. Agitação.
Degaseificação:

 O método mais eficiente de degaseificação é

aquele que utiliza simultaneamente:
Vácuo + Ultra-som + Agitação
 Degaseificação é indispensável para o bom
funcionamento do sistema;
 A fase móvel deve ser degaseificada a cada
12 horas;
 A utilização de equipamentos
degaseificadores não dispensa a
degaseificação da fase móvel.
Fase Normal
 A polaridade da fase móvel é menor que a da
fase estacionária;
 Utiliza-se normalmente uma mistura de
solventes não polares e um ou mais solventes
polares;
 Utilizar modo isocrático;
 Os reagentes utilizados são normalmente
compostos de hidrocarbonetos e álcool;

OBS: Quando for utilizar Fase normal purgar o

sistema com acetonitrila, depois com THF e então
com a fase móvel.
 Fase Normal
Fase móvel mais polar diminui k’

Injeção
100% Hexano

90 Hexano:10 Diclorometano

70 Hexano: 30 Diclorometano
Fase Reversa

 A polaridade da fase móvel é maior que a

da fase estacionária;
 A água é o solvente mais usado;
 Utilizar modo isocrático ou gradiente;
 Para mudar a retenção do analito utiliza-se
compostos orgânicos (metanol, acetonitrila,
tetrahidrofurano)
 Uso de soluções tampões para ajuste de pH.
Fase Reversa:
Fase mais apolar diminui k’

75 Metanol : 25 Água

60 Metanol : 40 Água

50 Metanol : 50 Água
 Índice Grupo Limite Índice Ponto Viscosid. Densidade
Estrutura / Peso
Solvente polar. Químico UV nm refrac. de em CP a g/mL
Fórmula mol. (k’) (a) 25ºC ebul. ºC 25ºC 25ºC

Ciclohexano 84,16 0,04 0 200 1,427 81 0,90 0,745

n-Hexano CH3(CH2)4CH3 86,18 0,06 0 195 1,375 69 0,30 0,659

Iso-Octano (CH3)3CHCH2CH(CH3)2 114,23 0,1 0 215 1,389 99 0,47 0,692

n-Heptano CH3(CH2)5CH3 100,21 0,2 0 200 1,388 98 0,40 0,684

101,19 1,8 1 235 1,400 89 0,38 0,726

Trietilamina (C2H5)3N
(1%)

Tolueno CH3 92,14 2,4 7 285 1,496 111 0,55 0,867

Éter Etílico C2H5-O-C2H5 74,12 2,9 1 215 1,353 35 0,24 0,706

Benzeno 78,11 3,0 7 278 1,501 80 0,60 0,874

Metil t-butil éter (CH3)3C-O-CH3 88,14 3,0 1 210 1,368 55 0,28 0,740

Diclorometano CH2Cl2 84,93 3,4 5 233 1,421 40 0,41 1,325

n-Butanol CH3-(CH2)2-CH2OH 74,12 3,9 2 215 1,399 118 2,98 0,810

Tetrahidrofurano 72,11 4,2 3 215 1,407 66 0,40 0,880

Acetato de Etila CH3-COO-C2H5 88,11 4,3 6 255 1,370 77 0,43 0,902

iso-Propanol CH3-CHOH-CH3 60,10 4,3 2 205 1,377 86 1,9 0,785

 Índice Grupo Limite Índice Ponto Viscosid. Densidade
Estrutura / Peso
Solvente polar. Químico UV nm refrac. de em CP a g/mL
Fórmula mol.
(k’) (a) 25ºC ebul. ºC 25ºC 25ºC

Clorfórmio CHCl3 119,38 4,3 8 245 1,443 61 0,51 1,489

Metil etil cetona CH3-CO-C2H5 72,11 4,5 6 330 1,376 80 0,38 0,805

1,4-Dioxana 88,11 4,8 6 215 1,422 101 1,54 1,034

Etanol CH3-CH2OH 46,07 5,2 2 205 1,361 78 1,20 0,785

Acetona CH3-CO-CH3 58,08 5,4 6 330 1,359 56 0,30 0,791

Metoxietanol CH3-O-(CH2)2-OH 76,10 5,7 4 210 1,401 125 1,72 0,965

Acetonitrila CH3-CN 41,05 6,2 6 190 1,344 82 0,34 0,786
N,N CH3CO-N(CH3)2 87,12 6,3 3 268 1,436 165 0,83 0,937
Dimetilacetamida
N,N HCO-N(CH2)2 73,10 6,4 3 268 1,428 153 0,90 0,944
Dimetilformamida
Dimetilsulfóxido CH3-SO-CH3 78,13 6,5 6 270 1,478 189 2,24 1,101
Metanol CH3-OH 32,04 6,6 2 205 1,326 65 0,54 0,791
Água H2 O 18,02 9,0 9 180 1,330 100 1,00 0,997
Ácido Acético CH3-COOH 60,05 - - 1%= 1,370 118 1,10 1,049
235

(TFA) Ácido F3C-COOH 114,02 - - 0,1%= - 72 0,926 1,489

210
trifluoroacético
 Utilizando uma solução padrão de composto
conhecido é possível identificar a presença de
composto em determinadas amostras através
do tempo de retenção e do espectro de
pureza do pico.
 Determina a quantidade de um analito
presente numa amostra;
 Padronização Externa
- Injeta-se volumes iguais de amostras
contendo massas diferentes do analito
construindo uma curva de calibração.
 Padronização Interna
- Adiciona-se aos padrões e as amostras uma
quantidade conhecida e constante de um
composto não contido na matriz com
características semelhantes ao analito.
 V0 = volume de eluição de um pico não retido
pela coluna. É o volume mínimo que a bomba
precisa bombear para qualquer amostra
chegar até o detector.
 O Volume de Coluna (V0) é o volume de fase
móvel contido no sistema entre o injetor e o
detector, inclusive dentro dos poros da
coluna.
 A coluna é responsável por 90-95% deste
volume.
 Pode ser calculado pela fórmula:

V0 (mL) = (p x r2 x C)/2

Onde:
r=raio interno em mm
C = comprimento em mm.
 Exemplo de cálculo de V0:

Coluna de 4,6 x 250 mm

◦ r = 2,3 mm C = 250 mm p = 3,14

◦ V0 = (3,14 x (2,3)2 x 250)/2
◦ V0 =2076 mm3 @ 2076 mL @ 2,08 mL
 Tempo necessário para que uma substância
atravesse a coluna sem sofrer interação com a
fase estacionária.
 Pode ser calculado pela fórmula:

T0=V0/Fluxo

Coluna de 4,6 x 250 mm

◦ r = 2,3 mm C = 250 mm p = 3,14

◦ V0 = (3,14 x (2,3)2 x 250)/2
◦ V0 =2076 mm3 @ 2076 mL @ 2,08 mL

◦ Tempo do V0 @ 2,08 mL / fluxo

 É o tempo compreendido entre o momento
da injeção e o ápice máximo do pico de
interesse.
 Tempos de retenções constantes
demonstram a estabilidade do sistema
cromatográfico;
 Vazamentos e sujeira no sistema podem
causar variações de pressão e
consquentemente variação do tempo de
retenção.
 É o termo usado para expressar o grau de
interação do analito pela fase estacionária;
 Também definido como um fator que mede a
força da fase móvel;
 Calculado pela fórmula:

k’= ( Vp – V0)/V0
Onde Vp= Volume de eluição
do pico de interesse.
 Mede a eficiência de uma coluna na eluição
de um determinado componente. É uma
relação entre o alargamento do pico e o
tempo de retenção;

 É uma medida de quanto o sistema (injetor,

tubulação, conexões, coluna, fase móvel,
detector) está diluindo a banda (= alargando
o pico) do componente durante a corrida
cromatográfica.
 É uma medida da qualidade do
empacotamento da coluna e serve para
detectar defeitos no leito de recheio e
degradação ou desgaste do mesmo.

 Não existe um valor máximo ou mínimo; o

interessante é que a coluna utilizada tenha
uma eficiência suficiente para separar os
analitos de interesse.
 A eficiência é afetada / controlada por
fatores físicos como:

- Forma e tamanho da partícula de recheio

- Comprimento da coluna
- Fluxo
- Volume e massa de amostra injetada
- Temperatura
  Fórmulas p/ cálculo do número de pratos
teóricos:

N = f  (Ve /L) 2

Método Fator (f) Largura medida

Ve = volume (mL), em (L)
tempo (min), distância ½ altura 5,54 50% da altura
(mm) de eluição do pico (50%) = EP
Tangente = 16 Onde tangentes
USP cruzam linha de base

5s 25 4,4% da altura
 N = 16(Tr /Wb ) 2

N = 5.54(Tr /Wb ) 2
 Avalia a separação entre dois picos;
 Valores ideais: > 2,0
 Resolução mínima: 1,5
 V= Volume de eluição = Volume de fase móvel bombeado
através do sistema desde o ponto de injeção até a saída do
ápice do pico.
 Medidas em cm, minutos ou mL.
 R= Resolução A = Comparação de áreas
 Assimetria avalia o quanto o formato de um
pico desvia-se do formato gaussiano. (Duas
metades exatamente iguais ou simétricas);
 Determinação da assimetria de picos
cromatográficos com base em razões A/B.
 Se o pico for uma curva de Gauss, A = B e
A/B = 1
 Fator de assimetria: calculado a 10% da
altura do pico
 V1

V2

V0
1 2

V0

k’= ( Vp – V0)/V0 Valores ideais: 2,0 a 3,0

Faixa máxima: 1,0 a 20,0
a = a capacidade do sistema químico (coluna e fase
móvel) de diferenciar entre os componentes de
interesse.
a = k’2 / k’1 = (V2-V0) / (V1-V0)
V1

V2

1 2

V0