Cromatografia Geral - Aula 1

Técnicas Laboratoriais de Química e Bioquímica
Cromatografia
Docente: Joana Patrícia Araújo Ferreira
Contato: jpferreira@isa.ulisboa.pt
2023/2024
Programa 2
1. Introdução à cromatografia: tipos de cromatografia;

mecanismos de separação cromatográfica;
2. Cromatografia em fase líquida: cromatografia em papel,

cromatografia em camada fina, cromatografia líquida em
coluna.
3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).
4. Cromatografia em fase gasosa.

Cromatografia
Significado
Cromatografia
kroma (cor) + graph (escrever) … grego
TSWEET – 1903 – Separação de misturas de

pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos (carbonato de cálcio) e
solventes variados
Significado
CROMA TOGRAFIA
Cor Escrever
Para que serve?
É um método físico-químico de separação de elementos amplamente utilizado para identificar
substâncias, purificação e /ou separação de compostos.
● Monitorizar a qualidade do ar
● Testar a qualidade da água potável em estações de tratamento de águas residuais
● Testar a qualidade da água proveniente de agro-indústrias, pecuárias
● Deteção de drogas e/ou fármacos na urina, controlo anti-dopping
● Perfis nutricionais de alimentos
● Etc…
Princípio básico
Como acontece a separação?
Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma
FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás) – eluem a
diferentes velocidades.
8
Princípio básico
A separação depende:
- da interacçao dos componentes da mistura com a fase móvel e a fase

estacionaria;
- das diferentes forças intermoleculares (iónica, dipolar, apolar)
Eficiência 9
A eficiência de uma separação (medida do alargamento

da banda de um pico) pode ser medida
quantitativamente através de:
N, número de pratos teóricos
N mede a relação entre o tempo de retenção

de um pico e a sua variância (σ)
Eficiência 10
Cada estágio de equilíbrio é

designado PRATO TEÓRICO
O Nº DE PRATOS TEÓRICOS numa

coluna é calculado por:
𝑡𝑅 3
𝑁=
𝑊𝑏
> N, coluna mais eficiente

Migração 11
Quanto menos um componente da

mistura interage com a fase estacionária
maior a migração;
Quanto mais um componente da mistura

interage com a fase estacionária menor a
migração
Quando um componentes da mistura atinge o equilíbrio entre a fase

estacionária e a fase móvel, a sua migração termina.
Posto de outra forma….

Coeficiente de distribuição 12
É o equilíbrio de distribuição: Km = [X]s

[X]m
Com,
[X]s: a concentração do componente da mistura na fase

estacionária;
[X]m: a concentração do componente da mistura na fase móvel
Assim sendo…
Cada componente da mistura terá um valor de Km diferente;
Componentes com Km baixo ficam menos retidos na fase

estacionária e mais na fase móvel – valor do denominador mais
elevado;
Km = [X]s
[X]m
Estes componentes eluem mais.
Cada componente da mistura terá um valor de Km diferente;
Componentes com Km elevado ficam mais retidos na fase

estacionária e menos na fase móvel – valor do numerador mais
elevado;
Km = [X]s
[X]m
Estes componentes eluem menos.
15
Tipos de Cromatografia
Classificação quanto à natureza: da fase móvel, da fase
16
estacionária, do equipamento utilizado e do equilíbrio químico
Cromatografia
Fase Modo de
Forma física Fase móvel
estacionária separação
Planar Coluna Sólida Adsorção

Gasosa
Líquida Líquida Partição
Supercrítica Quimicamente
Troca iónica
ligada
Exclusão
molecular
17
Natureza da fase estacionária

Natureza da fase estacionária (FE) 18
• Sólida
• Líquida
• Quimicamente ligadas
Fase Estacionária 19
Os principais fatores numa fase estacionária que determinam a

separação cromatográfica de uma mistura são:
• Interações entre dipolos,

• polaridade
• pontes de hidrogénio.
Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre Fase

Estacionária (FE), diglicerol e etanol
Fatores a considerar na fase estacionária:
• Ponto de ebulição elevado

• Inércia química e catalítica
Fases não polares – fases reversas
• Grupos alquilo
• Grupos fenilo
Fases polares – fases normais
• Grupos ciano
• Grupos sulfonilo, carboxilo, azotados…
Adsorventes usados como fases estacionárias
Também conhecidos como fases estacionárias, interagem com a amostra

por diferentes mecanismos, ocorrendo assim a separação das substâncias.
• Silica SiO4 Separaçao de aldeídos, cetonas, fenois, acidos gordos, aa,

terpenoides, esteroides
• Celulose
• Gel de dextrana
• Silica modificada A grande vantagem em se utilizar sílica modificada com grupos
alquilo é que tais modificações alteram completamente a
seletividade da separação.
• Quirais
Suporte
• Terras diatomáceas
24
Natureza da fase móvel e equipamento

Natureza da fase móvel (FM) e equipamento 25
Cromatografia
Planar Coluna
FM líquida FM FM FM fluído
líquida gasosa supercrítico
Coluna Gasosa Fluído

clássica supercrítico
Camada Papel
delgada Líquida alta
eficiência
Cromatografia planar 26
em papel
Amostra
Fase móvel: líquida - eluente Fase estacionária: sólida - papel

Cromatografia planar (ou em leito aberto) 27
em papel
28
Aplicações
 Controlo da pureza de produtos farmacêuticos;
 Deteção de adulterantes em diversos produtos;
 Deteção de contaminantes em alimentos e bebidas;
 Estudos de fermentação em bebidas alcoólicas
 Deteção de drogas e dopping em animais e humanos;
 Análise de cosméticos;
 Análise de misturas de reação em laboratórios
29
Processo
A amostra (contendo uma mistura de componentes) é aplicada em
papel (fase estacionária);
Uma das extremidades do papel é imersa num solvente;
O solvente (fase móvel) move-se através do papel, subindo por

capilaridade.
Capilaridade 30
A capilaridade é uma propriedade física

manifestada pela tendência que algumas
substâncias apresentam para subirem ou
descerem por paredes de tubos finos (tubos
capilares) ou de se deslocar por curtos
espaços existentes em materiais porosos,
como tecidos de algodão, esponjas ou fibras
de celulose do papel.
Esse mecanismo permite que os fluidos se

A água sobe pelo guardanapo de papel devido à
desloquem contra a força gravitacional. forte atração das moléculas de água pelo grupos –
OH das fibras de celulose do papel e da atração das
moléculas de água entre si.
A fase móvel (solvente) move-se

pela fase estacionária (papel)
por capilaridade
Mecanismo de separação dos componentes da 31
amostra
Cada componente da mistura é transportados pelo solvente ao longo do
papel por uma distância específica, que depende da tendência do
componente para:
- Ser adsorvido no papel, composto por celulose, à qual moléculas polares

adsorvem;
- Ser transportado pelo solvente, menos polar e geralmente constituído por
uma mistura de água com um composto líquido orgânico.
Na cromatografia em papel a fase estacionária celulósica

é mais polar que a fase móvel orgânica.
Fase estacionária - papel 32
O papel de cromatografia é geralmente

constituído por celulose altamente
purificada com centenas de unidades de
anidro-glucose ligadas entre si por átomos
de oxigénio;
Tem troca iónica e adsorvência fracas.
Composition: a-cellulose (98

to 99%), b-cellulose (0.3 to
Atualmente há formas modificadas de 1%), Pentosans (0.4 to 0.8%),
Ash (0.07 to 0.1%) & ether
papel de cromatografia, nomeadamente soluble matter (0.015 to
com integração de alumina, sílica, resinas 0.1%).
de troca iónica.
Fase móvel – critérios de escolha do sistema 33
de solventes
Solubilidade da amostra:
- Se for excessiva o componente move-se com o solvente para a frente do
solvente;
- Se for demasiado baixa pouco se distanciará do ponto de aplicação.
Polaridade da amostra:
- Os componentes da amostra têm polaridades diferentes entre si e pode
Bhanot, 2018
ser modificada alterando as proporções dos solventes;
- O aumento da polaridade do sistema de solventes aumenta o

movimento dos componentes da amostra ao longo do papel de
cromatografia.
Mecanismo de separação dos componentes da 34
amostra
Tipos de cromatografia em papel 35
A mais utilizada Conveniente para separar

compostos com valores de Rf
semelhantes
Tipos de cromatografia em papel 36
Cromatografia planar (ou em leito aberto) 37
em papel VANTAGENS
• Rapidez
• Facil execução DESVANTAGENS
• Baixo custo
• versatilidade • Dificil reprodutibilidade
• Dificil determinaçao de Rf
em camada fina
thin layer chromatography (TLC)
Amostra
Fase estacionária:
sólida – cobertura
da placa (ex.
sílica)
Fase móvel: líquida - eluente
https://www.youtube.com/watch?v=rMGQavOMAmc
em camada fina
Separação e identificação:
Cada componente da mistura
migrará de forma diferente,
sendo assim separados;
Por comparação com a

migração de padrões, é possível
identificar cada componente.
1.2.2.2. Cromatografia planar 40
em camada fina
Termos e parâmetros técnicos

Princípio 41
Envolve um adsorvente (fase estacionária), um

solvente ou uma mistura de solventes (fase
móvel) e os componentes da amostra.
Os componentes da mistura são adsorvidos

por eluição do solvente através da superfície
adsorvente.
Fase estacionária - sílica 42
As placas revestidas com sílica são as mais usadas, mas também se

utilizam outras como óxido de alumínio, celulose ou poliamida.
Nas placas de sílica standard as partículas

de sílica têm 5 a 17 μm e diâmetro dos
poros de 60 Å, sendo a espessura da
camada de 0,25 mm;
Estas dimensões resultam numa superfície

de adsorção de aproximadamente 500
m2/g.
Em cromatografia em camada fina de alta performance (HPTLC) as

partículas de sílica têm 2 – 10 μm e a espessura da camada é de 0,2 mm.
Fase estacionária 43
– óxido de alumínio
Fase estacionária - 44
celulose, poliamida
A celulose usa-se principalmente para cromatografia de partição de
substancias polares, como aminoácidos ou carboidratos;
Quando comparada com a cromatografia em papel, a cromatografia em

camada fina em celulose permite tempos de migração menores e
manchas mais concentradas.
A poliamida é apropriada para separação de fenóis e compostos

fenólicos.
Suportes da fase estacionária 45
O suporte mais utilizado é o vidro, no entanto dada a sua

fragilidade e peso, o alumínio poliéster tem vindo a ser usado
como alternativa.
Fase móvel 46
A seleção do solvente envolve algum grau de tentativa e erro.
Um sistema de solventes de partida é o sistema hexano: acetato de

etilo (1: 1) e a variação das proporções pode ter um efeito
pronunciado nos Rf.
Compostos fortemente polares, ácidos e bases: a adição de ácido

acético ou fórmico pode melhorar os resultados;
Compostos polares: a adição de metanol pode melhorar os

resultados.
Fase móvel 47
OUTRAS MISTURAS DE SOLVENTES
•Compostos fortemente polares: acetato de etilo:butanol :

ácido acético : água (80:10:5:5);
•Compostos polares: <10% de metanol em diclorometano
•Compostos fortemente básicos: 10% NH4OH em metanol na
proporção 1 a 10% em diclorometano.
Fase móvel 48
Especificidades da técnica 49
Atmosfera da câmara de
desenvolvimento: tem que estar
saturada, pelo que o sistema de
eluentes deve ser adicionado com
antecedência.
Antes de a placa ser introduzida na

câmara, o solvente no qual as
amostras estão diluídas tem que ter
sido totalmente evaporado (o uso de
secador facilita o processo).
50
Métodos de visualização e identificação

Visualização dos compostos 51
Na maioria dos casos os componentes

da amostra não são corados, pois não
contêm cromóforos.
Uma vez que a maioria das substancias

absorve radiação UV, o uso de placas
com indicador de fluorescência (silicato
de zinco) incorporado permite a
visualização sob lâmpada de UV a 254
nm.
Visualização 52
Outras reações menos
específicas incluem
reações com compostos Vanilina -
de iodo. para muitos
aldeídos,
cetonas e
Iodo - para
Noutras situações existem compostos
álcoois
compostos em spray aromáticos
específicos. Após
aplicação na placa as
bandas são reveladas por
ação de calor (ex. estufa)
Verde de
Diversas composições de bromocresol -
para
agentes de revelação compostos
Cloreto de
ferro - para
existem também para acídicos fenóis
substancias específicas.
Cromatograma 53
Por forma a determinar a extensão do movimento de cada

componente no papel de cromatografia, calcula-se o valor resolution
front (Rf) após a sua separação;
O valor de Rf é dado pela distância percorrida pelo componente a

partir do seu ponto de aplicação.
Cromatograma – cálculo de Rf 54
Rf = Distância percorrida pelo composto desde o ponto de aplicação

Distância percorrida pelo solvente desde o ponto de
aplicação
Exemplos:
Rf = 8 cm =
0,8
10 cm
Rf = 2 cm =
0,2
10 cm
Identificação dos compostos 55
Para as mesmas condições cromatográficas o valor de Rf de um

composto é constante;
Com recurso a padrões,

é possível identificar
compostos presentes na
amostra.
56
Cromatografia em coluna clássica

Princípio 57
É o método mais usado para separar

componentes de uma mistura.
A fase móvel é líquida e a fase estacionária

pode ser sólida ou um líquido suportado por
um sólido inerte (resina, gel ou material de
enchimento);
Ismail, 2010
Caraterísticas da coluna 58
O fracionamento ocorre através da

migração diferencial das componentes
ao longo de um tubo fechado,
geralmente de vidro;
O comprimento e diâmetro do tubo é
selecionado de acordo a quantidade
de amostra, o modo de separação e o
grau de resolução requerido
Quanto mais compridas e estreitas

forem as colunas, maior a separação.
Clark, 2016; Ismail, 2010
Fase estacionária 59
A fase estacionária tem que ser preparada previamente de acordo

com as instruções do fabricante:
Frequentemente é necessário hidratá-la ou insufla-la com fase móvel e só

então é introduzida na coluna;
As colunas de adsorção podem ser ter enchimento seco ou húmido;

nestas ultimas frequentemente é necessário fazer uma pasta constituída
pelo adsorvente com o solvente e derramá-la na coluna. Consoante ela
vai estabilizando, o excesso de solvente vai sendo retirado e vai-se
adicionando mais pasta. O processo é repetido até se atingir a altura de
enchimento da coluna desejado.
Quando o solvente da pasta é diferente do solvente utilizado na eluição,

há que lavar (equilibrar) a coluna com a fase móvel. Ismail, 2010
60
Mecanismo
A cromatografia clássica (baixa pressão)
utiliza a apenas a gravidade ou uma bomba
peristáltica para manter o fluxo de fase
Chakravarti et al, 2016 Ismail, 2010

estacionária através da coluna;
Sistema por gravidade: o eluente é

simplesmente sifonado de um reservatório
para a coluna , sendo o taxa de fluxo
determinada pela distancia entre o nível de
liquida no reservatório e a altura da coluna;
Sistema por bomba peristáltica: a taxa de

fluxo é determinada pela velocidade da
bomba.
Tipos de eluição 61
Eluição: é processo de passagem da fase móvel através da coluna;
Eluente: é a fase móvel;
Eluato: é a porção que emerge do final da coluna.
A eluição pode ser:
Isocrática: a composição da fase móvel é a mesma ao longo de toda a

eluição
Ismail, 2010
Por gradiente: a fase móvel muda durante a eluição (ex. Aumento da
força do solvente ou do pH), por forma a aumentar a resolução e/ou
diminuir o tempo despendido na análise.
Recolha das frações 62
Ismail 2010; Lambda, Laboratory Instruments, 2017

O eluato pode ser recolhido para um
coletor que pode ser ajustado para
recolher a intervalos de tempo
específicos.
Quando os componentes não têm

cromóforos, há que saber
previamente os tempos de retenção
de cada.
Exemplo de análises posteriores.

63
Parâmetros de cromatografia
Mateus, 2008
Tempo de retenção 64
O cromatograma é a representação gráfica da cromatografia, refletindo

o sinal dado pelo detetor. t’R
tM (tempo morto): tempo

necessário para que um
composto que não interaja
com o sistema cromatográfico
elua da coluna; tempo desde
a injeção (t0) até à chegada
ao detetor.
t0
tR (tempo de retenção): tempo decorrido entre a injeção e o pico
cromatográfico de um composto.
t’R (tempo de retenção corrigido) = tR - tM

Volume de retenção (vR) 65
vR = tR. u
Com:
U – débito da fase móvel (volume por unidade de tempo)

Fator de capacidade (k’) 66
É a razão entre o tempo do soluto (no qual a

K’ = tR - tM amostra está dissolvida) na fase estacionária e o
tM tempo do soluto na fase móvel
Quanto mais alto é o K´, mais tempo o composto é retido na coluna

levando mais tempo a eluir
Coeficiente de partição (k) 67
É a razão entre concentração de uma

K = CE substância na fase estacionária (CE) e a
CM concentração dessa substância na fase móvel
(CM).
O fator de capacidade e o coeficiente de partição indicam se uma

substância é mais ou menos retida na coluna e se estamos a trabalhar em
boas condições.
68
Parâmetros de separação dos componentes da

amostra
Diferença de tempos de retenção (retenção 69
relativa)
Para os compostos 2 e 1, componentes da mistura a separar:
α = t R2 ou α = k’2 ou α = k2
t R1 k’1 k1
Permite perceber se os componentes da mistura estão a ser bem ou mal

separados
Quanto mais alto for o valor de α, melhor estão os componentes a ser

separados
Resolução cromatográfica (r ) S 70
Dá a resolução entre dois picos num cromatograma, permitindo
compreender se está a haver uma boa separação dos componentes da
amostra:
Com:
(B)
Δz - separação entre os
R (A)
picos correspondentes
ΔZ aos compostos A e B;
W – largura da base do
pico.
WA WB
Rs = 2 Δz__ ou Rs = [2 tR(B) – tR(A)]

WA+WB WA+WB
Eficiência de uma separação cromatográfica 71
A separação cromatográfica de dois componentes de uma

amostra é tanto maior quanto:
- Maior a diferença dos tempos de eluição de dois picos
diferentes;
- Menor a largura de cada um dos picos.
Em análise quantitativa é desejável que a resolução seja > 1,5;
Com alterações em condições cromatográficas as fases,

temperatura e velocidade, é possível melhorar a resolução.
Forma do pico cromatográfico 72
Deverá ter um aspeto semelhante a uma curva de

Gauss:
Maus picos:
73
Parâmetros de uma coluna cromatográfica

Eficiência da coluna 74
E eficiência de uma coluna cromatográfica pode ser expressa em termos

de nº de pratos teóricos;
Na prática o estabelecimento de um equilíbrio entre as duas fases numa

coluna é impossível.
Prato teórico: é uma camada imaginária da coluna com tal espessura que
a solução provindo dela tem a mesma composição que seria obtida se
efetivamente existisse equilíbrio.
Pratos teóricos (N) 75
Quanto mais comprida for a coluna (L),

maior o nº de pratos teóricos;
Quanto menores forem as partículas da

coluna (dp) maior o nº de pratos
teóricos.
Quanto maior o nº de pratos teóricos mais estreitos os picos, o que

implica uma melhor separação e eficiência.
Qualidade da coluna 76
A qualidade de uma coluna é dada pela Altura Equivalente de um

Prato Teórico (AEPT):
Com:
AEPT = L/N L – comprimento da coluna;

N – nº de pratos teóricos
Cromatografia em coluna 77
Clássica
Fase móvel: líquida -
eluente
Fase estacionária:
sólida –
Amostra enchimento da
coluna
(ex. alumina, sílica, carbonato
de cálcio)
Cromatografia em coluna
Clássica
purificação de substâncias orgânicas
isolamento de compostos
A mistura passa por um tubo de vidro vertical preenchido com a fase estacionária
(sílica ou alumina), o eluente (solvente ou mistura de solventes) paassa pela coluna
e arrasta os compostos, separando-os pelas suas características de solubilidade e
adsorção.
Clássica • escoar o solvente até que uma pequena

quantidade de solvente em torno de 1,0 cm fique
na superfície
• Introduzir, na sequência, o material que se deseja

separar, com a ajuda de uma pipeta de Pasteur
• A coluna é, então, preenchida com o solvente, e

iniciada a eluição
https://www.youtube.com/watch?v=2R2iq_XR1IY
Líquida de Alta Eficiência

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Fase móvel: líquida – eluentes
Amostra
Fase estacionária:
líquida – revestimento
interno da coluna
amostra e solventes no estado líquido
ex: cromatografia em coluna
 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

 Um dos métodos mais complexos e atual, utiliza colunas metálicas e pressão
de fase móvel elevada, obtidas com o auxílio de uma bomba de alta pressão.
Neste caso, é possível separar substâncias termicamente instáveis.

• tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas em poucos minutos, com alta
resolução, eficiência e sensibilidade.
• A versatilidade reside no grande número de fases estacionárias existentes

Reservatório de Fase Móvel
Sistema de desgaseificação
Bomba
Válvula de injeção
Coluna
Detetor
Sistema de aquisição de dados

Líquida de alta eficiência

Separação e identificação:
Concentração
Recorrendo a padrões:
Tempo
O tempo de retenção, permite identificar os componentes da mistura (ex. se dede
um padrão retenção
cafeína eluir da coluna
aos 0,5 min então, um componente da amostra que também elua aos 0,5 min (nas mesmas condições
cromatográficas) será identificado como sendo cafeína.
Líquida de alta eficiência

Quantificação:
Concentração
Recorrendo a padrões: Tempo de retenção
As injeções de um mesmo padrão a diferentes concentrações conhecidas permite obter uma curva de calibração
área do pico vs. concentração (ex. um pico observado no tempo de retenção da cafeína com uma área de
15000000, corresponderá a uma concentração de 694 µg/mL de cafeina.
Tipos de cromatografia
Cromatografia Gasosa
ex: separação de misturas de

substâncias voláteis
A amostra é vaporizada e
introduzida em um fluxo de um
gás adequado denominado de
fase móvel ou gás de arraste.
Amostra
Gasosa
Gas chromatography (GC)
Fase estacionária: líquida(1) ou
sólida (2) – revestimento interno
da coluna
(1) cromatografia gás liquido Fase móvel: gasosa – gases de arraste,

(2) Cromatografia gás sólido que circulam no interior da coluna
88
Gasosa
Gas chromatography (GC) Cromatograma
Identificação e Quantificação:
Concentração
Padrões Tempo de retenção

Em fluído supercrítico
Supercritical fluid chromatography (SFC)
A fase móvel é um fluido com características

intermédias entre o gás e o líquido, obtido
através de condições específicas de
temperatura e pressão.
Em fluído supercrítico
Supercritical fluid chromatography (SFC)
Nos fluidos supercríticos características relacionadas com a capacidade

de:
- Solubilização, como a densidade, são mais semelhantes à dos líquidos;

sendo que os líquidos solubilizam melhor que os gases;
- Transporte, como a difusão elevada e a baixa viscosidade, são mais
semelhantes à dos gases; sendo que os gases transportam melhor que
os líquidos.
Cromatografia centrífuga 92
Chromatotron®
Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada em
centrífuga
- Não há necessidade de aplicação

- As separações são rápidas
- Observação direta
- Pouco solvente
- Prevenção da oxidação
- Económica
93
Modo de separação
Natureza do processo cromatográfico
(interações entre soluto, fases móvel e
estacionária)
Modo de separação 94
• Adsorção
• Partição
• Troca iónica
• Afinidade
• Exclusão
Cromatografia de adsorção 95
Adsorção:
É a adesão de moléculas de um fluido (o

adsorvido) a uma superfície sólida (o adsorvente);
O grau de adsorção depende da temperatura, da

pressão e da área da superfície;
Sólidos porosos como o carvão ativado são ótimos

adsorventes;
As forças que atraem o adsorvido podem ser

químicas ou físicas.
FASE MÓVEL: LIQUIDO OU GÁS FASE ESTACIONÁRIA: SÓLIDO

A cromatografia de adsorção baseia-se na interação ente

as moléculas da amostra e a fase estacionária (sólida). A
fase móvel é um líquido ou um gás;
O grau de interação depende da polaridade do soluto no

qual a amostra está dissolvida (polar atrai polar e não polar
atrai não polar).
Uma vez que a fase estacionária é mais polar que a fase móvel:
Componentes da amostra mais polares ligam-se mais fortemente à fase

estacionária (migração menor/ tempo de retenção maior);
Componentes da amostra menos polares ligam-se mais fracamente à fase

estacionária (migração maior/tempo de retenção menor);
Ex. TLC, cromatografia em coluna.

A função das fases moveis na cromatografia por adsorção

tem sentido amplo:
Função solvente
• Solubilizar os componentes
• Ter baixo p.eb.
Função eluente
• Transportar os componentes da mistura pela
coluna
• Remover ou dessorver estes componentes do
adsorvente
ORDEM CRESCENTE DE POLARIDADE: hexano < éter de petróleo < ciclohexano < benzene <
tolueno <diclorometano < clorofórmio < éter etílico < acetate de etilo < acetone < etanol <
metanol < ácido acético
Utilização
• Laboratórios de quimica orgânica – separações e purificações
• Laboratórios de produtos naturais
• Laboratórios de analyses clínicas – separação de esteróides na urina ou sangue (doping)

Cromatografia de partição 99
Os componentes da mistura são distribuídos entre duas fases líquidas

não miscíveis, as fases móvel e estacionária, com base nas suas
diferentes afinidades para cada uma delas (ou seja, nas diferenças
de coeficientes de partição);
KA/B= CA/ CB
Com: Depende da natureza dos solventes e da
afinidade do soluto por eles, esse valor
K – coeficiente de partição; varia ainda de acordo com a temperatura,
CA – concentração do soluto no solvente A; pressão e pH das soluções.
CB – concentração do soluto no solvente B;
Cromatografia de partição 100
Baseia-se assim, nas diferenças de solubilidade dos

componentes da amostra, na fase estacionária e na
fase móvel.
Depende da volatilidade da fase móvel
A fase móvel arrasta o soluto que contem amostra.
Um componente da amostra que tenha maior solubilidade na fase estacionária

terá um tempo de retenção maior, que um componente que tenha mais
solubilidade na fase móvel.
Ex. cromatografia líquido-líquido e gás-líquido

Cromatografia de troca iónica 101
O mecanismo de separação baseia-se no

estabelecimento de interações
electroestáticas reversíveis entre solutos
iónicos (da amostra) e uma fase estacionária
(um permutador iónico) que contém grupos
com carga contrária.
A fase estacionária é revestida com catiões ou aniões.

Quando a coluna é revestida com

catiões, os aniões presentes na amostra
são atraídos para a fase estacionária;
Quanto maior a atração para a fase
estacionária maior o tempo de
retenção.
Utilizada para separar moléculas

biológicas como proteínas,
aminoácidos ou nucleótidos.
Quanto a coluna é revestida com catiões, os aniões presentes na amostra

são atraídos para a fase estacionária; Quanto maior a atração para a fase
estacionária maior o tempo de retenção.
1. O grau ligações cruzadas de uma resina deve ser satisfatório para que não
ocorra a sua solubilidade.
2. A resina deve ser bastante hidrofílica para permitir a propagação de íons
pela estrutura em uma velocidade finita e possível na prática.
3. A resina deve ser quimicamente estável e possuir grupos de troca de íons
suficientemente acessíveis.
4. A resina, quando ensoberbecida, deve ser mais densa que a água
Cromatografia de exclusão molecular 104
Depende da ausência de qualquer interação entre o analito e a fase

estacionária integrada na coluna; A fase estacionária tem um gel com
uma rede porosa mais ou menos fina, consoante o tipo de análise.
As moléculas são separadas da maior à menor em

proporção ao seu tamanho molecular:
As moléculas muito grandes são excluídas do leito
empacotado e eluem primeiro;
As moléculas médias poderão penetrar os poros em
vários graus dependendo de seu tamanho;
As moléculas menores difundem-se mais dentro da
estrutura dos poros eluem por último.
Aplica-se em análise de proteínas

Permite:
• Separação de tamanhos específicos
• Separação de polímeros e proteínas
• Determinação de Massa Molar
https://www.youtube.com/watch?v=NC2Zi1x5WXc
FASE MÓVEL: LÍQUIDA
FASE ESTACIONÁRIA: GEL

Inércia química (sem interação entre a matriz e o soluto)
Estabilidade (o gel deve suportar uso contínuo)
GEL
• Dextrano
Baixo teor de iões (porque as cargas interferem na
• Poliacrilamida
separação)
• Ágar e agarose
Cromatografia de afinidade 107
É mais específica e seletiva. https://www.youtube.com/watch?v=hyzJaVv9aoc
Na fase estacionária há uma molécula que só reage com um outro tipo

de molécula (ex. antigénio – anticorpo, enzimas – substratos, hormonas-
recetores);
Todas as outras moléculas são eluídas, não ficando retidas na fase

estacionária.
Posteriormente altera-se o pH ou a força iónica
para eluir as moléculas de interesse que ficaram
retidas na coluna.
FASE MÓVEL: LÍQUIDA

FASE ESTACIONÁRIA: SÓLIDA

Cromatografia Geral - Aula 1

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Cromatografia Geral - Aula 1

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Técnicas Laboratoriais de Química e Bioquímica

1. Introdução à cromatografia: tipos de cromatografia;

2. Cromatografia em fase líquida: cromatografia em papel,

3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).

4. Cromatografia em fase gasosa.

TSWEET – 1903 – Separação de misturas de

● Testar a qualidade da água potável em estações de tratamento de águas residuais

● Testar a qualidade da água proveniente de agro-indústrias, pecuárias

● Deteção de drogas e/ou fármacos na urina, controlo anti-dopping

● Perfis nutricionais de alimentos

- da interacçao dos componentes da mistura com a fase móvel e a fase

A eficiência de uma separação (medida do alargamento

N, número de pratos teóricos

N mede a relação entre o tempo de retenção

Cada estágio de equilíbrio é

O Nº DE PRATOS TEÓRICOS numa

> N, coluna mais eficiente

Quanto menos um componente da

Quanto mais um componente da mistura

Quando um componentes da mistura atinge o equilíbrio entre a fase

Posto de outra forma….

É o equilíbrio de distribuição: Km = [X]s

[X]s: a concentração do componente da mistura na fase

[X]m: a concentração do componente da mistura na fase móvel

Cada componente da mistura terá um valor de Km diferente;

Componentes com Km baixo ficam menos retidos na fase

Cada componente da mistura terá um valor de Km diferente;

Componentes com Km elevado ficam mais retidos na fase

Planar Coluna Sólida Adsorção

Líquida Líquida Partição

Natureza da fase estacionária

Os principais fatores numa fase estacionária que determinam a

• Interações entre dipolos,

Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre Fase

Fatores a considerar na fase estacionária:

• Ponto de ebulição elevado

Fases não polares – fases reversas

Fases polares – fases normais

Adsorventes usados como fases estacionárias

Também conhecidos como fases estacionárias, interagem com a amostra

• Silica SiO4 Separaçao de aldeídos, cetonas, fenois, acidos gordos, aa,

Natureza da fase móvel e equipamento

Coluna Gasosa Fluído

Fase móvel: líquida - eluente Fase estacionária: sólida - papel

Uma das extremidades do papel é imersa num solvente;

O solvente (fase móvel) move-se através do papel, subindo por

A capilaridade é uma propriedade física

Esse mecanismo permite que os fluidos se

A fase móvel (solvente) move-se

- Ser adsorvido no papel, composto por celulose, à qual moléculas polares

Na cromatografia em papel a fase estacionária celulósica

O papel de cromatografia é geralmente

Tem troca iónica e adsorvência fracas.

Composition: a-cellulose (98

- O aumento da polaridade do sistema de solventes aumenta o

A mais utilizada Conveniente para separar

Por comparação com a

Termos e parâmetros técnicos

Envolve um adsorvente (fase estacionária), um

Os componentes da mistura são adsorvidos

As placas revestidas com sílica são as mais usadas, mas também se

Nas placas de sílica standard as partículas

Estas dimensões resultam numa superfície