MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS E

ESPECTROSCÓPICOS APLICADOS NA
ANÁLISE DE MEDICAMENTOS
09 alunos de Controle de Qualidade na Indústria Farmacêutica;
​21  alunos de Gestão da Qualidade e Auditoria em Processos Industriais;
​09  alunos de Gestão e Tecnologia Industrial Farmacêutica;

Fevereiro- 2018
 Apresentação
 http://lattes.cnpq.br/3320658303061871

https://www.linkedin.com/in/abelarj/
 Objetivos da aula
“Aprofundar os conhecimentos do aluno sobre a
utilidade de técnicas cromatográficas e
espectroscópicas aplicados a avaliação da qualidade
dos medicamentos e também a importância da sua
utilização para desenvolvimento e validação de
métodos de análise qualitativos e quantitativos de
medicamentos. ”
 Conteúdo Programático

Exposição dos temas inerentes aos sistema de análise

da qualidade envolvendo as técnicas básicas da
utilizadas pela indústria farmacêutica visando
estabelecer as ferramentas básicas do controle de
qualidade visando...
 Conteúdo Programático
• Introdução à Cromatografia.
• Teoria Cromatográfica (Teoria de pratos e Teoria Cinética).
• Cromatografia à Líquido,
• Cromatografia à Gás,
• Cromatografia de fluido supercrítico,
• Cromatografia Planar.
• Desenvolvimento e Validação de metodologias analíticas para
fins quantitativos Cromatografia de Alta Performance,
• Analises por espectrofotometria,
• Infravermelho
• Absorção Atômica.
• O botânico russo Mikhail Tswett (1872-1919) usou
uma coluna empacotada contendo carbonato de
cálcio como fase estacionária para separar
pigmentos coloridos de extratos de plantas. Como
fase móvel ele utilizou éter de petróleo.

• Cromatografia = kroma (cor) e graph (escrever)

 Cromatografias
• É um conjunto de métodos separativos que
permitem separar, identificar, quantificar e isolar
componentes semelhantes de uma mistura
complexa, o que em muitos casos seria impossível
por outros meios.

• Técnica na qual os componentes de uma mistura

são separados com base nas diferenças de
velocidade nas quais são transportados através de
uma fase estacionária fixo por uma fase
estacionária móvel (liquido ou gás)
 Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase
móvel) através de uma coluna de vidro preenchida com
carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se
adicionou o extrato, levou à separação dos
componentes em fases coloridas.
• Este é provavelmente o motivo pelo qual a técnica
é conhecida como cromatografia (chrom = cor e
graphie = escrita), podendo levar à errônea idéia de
que o processo seja dependente da cor.

• Cromatografia é um método físico-químico de

separação, no qual os compostos presentes em
uma mistura são distribuídos entre uma fase
estacionária e uma fase móvel
 Cromatografia
• A separação ocorre porque os compostos têm
diferentes afinidades com a fase estacionária e
com a fase móvel, portanto deslocam-se com
diferentes velocidades.

• Tal afinidade é atribuída à polaridade dos

compostos.
 Cromatografia
• A cromatografia pode ser utilizada para a
identificação de compostos, por comparação
com padrões previamente existentes, para a
purificação de compostos, separando-se as
substâncias indesejáveis e para a separação dos
componentes de uma mistura.
• Separação do analito se dá por duas fases:
ESTACIONÁRIA E MÓVEL

• As moléculas do analito hora estão em transição

na fase móvel hora estão na fase estacionária

• A separação dos componentes de um analito se

dará em função da diferença de suas constantes
de equilíbrio entre estas duas fases.
• Se um componente tem mais AFINIDADE pela fase
estacionária do que outros da mistura, as moléculas
deste componente ficarão mais RETIDAS na fase
estacionária.

• Ou seja, o(s) componentes da mistura com MENOS

afinidade pela fase estacionária “correrão” mais
rápido e sairão primeiro.

• Esta migração diferencial dos componentes de um

analito é chamada de eluição e o solvente que é
usado chamado de eluente.
 CG – Cromatografia Gasosa
• A fase móvel é um gás inerte, normalmente
nitrogênio, hélio ou hidrogênio.

• Se a fase estacionária é um líquido temos a

cromatografia gás-líquido ou cromatografia de
partição, se a fase estacionária é um sólido
temos a cromatografia gás-sólido ou
cromatografia de adsorção.
 CP – Cromatografia em papel
Identificação rápida e barata em laboratório da
quantidade de substâncias em uma solução e da
presença de determinada substância, quando
comparada ao padrão.
 Cromatografia Líquida PLANAR
• O conceito de cromatografias abrange várias
técnicas de separação
• Neste caso todas envolvem uma fase móvel
líquida
• A escolha desta fase móvel dependerá da
natureza dos compostos que você visa separar
• Neste caso as substâncias são separadas por
partição entre uma fase móvel LÍQUIDA e uma
fase estacionária sólida ou líquida imobilizada.
Cromatografia Líquida PLANAR
• Cromatografias em Camada Fina ou Delgada
(CCD)
• Silica gel ou alumina
• A base em geral é uma placa de vidro
• Uma gota da solução é colocada na base desta
PLACA CROMATOGRÁFICA e uma CUBA é usada
para colocar o solvente (eluente)
• Um papel embebido no eluente pode ser
utilizado para saturar o ar e auxiliar na eluição.
Fator de retardamento (Rf)
Uma das formas de se caracterizar uma substância
quando realizando uma CCD é pela medição do FATOR
DE RETARDAMENTO (Rf).

O fator de retardamento (Rf) é a diferença entre a

DISTÂNCIA PERCORRIDA PELA AMOSTRA e a
DISTÂNCIA PERCORRIDA PELO SOLVENTE
Rf – fator de retardamento
 Fator de retardamento (Rf)
• O fator de retardamento é dependente da
tensão superficial do solvente, da saturação da
cuba ou seja, da evaporação do solvente e da
viscosidade do solvente.
• Por estes motivos o Rf de uma determinada
substância é determinada para cada solvente.
Cromatografia Líquida PLANAR

•Útil em análises rápidas

•Fase Estacionária: Silica gel,

Alumina,

•Rf = fator de retardamente frente ao

solvente

•Útil na identificação rápida de

compostos
 Cromatografia Líquida PLANAR
• Cromatografia em Papel (CP)
• Semelhante a CCD
• Fase estacionária é Papel (padronizado)
• Também é utilizada uma CUBA para o eluente
(solvente = fase móvel)
• A celulose do papel adsorve a água do meio (ar e
solvente) e esta água é a fase estacionária desta
cromatografia.
 Cromatografia em coluna
• Abordagem mais útil das cromatografias
• Fase estacionária (material de empacotamento)
• Extração em fase sólida (SPE)
• Partículas maiores (> 50 microns) -> sistema aberto
• Partículas menores (<10 microns) -> aumento do
poder de separação (necessário uso de bombas e
pressão - HPLC)
 Cromatografia Líquida de Alta
eficiência (CLAE)
• Também conhecida como HPLC (High
Performance Liquid Cromatografy).

• Executada sobre altas pressões e sobre estrito

controle da velocidade do eluente, confere
grande eficiência na separação dos
componentes da solução.
• Inicialmente 500 psi [35 bar] (1970)
• Posteriormente 6,000 psi [400 bar]
• Habilidade de separar, identificar e quantificar
compostos presentes em qualquer amostra líquida
• parts per trillion [ppt] 
 Tipos diferentes de eluição
• ELUIÇÃO ISOCRATICA – FM constante

• ELUIÇÃO em GRADIENTE – FM altera ao longo

do cromatograma.
 Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE ou HPLC)
• Inicialmente intitulada cromatografia líquida de
alta pressão , teve este termo abandonado após
perceber-se que o diferencial deste técnica era a
eficiência e não a pressão elevada.
• É uma cromatografia líquido-sólido realizada em
ambiente onde a fase móvel é pressionada pela
coluna cromatográfica a pressão é volumes
altamente controlados.
Fonte: Neto, Aquino – Cromatografia – Princípios básicos e
técnicas afins.2003 – editora Interciência
 Constituintes do HPLC
• Bomba de alta pressão: relacionada à
reprodutibilidade das corridas cromatográficas.
As bombas devem ser capazes de impulsionar a
fase móvel através da coluna cromatográfica.

• Sistema de injeção de amostra: Pode ser

realizada por meio de uma válvula de
amostragem ou por meio de uma seringa de
injeção de amostra.
 Constituintes do HPLC
• Colunas: Feitas de aço inox com comprimentos
de 10 a 30 centímetros. Valores de diâmetro
podem variar de até menores de 1 mm para
colunas capilares, entre 2 e 6 mm para colunas
analíticas e maiores de 6 mm para colunas
preparativas.
 Constituintes do HPLC
• O “recheio” da coluna (fase estacionária) podem
ser polímeros sintéticos ou se sílica.
• Detector: Instrumento de medição do líquido
eluído da coluna. Podem ser divididos em dois
tipos:
• Detectores de propriedades macroscópicas
• Detectores de propriedades do soluto
 Constituintes do HPLC
• Os detectores de propriedades do soluto
medem as propriedades do soluto na fase móvel
e as prorpiedades do da fase móvel pura como:
condutividade, concentração, índice de refração,
fluorescência e espectrofotométrias.

• Esta detecção é transduzida em sinais elétricos

que é registrado.
Cromatograma
Cromatograma
Condições
Identificação e Quantificação de
Compostos
 Tipos de Eluições
• Isocrática: Fase móvel se mantem a mesma
 Tipos de Eluições
• Em gradiente: a composição do eluente muda ao
longo da corrida.
Diferentes escalas
Esquema de montagem de HPLC preparativo
 CONSIDERAÇÕES
IMPORTANTES
• Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua
eficiência, estão sendo introduzidas colunas de
diâmetro interno de 1 – 3 mm, de forma que possa
operar-se com fluxos menores o que resulta em
diminuição substancial do custo de operação e
aumento de sensibilidade.
Colunas
Performance de separação - Resolução

• Resolução cromatográfica [RS]

• Grau em que dois compostos são separados.
• Dois fatores principais:
• Força de separação mecânica (tamanho da coluna,
tamanho das partículas, uniformidade do
empacotamento)
• Força de separação química: criada pela competição
fisicoquímica entre FM e FE.
• A Eficiência é uma medida da força de separação
mecânica.
• A Seletividade é uma medida da força de
separação química.
Separação mecânica - Eficiência
• O poder de separação mecânica, também chamado
de eficiência, geralmente é medido e comparado
por um número de pratos teóricos [símbolo = N].

• Os leitos cromatográficos de menor partícula têm

maior eficiência e maior contrapressão. Para um
determinado tamanho de partícula, é maior o
poder de separação mecânica aumentando o
comprimento da coluna (maior tempo e gasto de
solventes)
Separação Química - Seletividade
• A combinação entre FE e FM irá determiner o grau
da força de separação química.
• Modificando a velocidade de cada analíto ->
otimizar a seletividade
 Tipos de modos de separação
• POLARIDADE
• Fase normal
• Fase reversa
• CARGA ELÉTRICA
• TAMANHO MOLECULAR
Espectro de polaridade cromatográfica pelo grupo
funcional do analito
• Sílica tem uma superfície contendo o grupo
funcional acidic silanol [alcool análogo], que é
polar.
• A polaridade da superfície da silica pode ser
modificada quimicamente a ligando a grupos
menos polares.
• cyanopropylsilyl- [CN],
• n-octylsilyl- [C8],
• n-octadecylsilyl- [C18, ODS]
Fase normal x Fase reversa
 Aspectos importantes da operação de
LC
• Muitos problemas na execução de LC são
provenientes do incorreto preparo e utilização de
solventes
• Problemas nas bombas de eluente
• Bolhas ou partículas presas no detector
• Contaminação da fase móvel
• Danos às bombas
• Injeção das amostras de forma imprecisa
Tais situações podem gerar...
• Alta contra-pressão do sistema
• Ruido de base relacionado ao fluxo do
eluente
• Tempos de retenção alterados
• Picos dos cromatogramas em formatos
anormais
• Resultados incorretos
 Cuidados
• Sempre usar solventes “Grau HPLC”
• Todos os solventes devem ser filtrados com filtro
0.45 micrometros (ou menor)
• Aumentando a vida útil do detector e das bombas
• Pesar todos os componentes da fase móvel
• Água: somente água ultrapura (18 megaohm de
condutividade)
• Água deionizada não deve ser utilizada
 Desgaseificação
• Fases móveis que não passam pelo processo de
desgaseificação ou passaram de forma
inapropriada pelo processo, são responsáveis por
70% dos problemas relacionados às análises de LC.
• Benefícios:
• Tempos de retenção reprodutíveis
• Operação estável das bombas
• Linhas de base estável
• Sensibilidade melhorada
 Métodos de desgaseificação
• Filtração a vácuo
• Sonicação
• Borbulhamento de Helio

• A combinação de 2 destes métodos geralmente irá

gerar boas taxas de desgaseificação
• Filtração a vácuo + sonicação
Resolução (Rs)

Indica a qualidade da
separação
 Componentes da Resolução
• 3 fatores principais impactam na resolução

• Fator de capacidade (k')

• Seletividade (α = alfa)
• Eficiência da coluna(N)
 Tempo de retenção (Tr)
• Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO,
Tr, de uma substância ao tempo decorrido do
instante em que a amostra foi introduzida até o
instante do máximo do pico.
Medindo o fator de capacidade
(k)
Exemplo:
• V0 = 2.90 mL
• V1 = 9.75 mL

• Bons valores ficam entre 2 e 10

• Baixos valores = resolução ruim
• Altos valores = tempo
• Sensível à:
• Pureza do solvente
• Temperatura
• Química da superfície da coluna (FE)
 Seletividade (α)
• É a retenção orelativa entre 2 picos
• Pode identificar problemas no cromatograma,
quando 2 picos se movem significativamente em
relação a outros picos.
Calculando a Seletividade
Sensibilidade responde à alterações na
FM, Temperatura e idade da coluna
 Medindo a Eficiência de uma
Coluna (N)
• Eficiência da coluna (pratos teóricos)
• Medida da dispersão da base do pico e do tempo
de retenção
• Quanto maior a numero de pratos, maior a
eficiência da coluna e do sistema como um todo.
• A mensuração da eficiência da coluna (N) é na
verdade a eficiência total do sistema de LC e da
coluna, combinados.
Teoria dos pratos teoricos
 Queda na eficiência da coluna
• Queda na eficiência da coluna pode indicar:
• Idade da coluna
• Configuração incorreta do detector
• Mudança na taxa de fluxo do solvent
ou na viscosidade do solvent.
Métodos de cálculo (N)
 Escolha do método de cálculo
• Escolha o método que melhor se adequa à ssuas
condições operacionais.
• Manter sempre o mesmo método de cálculo
(reprodutibilidade).
Método de Cálculo 4 Sigma
 Técnicas Hifenadas
• Acoplamento entre 2 ou mais técnicas analíticas.
• Ferramenta analítica mais eficiente.
• Exemplos:
• GC-MS
• LC-MS
• LC-FTIR,
• LC-NMR,
Fonte: Patel, et al - 2010
Cromatografia Gasosa + Espectrômetro
de Massas (CG – EM)
Cromatógrafo Líquido +
Espectrômetro de Massa
 Referencia bibliográfica
• D. A. SKOOG, F. J. HOLLER e T. A. NIEMAN – Princípios de Análise
Instrumental, 5a ed., Saunders, 2002.
• A. I. VOGEL - Análise Analítica Quantitativa, LTC, 6ª ed., Rio de
Janeiro.
• COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos de
Cromatografia, Editora Unicamp, 2006.
• MEYER, V. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography
4th ed. New York: John Wiley & Sons, 2004.
• AQUINO NETO, F. R. de; NUNES, D. S. S. Cromatografia –
princípios básicos e técnica afins. Rio de Janeiro: Interciência,
2003.
 Referencia bibliográfica
• Patel KN, Patel JK, Patel MP, Rajput GC, Patel HA. Introduction to
hyphenated techniques and their applications in
pharmacy. Pharmaceutical Methods. 2010;1(1):2-13. doi:10.4103/2229-
4708.72222.

• G.C. Kite, N.C. Veitch, R.J. Grayer, M.S.J. Simmonds, The use of
hyphenated techniques in comparative phytochemical studies of
legumes, Biochemical Systematics and Ecology, Volume 31, Issue 8, 2003,
Pages 813-843,ISSN 0305-1978,

• http://www.waters.com/waters/home.htm?locale=pt_BR

• https://www.fda.gov/

• http://portal.anvisa.gov.br/