Cromatografia e suas aplicaes

RESUMO

Atualmente muitas so as tcnicas analticas que podem ser efetuadas em laboratrios com maior praticidade e eficincia com o intuito de obter resultados qualitativos e quantitativos com maior segurana. Uma tcnica muito utilizada para separar substncias a cromatografia. Esse artigo objetiva mostrar a eficincia, vantagens e desvantagens desse mtodo de separao e quais aspectos positivos fazem com que esse mtodo analtico seja um dos mais utilizados sendo tambm muito eficiente, considerando que para anlise quantitativa de dados dos trabalhos analisados ser dada nfase na cromatografia gasosa.

Palavras-chave: Cromatografia, fase, quantitativa.

ABSTRACT

Currently there are many analytical techniques that can be performed in laboratories with greater convenience and efficiency in order to obtain qualitative and quantitative results with greater security. A widely used technique for separating substances is chromatography. This article aims to show the efficacy, advantages and disadvantages of this method of isolation and positive aspects which make this analytical method is one of the most used is also very efficient, whereas data for quantitative analysis of the studies analyzed emphasis will be placed in gas chromatography .

Keywords: Chromatography, phase, quantitative.

1.0 - Introduo O termo cromatografia atribudo ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett que, no incio do sculo empregou

a tcnica para a separao de pigmentos presentes em folhas de plantas, atravs da passagem de extratos de folhas, arrastados por ter de petrleo, atravs de leitos de

carbonato de clcio finamente dividido. As espcies separadas (clorofilas e xantofilas) apareciam nos leitos como bandas

quantitativa,

pela

prpria

tcnica

de

cromatografia ou em conjunto com outras tcnicas massas. [1] No que diz respeito classificao, os mtodos cromatogrficos podem ser classificados de duas formas. A primeira, mais simples, baseada na forma pela qual as duas fases so colocadas em contato. Segundo poderiam esse ser critrio, os mtodos em duas experimentais, tais como a

coloridas, e por isso Tswett chamou o mtodo de cromatografia, do grego chroma (cor) e graphein (escrever).[1] A definio de cromatografia dada pela IUPAC em 1993 a seguinte: cromatografia o mtodo fsico de separao no qual os componentes a serem separados se distribuem entre duas fases, uma das quais estacionria, enquanto a outra se movimenta numa direo definida. A mistura que contm os componentes a serem separados

espectrofotometria ou a espectrometria de

classificados

categorias: [1] cromatografia em coluna, na qual a fase estacionria mantida dentro de um tubo, em geral bastante estreito, dentro do qual a fase mvel forada por efeito de presso ou pela efeito da gravidade; cromatografia planar, na qual a fase estacionria suportada numa superfcie plana ou nos interstcios de um papel. A fase mvel se move atravs da fase estacionria por efeito da capilaridade ou da gravidade. Outro critrio de classificao, mais fundamental, baseado nos tipos de fases

dissolvida na fase mvel. Durante a passagem da fase mvel atravs da fase estacionria, alguns componentes so

fortemente retidos pela fase estacionria e por isso se movem lentamente com o fluxo da fase mvel; enquanto isso, outros componentes interagem fracamente com a fase estacionria, sendo transportados mais facilmente pela fase mvel. Devido a essas

diferenas em mobilidade, os componentes da mistura podem de forma ser separados e

estacionrias e mveis, e nos mecanismos envolvidos nas transferncias de solutos entre as fases. [1] ltimo caso, a fase lquida pode ser chamada de fase ligada. A fase mvel pode ser lquida, gasosa ou um fludo supercrtico. [1]

analisados

qualitativa e/ou

A fase estacionria pode ser slida ou lquida. No caso de fase estacionria lquida, o lquido pode simplesmente estar espalhado sobre um suporte slido ou ento estar imobilizado sobre este. Neste

Os mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatogrficos so mencionados nas Figuras 1.1 a 1.5, a seguir. 1.1 Adsoro:

1.3 - Troca Inica: A fase estacionria constituda de uma matriz onde so adicionados grupos funcionais ionizveis (catinicos ou aninicos). A fase mvel , geralmente, uma soluo inica com propriedades tamponantes, escolhidas de forma a ser compatvel com o tipo de trocador usado. Bioafinidade: utiliza

Processo baseado em interaes eletrostticas, dipolares Waals, (Van de

grupos funcionais, ligados quimicamente matriz estacionria, que possuam

por exemplo) ou pontes de

hidrognio, que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfcie da fase estacionria slida e a fase mvel. Em processos cromatogrficos, a adsoro sempre reversvel (a dessoro do soluto implica na volta deste fase mvel). [1] 1.2 Partio: a fase um 1.4 Bioafinidade: grupos ligados especificidade biolgica. Esses grupos retiram da fase mvel somente as suas espcies complementares, deixando passar todas as outras espcies. [1] Quando estacionria

lquido, espalhado na superfcie de um suporte slido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo interfacial, ocorrendo por absoro, ou partio, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria. [1]

Utiliza funcionais,

quimicamente matriz estacionria, que possuam especificidade biolgica. Esses grupos retiram da fase mvel somente as suas espcies complementares, deixando passar todas as outras espcies. [1]

1.5 - Excluso: Baseia-se em um processo puramente mecnico. A fase estacionria uma matriz de composio inerte, com textura

poros)

controlada.

Os

componentes

presentes na fase mvel podem ser separados porque os menores so capazes de penetrar facilmente em todos os poros da fase estacionria, equilibrando-se com a

(superfcie e distribuio de tamanhos de

fase mvel que tambm entra nos poros, enquanto as maiores so excludas,

quimicamente ligadas a um suporte slido tambm podem apresentar um mecanismo de separao que um compromisso entre adsoro (sobre stios ativos do suporte slido) e partio (que ocorre na fase lquida quimicamente ligada). A

acompanhando a fase mvel que fica fora dos poros. As molculas com tamanho intermedirio entre esses dois extremos migram com velocidades variveis, sendo que possuem penetrao seletiva nos poros, entrando em alguns, mas no em todos. [1] A cromatografia vem apresentando crescente utilizao como ferramenta

contribuio relativa de cada mecanismo depende da quantidade relativa de cada tipo de grupo funcional existente. Uma

classificao dos mtodos cromatogrficos, retirada de Collins et al. (1990), apresentada na Tabela 1.[1] Tabela 1 Classificao dos mtodos

analtica devido sua simplicidade, ao custo relativamente baixo, vasta gama de aplicaes possveis e possibilidade de fornecer dados quantitativos confiveis. [1] Processos utilizam fases cromatogrficos estacionrias que

cromatogrficos, retirada de Collins et al. (1990)

lquidas aqueles obtidos a partir de um ou mais padres. Se as condies operacionais forem bem controladas, esses parmetros (altura e rea dos picos) variam

A anlise quantitativa est baseada na comparao das alturas ou das reas dos picos correspondentes aos compostos

presentes nas misturas sob anlise com

Tcnica Fase Mvel Fase Estacionria Tipo de Cromatografia PLANAR Lquida . Gasosa

EM COLUNA Fluido Supercrtico Slido Ligada

CSS CSFL

Lquida Lquida Slido

CLL

Lquida Slido Ligada

CP CCD CCD

Lquida Slido Ligada

CGL CGS CGFL

Ligada

CLS CE CLFL CTI CB

Sigla em Portugus CP CCD CCD CGL CGS CGFL CSS

Nome da Tcnica

Sigla em Portugus

Nome da Tcnica

Cromatografia em papel Cromatografia em camada delgada Cromatografia em camada delgada Cromatografia gs-lquido Cromatografia gs-slido Cromatografia gs fase ligada Cromatografia supercrtica com fase estacionria slida

CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB

Cromatografia supercrtica com fase ligada Cromatografia lquido-lquido Cromatografia lquido slido Cromatografia por excluso Cromatografia lquida com fase ligada Cromatografia por troca inica Cromatografia por bioafinidade

linearmente com a composio. [1] Numerosos descritos para mtodos tem sido

evitar erros comuns experimental, e para encontrar as melhores maneiras de eliminar sua interferncia durante a fase de anlise quantitativa. [3] Tappin et al., (2004), desenvolveu um trabalho de anlise quantitativa com Cromatografia Gasosa utilizando Detector por Ionizao de Chama GC-FID utilizada para anlise de leos de copaba metilado, utilizando trans-(-)-cariofileno, ou copalate metilo como padres externos. Curvas analticas mostraram boa linearidade e reprodutibilidade em termos de correlao de coeficientes (0,9992 e 0,996,

deteco

dos

vapores

orgnicos eludos num cromatgrafo a gs. Os principais mtodos de deteno so classificados de acordo com as

propriedades fsicas que configuram o mecanismo de deteco. Os detectores so classificados como: universal, seletivo e especfico. Os detectores de ionizao de chama e condutividade trmica respondem na presena de todos os compostos orgnicos e so portanto considerados detectores universais. Outros detectores respondem somente na presena de um heterotomo em particular (por exemplo, fotomtrico de chama e termoinico so considerados detectores especficos). O de captura de eltrons considerado seletivo, pois detecta qualquer substncia que apresente grupo atmico capaz de captar eltrons. [2] Ligiero et al., (2009), desenvolveu um experimento que consistiu na extrao e anlise de eugenol a partir de sementes de cravo para realizar uma abordagem quantitativa, que teve como objetivo comparar os resultados obtidos por

respectivamente) e desvio padro relativo (<3%). Quantificao de sesquiterpenos e cidos diterpenic foram realizados com cada padro, separadamente. a Quando da

comparado

com

normalizao

resposta integrada, a padronizao foi estatisticamente semelhante para o caso de copalate de metila, mas a resposta de trans(-)-cariofileno foi estatisticamente

diferente (P <0,05). Este mtodo mostrouse adequado para a classificao e controle de qualidade de amostras comerciais de leos. [4] Silva, Silva e Druzian (2010), desenvolveram uma pesquisa no intuito de pesquisar a existncia de um antibitico em leite caprino que pode ser nocivo populao. Os antibiticos e outros

procedimentos de calibrao interna e externa. Portanto, esta experincia mostrou ser ferramenta muito eficaz para aumentar a conscincia dos alunos sobre a

necessidade de compreender os diferentes tipos de calibrao no GC e sobre como

medicamentos administrados em animais podem caracterizar perigos relacionados ao

risco de intoxicaes de origem alimentar para os humanos. Devido a isto, o monitoramento dos resduos de

na populao. O presente trabalho consiste na otimizao e validao de metodologia analtica para determinao de resduos de cloranfenicol em leite de cabra por GC / ECD. A extrao foi feita com acetato de etila e do clean-up com o SPE-C18. A identificao foi feita por comparao do tempo de reteno e GC/MS, ea quantificao por padronizao externa. [5]

medicamentos veterinrios em alimentos tornou-se uma rea de preocupao

constante dos consumidores, rgos reguladores e instituies de pesquisa. A presena de resduos de cloranfenicol em leite de cabra pode causar efeitos txicos

2.0 Esquema de Cromatgrafo

Figura 2 Esquema de Cromatgrafo Gasoso. [6] 2.1 Sistema de bombeamento e pressurizao A tabela 2 apresenta caractersticas de sistemas de bombeamento e pressurizao. [7]

Tabela 2. Caractersticas de trs tipos de sistemas de pressurizao

Tipo Bomba

de

Funcionamento

Vantagens

Limitaes

Uso

pressurizao pneumtica

um lquido em um recipiente metlico pressurizado diretamente com nitrognio (ou outro gs inerte)

a opo mais fcil e barata de se implementar em um laboratrio, pois o vaso de pressurizao pode ser construdo em uma oficina mecnica simples

este sistema bastante limitado, uma vez que amaior presso disponvel de se obter igual do cilindro de nitrognio (aproximadamente 160 bar)

se o sistema dispuser de uma boa vlvula de alta presso, a programao de presso possvel, podendo ser efetuados incrementos contnuos

pisto reciprocante

uma bomba tpica de HPLC; funciona com um ou dois pistes de pequeno volume que alternadamente puxam o lquido do reservatrio e o comprimem em direo coluna cromatogrfica

sistema utilizado possvel em

amplamente HPLC;

existe a necessidade de instalao supressor de de um pulso,

se

fluido

for

lquido temperatura

controlar

satisfatoriamente a presso e operar facilmente com programao de

eletrnico ou mecnico, para se obter livre um de

ambiente, nenhuma modificao necessria, porm

bombeamento pulsao

composio de fase mvel e/ou adio de

se o fluido for um gs, ento

modificadores

necessrio refrigerar a bomba

seringa funciona

funciona pisto

como

um

a mais indicada para o uso em SFC pois apresenta fluxo estvel, rpida

sem dvida, a bomba seringa a opo de melhor desempenho por ser livre de pulsao e por atingir altas presses,

seringa

preenchida com o fluido na

nico, porm de grande volume (~20 mL)

resposta programao e permite tambm a utilizao de gases como desde fluido que

composio a ser usado, podendo ser usado tanto com

porm tambm a de maior custo e no permite mudana rpida de

supercrtico,

vazo ou presso constantes ou com gradiente densidade de

estejam no estado lquido (para tal necessrio

composio de fase mvel

resfriar o sistema antes da pressurizao)

2.2 Injetores Vrios autores pioneiros chegaram a construir seus prprios injetores. Jentoft e Gouw montaram um injetor de alta presso do tipo stop flow. Sie e Rijnders descreveram um sistema onde a amostra era injetada pneumaticamente para dentro da coluna. Atualmente esto sendo

desenvolvidos sistemas de injeo de

amostras para alta presso baseados no tempo, os quais possibilitam a injeo de volumes bastante reduzidos com alta preciso e exatido. Na Tabela 3 so

apresentadas algumas relaes de volume de injeo em funo do dimetro e comprimento da coluna. [7]

Tabela 3. Volumes tpicos de injeo (Vinj) em funo do dimetro interno (d.i.) e comprimento (L) da coluna capilar. [7]

Dimetro interno Volume do injetor Comprimento da coluna d.i. (m) 200 100 50 Vinj (L) 1,50 0,27 0,05 4,8 3,4 2,4 L (m)

Injetores: Seringas

Firgura 3 Injeo com seringas. [8] 2.3 - Colunas Um resumo das vantagens e e empacotadas apresentado na Tabela 4.[7]

desvantagens do uso das colunas capilares

Tabela 4. Resumo das caractersticas do emprego das colunas capilares e empacotadas [7]

Coluna capilar Vantagens: Baixa queda de presso Alta eficincia Facilidade de interface com detectores FID e MS Baixa vazo de fase mvel (bomba seringa) Desvantagens: Baixa velocidade tima Difcil controle de vazo Baixa sensibilidade com detectores UV e IR Coluna empacotada Vantagens: Menor tempo de anlise Alta capacidade de amostra (sensibilidade) Possibilidade de uso de detectores UV e IR Desvantagens: Alta queda de presso Baixa eficincia Grande rea superficial (possvel efeito de adsoro)

2.4 Restritores

Os restritores so usados para que se mantenha a presso homognea dentro da coluna cromatogrfica. Restritores mais simples so constitudos de tubo de slica fundida de pequeno dimetro interno (<10 m) como o utilizado por McNair e Hensley. Bertsch e Green compararam 5

tipos de restritores: restritor de slica fundida, restritor de slica fundida no tratada, restritor de ao inox, restritor de vidro Pyrex e restritor de filtro sinterizado microporoso, tendo obtido um melhor resultado com o primeiro. [7]

Figura 4 - Diagrama de vrios restritores que podem ser usados para SFC. A)de slica fundida com redutor, B) de slica fundida com extremidade cnica, C) e D) de slica fundida com diferentes dimetros de orifcio, E) de slica fundida com orifcio interno formado a partir da compresso da coluna temperatura elevada, F) formado pela deposio de material no final do capilar, G) de orifcio tipo pinhole, muito usado para SFC-MS, H) de slica fundida formada por filtro poroso (frit), I) Restritor com a extremidade comprimida (pinched). 3.5 Detectores

Destrutivos/no destrutivos; Os detectores utilizados nas

Classificados quanto a seletividade: Universais, Seletivos ou Especficos. Caractersticas desejveis:

pesquisas mostradas neste trabalho so os detectores por ionizao de chama. Um detector de ionizao de chama (FID ou DIC) consiste em uma chama de hidrognio (H2)/ ar e um prato coletor. O efluente passa da coluna do CG atravs da chama, a qual divide em molculas orgnicas e produz ons. Os ons so recolhidos em um eletrodo negativo e produzem um sinal eltrico. O FID extremamente sensvel com uma faixa

Sensibilidade elevada; Baixo nvel de rudo; Resposta para os compostos de interesse

(universais, seletivos e especficos);

Ampla faixa de linearidade; Quantidade mnima detectada; Insensvel a pequenas mudanas de

fluxo e temperatura;

dinmica grande. Sua nica desvantagem que destri a amostra.

(He2) ou hidrognio mais nitrognio (N2). Os ons e eltrons que se formaram na chama ficam presos em um eletrodo permitindo que uma corrente flua no circuito externo. A corrente proporcional aos ons formados, o que depende da concentrao de hidrocarbonetos nos gases e detectada por um eletrmetro e mostrada na sada anloga. [9] O FID oferece uma leitura rpida, precisa e contnua da concentrao total de HC para nveis to baixos como ppb.
[9]

Os detectores por ionizao de chama so usados para detectar hidrocarbonetos (HC) como o metano (CH4), etano (C2H6), acetileno (C2H2), etc. [9]

Alta sensibilidade: determinaes at

-13

10

g/mL.

Simplicidade. Gs de arraste: estabilidade trmica e Hidrognio, Helio e

inrcia qumica Nitrognio.

A amostra a ser analisada mistura-se com hidrognio (H2), hidrognio mais hlio 3.0 reas de aplicao

desenvolvimentos de processos para a indstria farmacutica, de alimentos,

cosmtica, de engenharia de alimentos, de perfumaria e para as indstrias de

processamento qumico, com as seguintes finalidades: [11]

Preparao mais das

de

extratos fielmente

que os

representam componentes

matrias-primas

originais, tanto do aspecto qumico quanto do ponto de vista sensorial;

Isolamento,

remoo,

e/ou

Figura 5 Detector por ionizao de chama.

[10]

concentrao de princpios ativos naturais, tais como: antioxidantes, corantes,

constituintes organolepticamente idnticos, constituintes Pelo processo da extrao por fluido supercrtico, podem ser feitos fitoterpicos e produtos

indesejveis, como a nicotina, a cafena e certos componentes txicos;

Extrao

de

matrias-primas

Extrao de derivados da lignite; Extrao de hidrocarbonetos

frmacos de fontes botnicas;

Processamento

de

produtos

lquidos do carvo de pedra e da hulha;

sanitrios e suplementos alimentcios;

Extrao de leos essenciais de

Produo de uma variedade de de condimentos de alta

plantas aromticas, etc. [011] De forma geral CG e aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham pontos de ebulio de at 300oC e que so termicamente estveis.
[10]

oleorresinas qualidade;

Purificao de polmeros; Extrao e refino de leos

comestveis;

Concentrao de leos ctricos; Extrao e fracionamento de leos

Anlise de cidos graxos e triglicerdeos; Anlise de compostos volteis

de sementes e cidos graxos;

responsveis pelo aroma caracterstico de alimentos; Anlise de aucares; Anlise de amino cidos; Anlise de pesticidas; Separao de pesticidas de amostra de vinho; Anlise de frmacos e etc. [10] 4.0 Anlise Quantitativa a partir da

Extrao de aromas e constituintes

cosmticos;

Extrao de inseticidas naturais de

plantas;

Extrao dos corantes da pprica,

crcuma, urucum, genipapo, tagetes e pimentas vermelhas;

Extrao da lecitina pura da lecitina

bruta;

Separao do colesterol da gema de

Cromatografia Gasosa

ovo, de gorduras animais e de carnes;

Extrao

rpida

de

produtos

Para quantificao de dados foi utilizada a cromatografia trabalhos gasosa, pois, muitos dando

naturais, como caf, lpulo, cafena, lipdios;

foram

desenvolvidos

Separao

de

aromticos

de

nfase a esse tipo de cromatografia considerada muito eficiente.

produtos do petrleo;

Remoo de metais do resduo do

petrleo;

4.1 - Obteno do leo de cravo-da-ndia

1,8 mL min-1. O volume de injeo foi de 1 L. Os tratamentos estatsticos e a

Condies cromatogrficas

gerao dos grficos foram feitos no software Origin 7. [3]

As anlises cromatogrficas foram realizadas em um cromatgrafo a gs acoplado a um detector de ionizao em chama (CG-DIC) modelo Shimadzu 17A, utilizando uma coluna DB-1 J&W de 30 m, dimetro interno 0,25 mm e espessura do filme de 0,25 m. A temperatura do injetor e do detector foram mantidas em 200 e 230 oC, respectivamente, e a programao do forno foi de 50 at 230 oC com uma taxa de aquecimento de 15 oC min-1. O gs carregador utilizado foi o hidrognio com uma vazo na coluna de

Resultados e Discusso A Figura 6 mostra o cromatograma

obtido a partir da injeo de um dos padres. Os sinais com tempos de reteno de 5,32 e 6,29 min referem-se carvona (padro interno) e ao eugenol,

respectivamente. possvel observar na figura que a resoluo obtida permitiu a separao completa dos dois componentes, no havendo sobreposio dos picos cromatogrficos. Os valores obtidos para as reas dos padres e a razo entre as reas so apresentados na Tabela 4. [3]

Figura 6 - Cromatograma do padro contendo eugenol e carvona.

Tabela 4. Resultados das injees dos padres

A curva de calibrao direta, Figura 7, foi obtida atravs de um grfico da concentrao de eugenol versus a rea dos respectivos sinais. O valor do coeficiente de correlao linear (R) de 0, 97007, maior que o valor crtico tabelado de Pearson para N= 5 (N o nmero de pontos da curva) indica uma correlao linear

significativa entre os dados. J a curva para calibrao interna, Figura 8, foi construda usando a concentrao de eugenol versus a razo entre as reas dos sinais de eugenol e carvona de cada soluo-padro. O valor de R= 0, 99867 mostra que a correlao linear para este caso foi mais significativa que para a curva anterior. [3]

Figura 7 Curva de calibrao externa do Eugenol.

Figura 8 Curva de calibrao utilizando padro interno.

Idealmente as curvas de calibrao deveriam passar pela origem, porm, isso

no foi observado para as curvas obtidas. Desta forma, levou-se em considerao o

valor dos desvios referentes a cada parmetro (coeficientes fornecido pelo das equaes e das retas

valores dos coeficientes lineares foram considerados estatisticamente no

lineares

angulares),

significativos para as duas curvas, no sendo utilizados nas equaes das retas para os clculos das concentraes. [3] A anlise da amostra extrada do cravo-da-ndia foi feita em replicata por quatro analistas, o que um procedimento comum nos casos em que a prtica realizada por uma equipe e onde todos devem participar. A Tabela 6 mostra os resultados obtidos por cada analista

software utilizado na

confeco dos grficos, para avaliar a significncia dos mesmos (Tabela 5). Para que o parmetro seja estatisticamente significativo, a razo entre o valor do parmetro e o desvio deve ser maior que o valor tabelado para o t de Student. Em um modelo linear, o nmero de graus de liberdade (GL) dado por GL= N - 2, onde N o nmero de pontos da curva. Para um limite de confiana de 95%, o t de Student tabelado igual a 3,182; desta forma, os

levando em considerao os dois tipos de calibrao. [3]

Tabela 5 Anlise estatstica de significncia dos parmetros das curvas

Tabela 6 Resultados obtidos com diferentes analistas

Por anlise de varincia one-way dos resultados obtidos para os dois tipos de

calibrao, Tabela 7, foi possvel constatar que as mdias das duas metodologias so

significativamente diferentes a um nvel de confiana de 95%.

[3]

a erros na medida de volume e de manuseio do operador do mtodo de calibrao externa. Os desvios relativos para o clculo de eugenol na amostra com a calibrao externa e interna foram de 6,272 e 0,673%, respectivamente. O percentual de eugenol obtido no leo atravs da calibrao do padro interno foi compatvel com o valor apresentado na literatura (70 a 90%)3, enquanto que para a calibrao externa o valor encontrado foi inferior ao esperado. [3]

Assim sendo, atravs desta prtica foi possvel demonstrar a pouca

reprodutibilidade que existe nos resultados quando vrios analistas esto envolvidos na injeo de uma amostra com fins quantitativos na tcnica de cromatografia gasosa e, principalmente, que a utilizao de padronizao interna infere um desvio muito menor nos resultados (Tabela 8). Este fato indica uma maior suscetibilidade

Tabela 7 - Resultados da ANOVA para as duas calibraes

Tabela 8 - Comparao entre as diferentes calibraes

4.2 - Padronizao do leo de copaba por cromatografia em fase gasosa de alta resoluo Resultados e Discusso

Para desenvolvimento do mtodo de anlise quantitativo, a padronizao interna natureza com substncias de mesma em um

detector por ionizao em chama quase constante para substncias de mesma classe, principalmente aquelas de alto peso molecular, as concentraes de outros sesquiterpenos abundantes tambm podem ser determinadas por intermdio do uso do trans-(-)-cariofileno. O mesmo estudo foi realizado com o padro de cido coplico isolado do leo, com o intuito de comparar os resultados obtidos pelas duas vias de quantificao. [4] Linearidade e faixa de resposta do padro A Tabela 9 apresenta os dados relativos s curvas analticas para os padres de sesquiterpeno e do cido diterpnico triplicatas padro, metilado, das com injees o obtidas das com

qumica

implicaria

nmero reduzido de anlises. No entanto, o cromatograma do leo de copaba

apresenta-se, em geral, muito complexo quanto ao nmero de sinais registrados dada a extensa variedade de espcies terpnicas presentes, inviabilizando o

emprego do mtodo de padronizao interna. Por isso, foi investigada a tcnica de padronizao externa com um padro comercial de trans-(-)-cariofileno. Este foi selecionado por ser um hidrocarboneto sesquiterpnico de presena ubqua nas amostras descritas de leo de copaba (e tambm na maioria das misturas volteis de origem vegetal) e comercialmente disponvel como um padro analtico de elevada pureza. Uma vez que a resposta do

solues de cinco

mnimo

concentraes, conforme recomendado por rgos reguladores. [4]

Tabela 9 - Dados da curva analtica para o trans-(-)-cariofileno e o ster metlico do cido coplico

Anli ses realizadas em triplicatas. Os coeficientes

lineares no

diferiram estatisticamente (P < 0,05) de zero. Dentro da faixa de concentrao estudada para os padres, foi encontrada a faixa linear de resposta do detector, a partir da qual foi estabelecido o limite mnimo em que as substncias puderam ser quantificadas com exatido e preciso aceitveis (Tabela 2). Visto que os coeficientes lineares das curvas analticas, tanto para o cido coplico como para o trans-(-)-cariofileno no diferem

analito. O mtodo proposto demonstrou ser seletivo, no sendo afetado pelos outros constituintes da matriz ou por interferentes dos reagentes e solventes. [5]

Linearidade

Para a quantificao empregou-se o mtodo da padronizao externa, visando obter anlises com menores custo e tempo de anlise. A linearidade de um mtodo mostra quanto os resultados obtidos so diretamente proporcionais concentrao do analito, dentro de um intervalo especificado. [5] Os valores das reas dos picos das solues de CAP silanizado versus as respectivas concentraes foram utilizados

estatisticamente de zero (P < 0,05), a quantificao de sesquiterpenos e

diterpenos foi realizada por normalizao e comparao direta da respectiva soluo padro com a rea do analito em questo.[4] 4.3 Otimizao de e Validao Para

para aplicar a regresso linear via mtodo dos mnimos quadrados. A curva analtica obtida por padronizao externa com cinco nveis de calibrao injetados em triplicata no CG/DCE resultou uma equao de reta (y = 5200,3x - 382,43) com coeficiente de determinao (R2) de 0,998 (Figura 9). De acordo com os critrios de aceitabilidade

Intralaboratorial

Mtodo

Anlise de Resduos de Cloranfenicol em Leite Caprino por Cromatografia

Gasosa com Deteco Por Captura de Eltrons (CG/DCE) Validao do mtodo analtico

Seletividade

dos

resultados,

coeficiente

de

determinao da curva analtica (R2) deve De acordo com os cromatogramas do branco da matriz, do padro de CAP silanizado e da matriz fortificada, ser 0,995. Os valores de linearidade obtidos por mtodos que fazem a

quantificao por padronizao interna so similares (Tabela 10). Portanto, o valor do coeficiente de determinao obtido por

evidencia-se a seletividade do mtodo, pela ausncia da deteco de picos no tR do

padronizao externa (0,998) satisfatrio. [5]

Figura 9 - Curva analtica de CAP silanizado (rea x concentrao em g/kg) obtida por CG/DCE. y = 5200,3x 382,43 e R2 = 0,998. Tabela 10 - Comparao entre os parmetros de validao obtidos pelo presente mtodo para leite caprino e os valores encontrados na literatura para leite bovino
Ref. Este estudo 24 23 26 27 28 29 30 Tcnica Aplica a CG/DCE CG/DCEa CG/EM/EMb CL/EM/EMc CL/EM/EMc CL/EM/EMc CL/EM/EM CL/EM/EMc
c

Extrao Acetato de Etila Acetonitrila Acetonitrila Acetonitrila Acetato de Etila Acetato de Etila Acetonitrila cido tricloactico 10% SPE C18

Purificao SPE C18 SPE C18 SPE C18 SPE C18 No utilizou

R2 0,998

LOD
(g/L)

LOQ
(g/L)

CC
(g/L)

CC
(g/L)

0,030

0,10 5,0 0,083 0,11 0,090 0,050 0,020 0,020 0,14 0,15 0,11 0,090 0,040 0,030

0,9995 1,0 0,979 0,9605 0,998

No utilizou 0,980 No utilizou 0,999 SPE HLB 0,999

31

CL/EM/EMc

39

CL/EMd

48

CL/EM

Tampo Fosfato pH 4.0 Acetonitrila

xido Neutro de Alumnio PMNE

0,9999

0,030

0,998

0,040

0.14

SPE LMS

0,999

050

1.0

Cromatografia gasosa com deteco por captura de eltrons;

c d

cromatografia gasosa com

deteco por espectrometria de massas em tandem; cromatografia lquida com deteco por espectrometria de massas em tandem; fornecidos.[5] Limites de deteco e quantificao O LOD determinado atravs da razo entre sinal:rudo (3:1) foi de 0,030 mg/kg, e o LOQ determinado pela relao sinal:rudo (10:1) foi de 0,10 mg/kg. [05] Mtodos que utilizam as tcnicas de CL/EM/EM e CG/EM/EM para a mtodos que utilizam CL e CG associados com as tcnicas de espectrometria de massas. [5] Comparando-se os dados de LOD e LOQ obtidos neste estudo com os dados da nica referncia encontrada que utilizou a tcnica de CG/DCE para a determinao de CAP em leite bovino (Tabela 10), observa-se que os LOD e LOQ obtidos no presente estudo (0,030 e 0,10 g/kg) so cerca de 30 vezes maiores para o LOD e 50 vezes maiores para o LOQ. Uma vez que as matrizes de leites bovinos e caprinos possuem semelhanas na composio cromatografia lquida com deteco por

espectrometria de massas; e micro-extrao com polmero monoltico; - dados no

determinao de resduos de CAP em leite bovino apresentam limites de deciso (CC) e capacidades de deteco (CC) nas faixas de 0,020 a 0,11 g/kg e de 0,030 a 0,15 g/kg, respectivamente (Tabela 10). Mtodos utilizando a tcnica de CL/EM tambm para a matriz leite bovino

resultaram em um LOD entre 0,040 e 0,50 g/kg e LOQ de 0,14 a 1,0 g/kg. Vale ressaltar que estes mtodos empregaram procedimentos de extraes diferentes dos utilizados no presente estudo, assim como etapas de purificao distintas ou ausentes (Tabela 10). Estas diferenas podem ter influenciado na recuperao do analito e, consequentemente, a sensibilidade dos mtodos. [5] Portanto, nota-se que o emprego do CG/DCE nas condies utilizadas no presente mtodo de validao permite atingir nveis de sensibilidade prximos a

centesimal, esta diferena de sensibilidade pode ser devida aos distintos procedimentos de extrao das amostras, tais como, no remoo da frao lipdica, que pode resultar em um aumento no nvel de interferentes e, a utilizao de gua para retomar o extrato seco anterior etapa de purificao por SPE-C18, que pode ter reduzido a recuperao do resduo e a sensibilidade do mtodo, considerando que o CAP tem baixa solubilidade neste solvente. [5]

5.0 - Vantagens A Cromatografia com Fluidos

Os extratos quase no sofrem oxidao, esterificao,

Supercrticos (SFC) foi desenvolvida a partir do conhecimento j bem

hidrlise,

caramelizao ou alteraes trmicas, por isso

sedimentado da cromatografia gasosa (GC) e da cromatografia lquida (LC).[12] So citadas algumas vantagens ao utilizar a cromatografia com Fluidos Supercrticos. Das muitas vantagens particulares da extrao supercrtica, as principais so:

representam

melhor

material

original; A fora solvente ajustada via

compresso mecnica;

difundibilidade

do

soluto,

consideravelmente maior do que a dos solventes lquidos;

Os solventes usados, geralmente, gasosos presso normal e

so

Com a adio de cossolventes,

temperatura ambiente. Isso significa, que, aps a extrao, eles podem ser facilmente eliminados de ambos, dos resduos de extrao e dos produtos extrados e recuperados;

permite-se a extrao diferencial de solutos no polares at solutos de polaridade alta;

No permanece solvente residual

nos extratos obtidos por fluido supercrtico e a adio de cossolventes orgnicos aumenta a solubilidade do material a ser extrado;

A maioria dos gases utilizados so

fisiologicamente seguros e inertes;

Com muitos gases, a separao de

Outra vantagem que o gs

materiais feita a baixas temperaturas, o que extremamente importante quando se extraem substncias naturais;

carbnico um material inerte, no inflamvel e, como solvente, depois da gua, o de menor custo;

As

propriedades comprimidos

solventes podem

dos ser

Os solventes podem ser reusados, o que significa um baixo custo operacional. [011] A anlise de pesticidas tem

gases

grandemente variadas, tanto pelo ajuste apropriado da temperatura e da presso quanto pela introduo de agentes aditivos que mudem a polaridade dos gases. Em adio, pela alterao gradual da devido

recebido grande ateno recentemente, ao impacto ambiental e

necessidade de monitorar traos de seus metablitos em amostras complexas de alimentos. Geralmente a cromatografia gasosa escolhida como o mtodo analtico, devido a sua alta sensibilidade e disponibilidade de detectores seletivos

temperatura e da presso, podem ser feitas extraes multifase e fracionamento do extrato, nos produtos desejados;

(fotomtrico de chama, nitrognio-fsforo e, principalmente, o detector por captura de eltrons).

[13]

160,000.00 e processa somente 5,0 litros por vez. Uma unidade industrial no sai por menos de $ 1,000,000.00 e processa 450 litros de cada vez. Assim, produtos de

6.0 Desvantagens

baixo valor agregado e baixo rendimento no podem ser economicamente extrados

O processo torna-se caro devido ao custo dos equipamentos. A unidade de teste (Figura 4), pertencente White Martins S.A., tem um custo estimado em $

por esse processo. Ainda, compostos muito polares, dificilmente sero extrados sem a adio de um cossolvente adequado. [11]

Figura 10 - Aparelho de extrao por fluido supercrtico ES-204. 7.0 Perspectivas Futuras As perspectivas do emprego da extrao supercrtica relacionadas com os resultados das pesquisas em

possibilidades que o processo oferece, sobre sua viabilidade econmica,

disseminao dos atuais conhecimentos sobre o assunto, escolha das matriasprimas mais adequadas, necessidade de obter produtos isentos de solventes

desenvolvimento do maior conscincia aos demais profissionais da rea sobre as

orgnicos, as restries cada vez mais

presentes ao uso dos solventes orgnicos txicos, necessidade de fracionamentos de leos essenciais sem quebra de molculas e obteno de produtos idnticos aos

observao e assimilao dos principais fatores que influenciam uma anlise

quantitativa na cromatografia gasosa e as diferenas entre as calibraes, os erros que podem ocorrer, e os procedimentos necessrios para minimiz-los atravs do uso de padro interno. Este trabalho de modo geral tratou de diferentes processos cromatogrficos, fases que podem ser utilizadas para e realizar os tcnicas tipos de

existentes na natureza, so adequadas para a indstria alimentcia, cosmtica e farmacutica. [11] O nmero de aplicaes potenciais da extrao por fluidos supercrticos, continua a crescer em todo o mundo. Pelo que se verifica, sua aplicao j uma realidade, em parte impulsionada pela demanda crescente de produtos de alta qualidade e da globalizao da economia, tambm no comrcio de insumos

cromatogrficas cromatografia.

Os resultados e discusses dos trabalhos analisados gasosa deram por nfase ser a

cromatografia

muito

farmacuticos, alimentcios, qumicos e cosmticos e principalmente, pela

utilizada e ser apropriada para alcanar os resultados desejados. A menos utilizada de todas cromatografia com fluido

seletividade, facilidade e capacidade de separao e fracionamento que oferece para um grande nmero de compostos orgnicos, muitas vezes impossveis de extrair pelos processos tradicionais e aqueles cuja purificao torna-se por demais onerosa, necessitando de colunas de alta resoluo, nem sempre disponveis no mercado nacional.
[11]

supercrtico (SFC), principalmente devido ao alto custo dos equipamentos. O

surgimento da SFC ainda tmido, todavia ele inegvel. A indstria farmacutica est sendo sua principal promotora por ter encontrado nesse mtodo cromatogrfico uma ferramenta analtica particularmente apropriada para seus compostos de

interesse. Compostos farmacuticos so, 8.0 Consideraes Finais A partir dos experimentos em sua grande maioria, ou compostos termicamente volatilidade instveis, ou ou de baixa quirais.

propostos foi possvel proporcionar uma

compostos

9.0 -Referncias Bibliogrficas [1] Cromatografia. Disponvel em: <http://pt.scribd.com/doc/36702724/Croma tografia>. Acesso em 18 de Julho de 2011. [6] Cromatgrafo. Disponvel em: < [2] Detectores de Cromatografia em: http://pt.scribd.com/doc/36702414/Cromat ografia-Gasosa-Acoplada-aEspectrometro-de-Massas>. Acesso em 15 de Agosto de 2011.

(CG/DCE). Revista Qumica Nova, Vol. 33, n 1, 2010.

Gasosa.

Disponvel

<http://www.pucrs.br/quimica/professores/ arigony/cromatografia_FINAL/detectores_ cg.htm> Acesso em 15 de Agosto de 2011.

[7] - CARRILHO, E.; TAVARES, M. C. [3] LIGIERO, C. B. P.; REIS, L. A. dos; PARRILHA, G. L.; BAPTISTA FILHO, M.; CANELA, M. C. Comparao Entre Mtodos de Quantificao em H.; LANAS, F. M. Fluidos Supercrticos em Qumica Analtica. II. Cromatografia com Fluido Supercrtico: Instrumentao. Revista Qumica Nova. Vol. 26, n 5, 2003. [8] Injeo. Disponvel em: <http://www.ebah.com.br/content/ABAAA [4] TAPPIN, M. R. R.; PEREIRA, J. F. G.; Lima, L. A.; SIANI, A. C. Anlise Qumica Quantitativa Para a Padronizao do leo de Copaba por Cromatografia em Fase Gasosa de Alta Resoluo. Revista Qumica Nova, Vol. 27, n 2, , 2004. [5] SILVA, J. R. da; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I. Otimizao e Validao Intralaboratorial de Mtodo Para Anlise de Resduos de Cloranfenicol em Leite Caprino por Cromatografia Gasosa com Deteco Por Captura de Eltrons [010] Detectores. Disponvel em: <http://www.catalao.ufg.br/siscomp/sis_pr of/admin/files/lucianamelo71/data03-072009-horas10-34-57.pdf>. Acesso em 15 de Agosto de 2011. AZesAB/cromatografia-gasosa>. em 15 de agosto de 2011. [09] - Detector por Ionizao de Chama. Disponvel em: <http://hiq.lindeAcesso

Cromatografia Gasosa: Um Experimento Para Cursos de Qumica. Revista Qumica Nova. Vol. 32, n 5, 2009.

gas.com.br/international/web/lg/br/like35lg spgbr.nsf/docbyalias/anal_gaschrom>. Acesso em 15 de Agosto de 2011.

[11] Fluidos supercrticos: situao atual e futuro da extrao supercrtica. Disponvel em:

com Fluido Supercrtico: Instrumentao. Revista Qumica Nova. Vol. 26, n 5, 2003.

<http://www.biotecnologia.com.br/revista/ bio11/fluidos.pdf>. Acesso em 31 de Julho de 2011. [13] - CARRILHO, E.; TAVARES, M. C. H.; LANAS, F. M. Fluidos Supercrticos em Qumica Analtica. III. Cromatografia [12] - CARRILHO, E.; TAVARES, M. C. H.; LANAS, F. M. Fluidos Supercrticos em Qumica Analtica. II. Cromatografia com Fluido Supercrtico: Aplicaes.

Revista Qumica Nova. Vol. 29, No. 4, 2006.