Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

Princípio do método: A cromatografia é um processo analítico para separação de

substâncias em mistura, com base nas diferentes velocidades de migração dessas
substâncias em razão das afinidades relativas por duas fases: a fase móvel (líquida ou gás)
e a fase estacionária ou fixa (sólido ou líquido). Os métodos cromatográficos podem ser
empregados para identificação qualitativa e determinação quantitativa de espécies
separadas.
A separação cromatográfica é o resultado de interações específicas entre as moléculas da
amostra e as fases móvel e estacionária.

Considerando o estado físico da fase móvel, tem-se a cromatografia à líquido, onde a fase
móvel é um líquido.

E a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), onde se usam colunas metálicas e

pressões de fase móvel elevadas, obtidas com auxílio de uma bomba de alta pressão.
A CLAE envolve um sistema onde a fase estacionária, seja uma superfície sólida, líquida,
uma resina de troca iônica ou um polímero poroso, está retida em uma coluna e a fase
móvel é forçada através da mesma sob altas pressões. Os três mecanismos mais usados
para realizar a CLAE são: por troca iônica, por partição e por adsorção.

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A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), agora conhecida apenas como
Cromatografia Líquida (CL), é uma das mais utilizadas de todas as técnicas de separação.
Consiste em uma técnica onde existem duas fases, a fase móvel que é a passagem de uma
solução e a fase estacionária que se constitui com partículas pequenas. O soluto é atraído
por essas partículas (fase estacionária) e viajam vagarosamente pela coluna

Vantagens
As vantagens da CLAE são: -Alta resolução na separação; -Alta precisão nas análises
quantitativas; -Boa sensibilidade; -Versatilidade, pode ser aplicada tanto para compostos
orgânicos como inorgânicos; -Alta reprodutibilidade;

Desvantagens
Dentre as limitações pode-se citar: -Alto custo da instrumentação; -Grande volume de fase
móvel descartada;
Entretanto é um método com custo elevado, pois é necessário a utilização de uma coluna
com recheio de tamanhos de 3 a 10 µm, além da alta pressão necessária na análise, possui
um custo elevado por ser um método mais complexo se comparado com outras análises.
Espectrofotometria derivada no ultravioleta (UVD)

Envolve a medida da quantidade de radiação ultravioleta ou radiação visível (UV-VIS)

absorvida pela substância em solução.
A espectrofotometria baseia-se na medida de transmitância ou absorbância de uma
radiação monocromática que atravessa uma solução contendo uma substância absorvente
e na relação entre estas medidas e a concentração da espécie absorvente. Essa energia
absorvida pela substância em análise provoca a excitação dos elétrons do seu estado
fundamental ou normal a estados de maior energia ou estado excitado, fenômeno
conhecido como transição eletrônica.
As variáveis que influenciam o espectro de absorção de uma substância incluem o pH da
solução, a temperatura, a natureza do solvente empregado, a concentração de eletrólitos e
os componentes da amostra.

Os métodos espectrofotométricos se baseiam na capacidade das substâncias de absorver

radiação eletromagnética na região do ultravioleta ou visível (BROWN et al., 2005;
SPÍNOLA, 2011). São comuns os procedimentos para a determinação da vitamina que têm
seu princípio a partir do caráter redutor do composto. Frequentemente utilizam-se
indicadores do tipo redox, como metais, ou cromóforos.

Métodos espectrofotométricos, assim como titulométricos, apresentam praticidade, rapidez,

simplicidade e possuem baixo custo, não necessitando equipamentos e reagentes
sofisticados.

UV Spectrophotometry is mostly used to determine ascorbic acid because it is simple

method, and Vitamin C is able to absorb UV rays. The method is suitable for use with
vitamin C tablets, fresh or packaged fruit juices and solid fruits and vegetables.