Técnicas usadas em metabolômica

Técnicas usadas em metabolômica

Nas outras ciências “ômicas”, como por exemplo, na genômica, na transcriptômica

e na proteômica existe um procedimento padrão para seus estudos, uma vez que,
essas ciências analisam moléculas relativamente uniformes, tanto em sua
estrutura quanto em suas propriedades físicas e químicas.

O mesmo não acontece na metabolômica. Como vimos, essa ciência estuda uma
ampla gama de compostos diferentes com grande variedade de propriedades
físicas e químicas. O que torna evidente a não utilização de um procedimento
padrão em suas análises.
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O objetivo em um estudo de metabolômica é verificar e identificar as diferenças

qualitativas e/ou quantitativas de metabólitos entre gurupos de amostras. Assim
como, investigar a influência de fatores ambientais, ou a influência da introdução
de novos genes no metabolismo de um organismo.

O objetivo final em um estudo de metabolômica sempre é identificar as diferenças

moleculares e identificar o maior número de compostos responseveis por estas
diferenças utilizando um mínimo de investimento de mão de obra, de tempo e
custo.
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Para isso, primeiramente, é preciso obter impressões digitais metabólicas, as quais

podem ser obtidas, tanto pelas técnicas cromatográficas quanto pelas técnicas
espectroscópicas.

Os fatores importantes para a escolha da técnica mais adequada são: a quantidade de

compostos a ser analisado, a reprodutibilidade da técnica, a linearidade da resposta
quantitaviva e a facilidade da preparação das amostras.

Todo o método cromatográfico tem como objetivo separar compostos contidos em uma
amostra. Compostos de uma mistura são separados de acordo com a afinidade com as
fases (fase estacionária e a fase móvel).
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O método de detecção determina se um composto é detectado e com qual

sensibilidade. Cada pico no cromatograma corresponde com um composto, e a
quantidade do composto é refletida na intensidade do pico.

Para a análise de compostos individuais o fator de resposta deve ser conhecido

ou determinado, assim como, são comuns grandes diferenças na resposta.
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Cromatografia Gasosa

É utilizada para analisar compostos apolares e de baixo peso molecular, ou seja,

compostos voláteis que apresentam ponto de ebulição até 350 graus célsius.

Também é usada para analisar compostos que possam produzir derivados voláteis
e compostos termicamente estáveis nas condições de trabalho.
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Cromatografia Líquida

É utilizada para analisar compostos mais polares e de maior peso molecular. Ou

compostos que não possam ser analisados pela cromatografia gasosa devido às
altas temperaturas utilizadas durante a corrida.

Dentre as técnicas de cromatografia líquida, destaca-se a cromatografia líquida

de alta eficiência também conhecida como HPLC. Essa técnica faz parte do grupo
da cromatografia por coluna e é utilizada em amostras como alimentos, solo,
sangue, urina, etc.
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Fonte: https://ceatox.ibb.unesp.br/padrao.php?id=15
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Cromatografia Líquida

Essa técnica tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma

grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de
tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade.

Entretanto o sucesso dessa separação cromatográfica só é possível se for aplicada uma

fase móvel (FM) correta a uma fase estacionária (FE) conveniente.
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Cromatografia Líquida

A fase estacionária é a parte fixa e o eluente é a parte móvel (fase móvel), sendo que a diferença
de polaridade dos componentes da amostra, proporcionarão a estes constituintes interações
diferentes com a fase estacionária e a fase móvel.

A fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é

atravessada pela fase móvel que é liquida. São as forças físicas e químicas que atuam entre os
solutos e as duas fases que são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna
cromatográfica. A diferença dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos
solutos individuais.

Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. Os sólidos normalmente
são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão ativo, etc., que se encontram “empacotadas”
em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel.
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Cromatografia Líquida

Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo,

metanol, acetonitrila e água, sendo que essa mistura é denominada de eluente.
Normalmente para a fase móvel existem alguns critérios quanto aos solventes,
tais como: grau de pureza dos solvents, baixa viscosidade, dissolução da amostra
sem perca dos compostos e polaridade adequada para a realização da separação
dos componentes da amostra.
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Cromatografia Líquida

Fonte: https://Freitag.com.br/blog/o-que-e-a-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia
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Cromatografia Líquida

As subtâncias com maior afinidade com a fase estacionária movem-se mais lentamente e
as substâncias com pouca afinidade com a fase estacionária movem-se mais rapidamente.

Ao sair da coluna cromatográfica, os componente passam por um detector, o quale mite

um sinal elétrico que é registrado em um computador e forma um cromatograma.
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Cromatografia Líquida

Fonte: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2015/04/hplc-cromatografia-liquida-de-alta.html
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Cromatografia Líquida

A cromatografia líquida é o segundo método cromatográfico frequentemente

acoplado ao espectrômetro de massa.

Um dos métodos mais utilizados na espectrometria de massa é o MALD-TOF.

A sigla MALDI-TOF significa Matrix Associated Laser Desorption-Ionization – Time of

Flight.

Seu inventor, o pesquisador japonês Koichi Tanaka, da Shimadzu Corporation, um

prêmio Nobel de química, em 2002.
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Material é colocado em uma placa com matriz e bombardeado com um laser que
o evapora, em seguida, um sistema ioniza e aspira o material volatilizado, o qual
chega à detectores que registram o tempo que a substância chega ate o detector
e a sua quantidade. Essa técnica baseada em conceitos proteômicos, capaz de
fornecer resultados altamente precisos em poucos minutos.

Isso é colocado em um gráfico, gerando vários picos, onde cada amostra

apresenta um gráfico específico. Uma base de dados de computadores interpreta
o gráfico gerado e fornece o resultado.
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Diferentemente da cromatografia gasosa e da cromatografia líquida fornece

espectros que refletem as quantidades exatas dos compostos visíveis. Seu
espectro contém o somatório de todos os espectros dos componentes individuais.
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