INSTITUTO FEDERAL DO CEARÁ

CAMPUS QUIXADÁ

Instituto Federal de Ciências e Tecnologia do Ceará – Campus Quixadá

Departamento de Ensino
Licenciatura em Química
Laboratório de Química Orgânica
Samuel Pedro Dantas Marques

Relatório Nº 06
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

Prática realizada em:

26 de novembro de 2019.

Francisco Dânio Cornélio Ribeiro

QUIXADÁ - CE
10 de dezembro de 2019
 FRANCISCO DÂNIO CORNÉLIO RIBEIRO

RELATÓRIO Nº 06
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

Relatório de aula prática relacionado à

área de Química Orgânica, tendo como
docente o professor Dr. Samuel Pedro,
que exerce a prática do magistério no
Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Ceará - IFCE - campus de
Quixadá, elaborado durante a disciplina
de Laboratório de Química Orgânica,
ministrada pelo docente já mencionado,
no intuito de obter aprovação e aquisição
dos conhecimentos abordados na mesma.

QUIXADÁ - CE
10 de dezembro de 2019
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1 INTRODUÇÃO
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos tipos mais aplicados e
largamente utilizados no que diz respeito aos processos cromatográficos por eluição
de diferentes constituintes estruturais das mais diversas amostras estudadas em
análises laboratoriais. Tal processo metodológico é empregado por diversos cientistas
em suas análises para promover a separação e a determinação de muitas espécies
químicas no que diz respeito à uma gama de compostos orgânicos e inorgânicos, por
exemplo. Na técnica de cromatografia líquida, têm-se que a fase móvel é um solvente
cujo estado de agregação encontra-se na forma líquida, sendo que tal solvente
contém a espécie química a ser estudada sob forma de uma mistura de solutos
(SKOOG et al., 2006).
O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é rotineiramente escolhido tendo
em vista o processo de divisão ou segundo o tipo de fase estacionária empregada
nesse sentido. Estes incluem partição ou cromatografia líquido-líquido; adsorção
ou cromatografia líquido-sólido; troca iônica ou cromatografia de íons;
cromatografia por exclusão; cromatografia por afinidade; e cromatografia quiral
(SKOOG et al., 2006).
O método mais amplamente utilizado no que diz respeito à introdução da amostra
em cromatografia líquida encontra fundamentação básica em um sistema que consiste
numa alça de amostragem. Esses dispositivos são partes integradas de alguns
equipamentos de cromatografia líquida. Constantemente essas alças intercambiáveis
estão acessíveis para permitir a opção do volume da amostra de 5 a 500 (SKOOG et
al., 2006).
Antigamente, a técnica de cromatografia líquida consistia em colunas de
constituídas de vidro com diâmetros internos que variavam de cerca de 10 até 50 mm.
As colunas eram recheadas com partículas sólidas recobertas com um líquido
adsorvido, líquido esse que compunham a chamada fase estacionária. Para aferir
vazões significativas através desse tipo de fase estacionária, o tamanho das partículas
sólidas era mantido acima de 150 a 200 μm; mesmo assim, as vazões eram de poucos
décimos de mililitro por minuto, na melhor das hipóteses. Atualmente, os processos
de leitura e análise das amostras neste tipo de cromatografia fazem uso de pressão
significativas, velocidades consideráveis e recheios de partículas muito pequenas
(SKOOG et al., 2006).
No que se refere ao tipo de sistema de eluição com um único solvente ou com uma
mistura de solventes de composição constante é isocrática.
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De acordo com SKOOG et al., 2006, p. 927:

Na eluição por gradiente, dois (e às vezes mais) sistemas

solventes que diferem significativamente em polaridade são
empregados. Assim: uma eluição isocrática em CLAE é aquela na
qual a composição do solvente permanece constante. Uma eluição
por gradiente em CLAE é aquela na qual a composição do solvente
é alterada continuamente ou em uma série de etapas.

2 OBJETIVOS
- Compreender o princípio de funcionamento básico de um aparelho de cromatografia
de alta eficiência (CLAE);
- Observar os dados de leitura dos extratos de alguns constituintes de uma variedade
de lúpulo por meio do uso do aparelho de cromatografia.

3 DESCRIÇÃO

A Prática realizada consistiu na abordagem dos objetivos acima descritos. Na

referida aula houve ênfase em um processo descritivo, onde o professor demonstrou
não apenas o princípio básico de funcionamento de um cromatógrafo líquido de alta
performance (ou alta eficiência), mas também abordou outras diversas temáticas
relacionadas, tais como algumas partes que compõem o conjunto de peças que
envolvem o referido equipamento laboratorial e a parte de manipulação do software
utilizado nas leituras do distintos tipos de amostras empregadas nos ensaios
desenvolvidos no laboratório de pesquisa do campus de Quixadá do Instituto Federal
do Ceará – IFCE.

De início, o aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência foi visualizado,

sendo apresentado e observado alguns de seus aspectos estruturais. Foi mostrado o
princípio de funcionamento do aparelho, onde houve a demonstração de como deve-
se ligar o cromatógrafo. O aparelho é iniciado por meio do uso de 3 (três) botões, os
quais apresentam cada um uma função de inicialização do aparelho: um liga o sistema
de bombas, o outro atua no acionamento do injetor e o último que aciona o sistema
geral. A seguir pode ser observada a imagem de um HPLC (ou CLAE):
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Imagem 1 – Aspecto visual de um aparelho de cromatografia líquida de alta performance.

Fonte: Autor, 2019.

Como pode ser observado na imagem acima, o aparelho de cromatografia

líquida apresenta um sistema de equipamento que consiste em um conjunto de
entradas para adição dos diferentes tipos de amostras em sua parte superior com um
sistema de solventes para a realização dos processos experimentais de leitura das
amostras.
Os frascos de vidro que contêm os respectivos tipos de solventes são
conectadas por meio de um tipo específico de microfiltro cuja funcionalidade básica é
impossibilitar ao máximo a chegada de materiais de caráter sólido que possam causar
danos ao HPLC. O equipamento também apresenta uma espécie de bandeja preta,
na qual são inseridas as diferentes amostras e a qual consiste numa divisão de 5
(cinco) partes identificadas pelas as letras A, B, C, D e E, sendo que cada parte podem
ser inseridas cerca de 40 amostras, a depender do tipo de equipamento. Existem
componentes do HPLC que são denominados como vials, frascos de vidro com
capacidade de 20 μL, no qual são colocadas as amostras para a realização das
respectivas leituras. A imagem abaixo mostra a parte do equipamento onde são
inseridos os vials:
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Imagem 2 – Aspecto visual do local onde são inseridos os vials.

Fonte: Autor, 2019.

No que se refere à parte inferior do aparelho de cromatografia estudado na

presente prática, pode ser visualizada uma seringa que encontra-se conectada ao
HPLC. A função desta seringa é retirar possíveis materiais gasosos que podem
prejudicar o funcionamento do equipamento utilizado. Também há uma bomba e um
suporte (um tipo de braço) mecânico responsáveis pelo bombeamento e distribuição
da fase móvel e da amostra pela coluna cromatográfica do equipamento. É usada uma
coluna do tipo fase reversa (apolar) constituída por hidrocarbonetos, isso faz com que
haja uma maior interação de amostras apolares com a coluna, aumentando os seus
respectivos tempo de retenção destas, enquanto espécies químicas polares eluem de
maneira mais rápida neste tipo de coluna.
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Imagem 3 – Aspecto visual da parte inferior do aparelho de cromatografia, onde são

inseridas as seringas.

Fonte: Autor, 2019.

O aparelho é conectado a um computador e um software, onde há

transmissão das respectivas informações observadas em cada análise. O software
presente no equipamento permite que seja traçado um gráfico com cada conjunto de
cromatogramas observados por meio da leitura de cada mistura, sendo que cada pico
esboçado pelo programa diz respeito a uma substância diferente. A intensidade de
cada pico é dependente da ordem de concentração de cada constituinte da amostra
analisada, da pressão, do fluxo, etc.
O programa gera um conjunto de dados sob forma de tabela que permitem
gerar uma curva de calibração com os respectivos valores de área no eixo Y e os
valores das concentrações no eixo X.
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Imagem 3 – Exemplo de cromatograma gerado por meio de uma leitura realizada no

aparelho.

Fonte: Autor, 2019.

Como previamente mencionado, o cromatograma permite a geração de um

gráfico contendo os picos de cada constituinte que compõem a mistura analisada. De
acordo com a constituição do sistema observado, há uma diferenciação no próprio
aparelho, no que se refere aos diferentes componentes, onde cada um é representado
por um pico correspondente. De acordo com a imagem acima, existem substâncias
cujo tempo de retenção é maior do que o observado em outros constituintes,
significando dizer que estas (de maior tempo de retenção) interagem mais
efetivamente com a coluna que é apolar.

4 REFERÊNCIA(S)

SKOOG, D.; WEST; HOLLER; CROUCH. Fundamentos de Química Analítica.

Tradução da 8ª Edição norte-americana. São Paulo: Thomson, 2006. p. 924, 925 e
927.