UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

CERTIFICADO DE CALIBRAÇÃO: RELATÓRIO BASEADO NA

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DE CALIBRAÇÃO

GOIÂNIA
2020
 NOME – R.A

CERTIFICADO DE CALIBRAÇÃO: RELATÓRIO BASEADO NA

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DE CALIBRAÇÃO

Trabalho apresentado à matéria de Atividades

Práticas Supervisionadas (APS), obrigatória do 3º
semestre do curso de graduação em Farmácia da
Universidade Paulista - UNIP, campus Flamboyant.

ORIENTADOR: PROF. DR. _________________

GOIÂNIA
2020
 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 3

Citometria de Fluxo ..................................................................................................... 4

Visão geral ............................................................................................................... 4

Calibração ................................................................................................................... 4

Calibração e Controle Biológico ............................................................................... 4

Grânulos de Calibração ........................................................................................... 5

Alinhamento óptico................................................................................................... 6

Calibração da dispersão da luz ................................................................................ 7

Padronização da fluorescência ................................................................................ 7

Outros fatores que influenciam na calibração .......................................................... 8

Conclusão ................................................................................................................... 8

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 8
 3

INTRODUÇÃO

A citometria de fluxo (CF) é utilizada para estudo morfológico, fenotípico e

funcional de células através da detecção da dispersão da luz e da fluorescência
emitida por moléculas, conhecidas como fluorocromos, ligadas às mesmas. A CF é
utilizada, geralmente, na área de imunologia, sendo aplicada em estudos de avaliação
funcional e para diferenciar populações celulares, conteúdo de DNA, RNA, atividades
enzimáticas, produção de íons, citotoxicidade, distribuição populacional, produção de
citocinas, entre outros (CUNHA et al., 2012).
A molécula ou função a ser avaliada deve ser marcada com anticorpos
monoclonais acoplados aos fluorocromos. Os fluorocromos são excitados por
radiação laser, que intercepta as células, emitindo um comprimento de onda que é
detectado por um sensor, chamado de tubo fotomultiplicador. Estes sensores
convertem a luz captada em sinais eletrônicos, enviando ao computador,
possibilitando uma análise multiparamétrica dos resultados através de representações
gráficas de intensidade de fluorescência (NAKAGE et al., 2005).
Na RDC Nº 302, de 13 de outubro de 2005, que dispõe sobre regulamento
técnico para funcionamento de laboratórios clínicos, traz a definição de calibração,
que é um conjunto de operações que estabelece a correspondência entre valores
indicados por um instrumento, sistema de medição ou material de referência, e os
valores correspondentes estabelecidos por padrões. A calibração dos equipamentos
deve ser feito em intervalos regulares, conforme a utilização dos mesmos, e deve se
manter os registros destas verificações (ANVISA, 2005).
A padronização, controle e calibração fornecem diferentes graus de certeza
sobre dados adquiridos com um instrumento. Cada processo é necessário para
garantir que os resultados do instrumento tenham a qualidade exigida para sua
finalidade. Os processos de calibração garantem com que os resultados variam
apenas dentro de certos limites (WANG; HOFFMAN, 2017). O citômetro de fluxo é um
instrumento altamente complexo, que deve ser calibrado rotineiramente para que os
resultados sejam precisos. Estes fatores demonstram a importância da calibração, por
que afeta os resultados de exame, que podem ser decisivos em certos casos, como,
por exemplo, para o estabelecimento de tratamento de alguma patologia.
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Citometria de Fluxo

Visão geral

A citometria de fluxo (CF) é uma tecnologia que avalia rapidamente células ou

partículas únicas quando estas passam por um ou vários lasers, enquanto estão
suspensas em uma solução à base de sal tamponada. As partículas são analisadas
quanto à dispersão da luz visível e parâmetros de fluorescência. A dispersão da luz
visível é medida em duas direções: direção direta (dispersão direta ou FSC – Forward
Scatter), que pode indicar o tamanho relativo da célula, e a direção a 90º (dispersão
lateral ou SSC – Side Scatter), que indica a complexidade ou granularidade interna da
célula. A CF é uma ferramenta poderosa, tendo aplicações em várias disciplinas,
como imunologia, virologia, biologia molecular, biologia do câncer e monitoramento
de doenças infecciosas (MCKINNON, 2018).
A CF tem uma ampla utilização, sendo utilizada na análise de vesículas
extracelulares (NOLAN; JONES, 2017), na espermatologia (ORTEGA-FERRUSOLA
et al., 2017), análise de células-tronco cancerígenas (GREVE et al., 2012), podendo
ser utilizada até mesmo para auxiliar o diagnóstico do linfoma de Hodgkin (GREWAL
et al., 2019). Por sua grande viabilidade de utilização, é importantíssimo que os seus
resultados sejam corretos. Neste sentido, o sucesso da citometria de fluxo depende
de forma crítica da calibração do instrumento e da avaliação rotineira para garantir
que os resultados sejam sempre exatos e precisos (CHATTOPADHYAY;
ROEDERER, 2012).

Calibração

Calibração e Controle Biológico

A padronização e a normalização de experimentos de citometria de fluxo são

baseados em dois componentes principais: procedimento de coloração (controle) e o
instrumento CF (calibrador). A definição de controle é um material estável, que fornece
resultados reproduzíveis em cada análise. A amostra de controle é preparada,
geralmente, da mesma forma que a amostra teste, produzindo um resultado esperado.
O calibrador é uma amostra preparada de partículas que tem valor conhecido das
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características escolhidas, sendo usadas para ajustar o CF, determinando com

precisão a quantidade de florescência de uma amostra específica (CALVELLI et al.,
1993).
O agente de referência e normalizador ideal para cada experimento é o uso
de controle biológico, que serve como controle de qualidade e valor de normalização
para o processo de coloração, anticorpos e citômetro de fluxo de uma vez só. Neste
método, o controle biológico é analisado com as amostras de teste utilizando o mesmo
processo. Para isso, muitos laboratórios utilizam amostra de sangue fresco de
doadores saudáveis, porém à falta de disponibilidade desses tipos de amostras,
juntamente com diferenças fisiológicas entre os vários doadores saudáveis, fornece
apenas uma solução parcial (MAHER; FLETCHER, 2005; WOOD et al., 2013).
O sistema de calibração deve ter base em vários parâmetros, como
alinhamento do filtro óptico, verificação da potência do laser, linearidade de tensão
dos tubos fotomultiplicadores, entre outros, além de ser monitorado rotineiramente por
ter grande impacto na validade dos resultados. O imenso grupo de diferentes
combinações de disponibilidade de fluorocromos permite a utilização de diversos
marcadores. Porém, o uso de vários fluorocromos aumenta o risco de sobreposição
espectral, onde um fluorocromos específico é detectado em mais de um canal
fluorescente, o que pode levar a leituras falso-negativas. Configurações abaixo do
ideal também podem ser prejudiciais, resultando em interpretação incorreta dos dados
ou valores distorcidos. Para tal, é necessário uma compensação adequada,
subtraindo a sobreposição espectral e realização de configurações adequadas para
que os resultados sejam precisos (MIZRAHI et al., 2018).

Grânulos de Calibração

Os citômetros são aparelhos complexos, sendo compostos por diversos

componentes eletrônicos, ópticos e mecânicos. Mesmo dois aparelhos construídos da
mesma maneira não são idênticos, fornecendo resultados com uma margem de
diferença utilizando a mesma amostra (MCLAUGHLIN et al., 2008a; MCLAUGHLIN et
al., 2008b). Os efeitos do envelhecimento e a perda de transparência óptica
acontecem no aparelho, prejudicando os resultados. Por isso os instrumentos devem
ser sistematicamente calibrados, por que os resultados obtidos desses aparelhos
após a calibração podem ser comparados de maneira objetiva e quantitativa com
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outros laboratórios, sendo essenciais para análises clínicas e para verificar a

conformidade com as boas práticas de laboratório (LAPPIN; BLACK, 2003; WANG et
al., 2008).
A utilização de esferas de calibração, como as esferas Rainbow (Sperotech),
pode melhorar a estabilidade dos resultados. Essas esferas são partículas rotuladas
com uma mistura de fluorocromos em níveis diferentes de intensidade fluorescente.
As esferas podem ser usadas em diversas calibrações de CF, desde o controle de
qualidade do desempenho até a estabilidade do laser, conforme recomendado pela
EuroFlow, o Conselho Internacional para Padronização de Hematologia (ICSH – ou
International Clinical Cytometry Society) e a Sociedade Clínica Internacional da
Citometria (ICCS – ou International Clinical Cytometry Society) (MITTAG; TÁRNOK,
2009; KALINA et al., 2012).
A CF pode ser usada para quantificar a intensidade mediana de Fluorescência
(IMF). Quando obtida, a IMF se correlaciona com o número de anticorpos que
reconhecem e se ligam de acordo com os antígenos celulares, permitindo a
quantificação exata da expressão do antígeno por célula (MITTAG; TÁRNOK, 2009).
A IMF de destino é definida antes de cada experimento, garantindo que a leitura seja
feita nas configurações corretas e padronizada. Em alguns citômetros de fluxo da nova
geração, o processo de calibração automatizado é integrado ao instrumento,
permitindo a calibração precisa em dias diferentes e até em vários citômetros do
mesmo modelo (MIZRAHI et al., 2018).
A intensidade do laser tende a mudar ao longo do dia, inclusive durante a
aquisição de dados, principalmente quando a quantidade de amostras analisadas for
grande. Então as esferas Rainbow, juntamente com as amostras e a confirmação da
estabilidade da IMF alvo, garantem que nenhum desvio nos resultados aconteça
devido ao mau desempenho do CF (MARSH et al., 2009; MIZRAHI et al., 2018).

Alinhamento óptico

As esferas e células diferem em suas propriedades de dispersão da luz, com

isso elas podem ser misturadas com a amostra biológica e distinguidas durante a
análise. A adição de esferas a uma suspensão de células pode ser usada para
contagem absoluta de células, podendo servir também como controle interno para
verificação do desempenho da medição e detecção. Além da calibração da faixa de
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medição, o alinhamento óptico é um ponto crucial em instrumentos com mais de uma

fonte de excitação, sendo necessária sua inclusão para calibração e controle de
qualidade. Os lasers devem ser alinhados de modo a obter resultados corretos e
informações de fluorescência correspondentes de células duplamente coradas. Para
isso, esferas de dispersão e fluorescência uniformes podem ser usadas, além de que
o alinhamento deve ser feito por especialistas (suporte técnico) (MITTAG; TÁRNOK,
2009).

Calibração da dispersão da luz

A dispersão da luz também deve ser calibrada quando comparado à escala

de fluorescência. O sinal de dispersão tem difícil padronização por conta da
dependência do ângulo de dispersão da luz medido e das propriedades geométricas
do sistema óptico. Embora haja dificuldade no ajuste da dispersão da luz entre dois
tipos diferentes de instrumentos, é possível quando feito em instrumentos de
construção idêntica, podendo ser utilizado para monitorar o desempenho relativo de
um instrumento. Para realizar a padronização da dispersão da luz deve-se medir as
intensidades relativa e absoluta da dispersão de duas partículas com tamanho
diferente. A calibração com partículas padrão de tamanho conhecido permitem uma
estimativa do tamanho da célula (MITTAG; TÁRNOK, 2009).

Padronização da fluorescência

Para se padronizar as intensidades de fluorescência, os valores de IMF são

convertidos em capacidade de ligação ao anticorpo (CLA), utilizando esferas com um
número definido de locais de ligação de anticorpos na superfície. As esferas são
tratadas da mesma maneira que as células e são coradas com os mesmos anticorpos.
Em condições de saturação, o brilho das esferas é diretamente correlacionado com o
número de moléculas de fluorescência por célula (BIKOUE et al., 1996; BIKOUE;
JANOSSY; BARNETT, 2002; MITTAG; TÁRNOK, 2009).
Outra possibilidade para padronizar a fluorescência é o uso de células em vez
de esferas, mas para isso as células devem ter número conhecido, além de serem
relativamente estáveis com relação aos antígenos de superfície. Antígenos como
CD45, CD3, CD4, entre outros (típicas de linfócitos humanos), são adequados para
esse tipo de padronização. Os antígenos de ativação não são adequados para essa
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padronização, por conta de que a expressão destas depende da atividade biológica

da célula. A marcação de células com anticorpos anti-CD apropriados, onde os
antígenos de uma amostra estão ligados aos respectivos anticorpos, permite se fazer
a correlação entre o brilho das células e o número de antígenos de superfície (BIKOUE
et al., 1996; HULTIN; MATUD; GIORGI, 1998; DAVIS et al., 1998).

Outros fatores que influenciam na calibração

Mesmo com instrumentos bem ajustados e calibrados ou um controle de

qualidade preciso não podem corrigir erros de preparações inadequadas, e boas
medições não podem garantir resultados corretos em casos onde a análise de dados
é feita incorretamente. Fatores que podem influenciar nos resultados obtidos são as
condições de armazenamento de amostras, anticorpos (tipo e concentração),
protocolos de medição, etc. Isso demonstra que a calibração do instrumento e a
padronização da fluorescência não são suficientes para evitar resultados errôneos.
Estabelecer e cumprir estritamente um protocolo padrão é essencial para o
monitoramento imunológico, medicina preditiva ou estudos multicêntricos (PRINCE;
ARENS, 1986; VALET; TÁRNOK, 2003; CURVERS et al., 2008).

Conclusão

A CF tem grande impacto na área da saúde, por ter inúmeras formas de

aplicar em análises. A padronização e calibração da citometria clínica devem ser de
prioridade nos laboratórios, por serem essenciais na garantia da qualidade e a
exatidão dos resultados. Para isso, é necessário o acompanhamento rotineiro,
procurando calibrar e ajustar não somente os equipamentos, mas também devendo
se atentar as condições de armazenamento de amostras, anticorpos utilizados,
protocolos de medição, análise dos resultados, entre outros, para estar em
conformidade com as boas práticas laboratoriais, garantindo assim a qualidade dos
resultados obtidos.

REFERÊNCIAS

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Sanitária, 2005.
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