1 Introdução À Bioquímica Clínica

DESCRIÇÃO
Princípios básicos do funcionamento do laboratório de bioquímica clínica e principais métodos

empregados para os exames bioquímicos.
PROPÓSITO
Compreender os processos pré-analíticos, analíticos e pós-analíticos – assim como o controle de
qualidade e os diferentes métodos empregados nas análises bioquímicas – é importante para entender
as funções, aplicações, vantagens e desvantagens dos métodos para garantir segurança e
confiabilidade nos resultados gerados e nos laudos liberados.
PREPARAÇÃO
Para este conteúdo, indicamos o uso de uma calculadora para acompanhar os exemplos e cálculos de
concentrações de substâncias, além de papel e caneta.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Analisar as etapas dos processos pré-analíticos, analíticos e pós-analíticos dos exames realizados, do
processo de controle de qualidade laboratorial, bem como os erros e suas respectivas causas
MÓDULO 2
Distinguir os diferentes métodos analíticos utilizados em bioquímica clínica, assim como a função e a
aplicabilidade dos métodos analíticos abordados na prática laboratorial
INTRODUÇÃO
Neste conteúdo vamos explorar o laboratório das análises clínicas com ênfase na bioquímica clínica,
setor de grande destaque no laboratório de análises clínicas. Estima-se que existam mais de 400 tipos
diferentes de exames realizados nesse departamento, abrangendo:
Exames simples e muito convencionais, como dosagem de sódio.
Exames de amostras “dinâmicas”, como teste de tolerância à glicose.
Exames mais complexos, como a identificação de metabólitos intermediários.
Teremos uma noção da grandeza do processamento das amostras e a importância do controle de

qualidade. Também precisamos contemplar, de maneira geral, a composição física dos laboratórios, pois
a todo momento surgem equipamentos mais modernos e automatizados; porém, se soubermos os
conceitos principais de física e química e os fundamentos e as noções básicas dos principais métodos
nos quais eles se baseiam, compreenderemos mais facilmente o funcionamento desses equipamentos e
será mais fácil operar as máquinas e seus sistemas e correlacionar as unidades e escalas utilizadas nos
resultados.
A maior parte dos testes bioquímicos pode ser dividida em dois grandes nichos:
O primeiro tem por base a utilização da luz, como nos métodos fotométricos, a partir dos quais as
reações são monitoradas pelo consumo dos substratos ou pela interferência dos produtos
formados.
O segundo se baseia na separação dos compostos de uma amostra devido à diferença de carga
elétrica e com influência do tamanho dos diferentes componentes a serem analisados, sendo muito
empregado para avaliação de proteínas e isoenzimas, como no método eletroforético.
Ao final do conteúdo, você conseguirá ter uma visão ampla do funcionamento de um laboratório e
poderá aplicar esse conhecimento ao longo dos seus estudos. Vamos começar?
MÓDULO 1
 Analisar as etapas dos processos pré-analíticos, analíticos e pós-analíticos dos exames

realizados, do processo de controle de qualidade laboratorial, bem como os erros e suas
respectivas causas
ETAPAS DO EXAME CLÍNICO

Os laboratórios de análises clínicas são divididos em setores específicos, de acordo com o tipo de
exame clínico que realizam. São eles:
 Fluxograma dos setores que compõem o laboratório de análises clínicas.

Independentemente do setor, é fundamental compreender quais são as etapas da realização de um
exame clínico. Com base nesse esquema, conseguimos ver de forma ampla o fluxo do processamento,
e se torna clara a necessidade de existência, aplicação e disseminação do controle de qualidade, a fim
de identificar e minimizar possíveis influências de fatores intrínsecos e extrínsecos nas diferentes
etapas. Além disso, com o controle de qualidade é possível verificar a exatidão e precisão dos testes
oferecidos, para se ter segurança e confiabilidade nos resultados gerados e nos laudos liberados.
A realização de um exame clínico é potencialmente sujeita a muitos erros ao longo do processo, e é de

suma importância que se consiga identificar e compreender os pontos mais passíveis de erro(s), a fim
de que possamos minimizar os efeitos. Para isso, categorizamos o processamento em três fases: pré-
analítica, analítica e pós-analítica.
PRÉ-ANALÍTICA, ANALÍTICA E PÓS-ANALÍTICA
Pré-analítica - Antes da análise ser realizada.
Analítica - Durante a realização do exame.
Pós-analítica - Fase que contempla o processamento dos dados e sua interpretação.
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.

 Etapas da realização de um exame clínico.
FASE PRÉ-ANALÍTICA
A fase pré-analítica é iniciada na consulta, começando na prescrição e nas orientações do médico

solicitante, passando pela entrevista e pelo preenchimento dos dados no laboratório, e depois pela
escolha do aparato correto para o procedimento. Finaliza-se na fase instrumental da realização do teste
solicitado, como mostrado no esquema a seguir:

 Fluxograma de fatores pré-analíticos.
Dentre os itens anteriores, podemos destacar alguns pontos que são de responsabilidade do profissional
que irá coletar a amostra. Clique para conhecê-los:
IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL
A identificação deverá ocorrer diante do paciente, ou os dados podem ser conferidos com o paciente
antes da coleta. Caso o material seja coletado e chegue ao setor de recepção de amostra em um tubo
sem identificação, ele deverá ser desprezado imediatamente.
LOCAL DE PUNÇÃO
Caso o paciente esteja internado com sonda parenteral, o acesso para coleta de material deverá ocorrer
no lado oposto. Além disso, precisa ser relatado se o sangue teve origem capilar, venosa ou arterial, pois
alguns parâmetros podem ter valores de referência diferentes.
TEMPO DE GARROTEAMENTO
O tempo ideal para manter o garroteamento no paciente é de aproximadamente 1 minuto. Não pode, em
hipótese alguma, garrotear o paciente antes de separar e identificar o material a ser utilizado, pois o
garroteamento prolongado pode trazer alterações aos resultados, como interferência na dosagem de
colesterol e triglicerídeos (pois são compostos grandes que ficam retidos no espaço intravascular).
USO ADEQUADO DO MATERIAL

A escolha dos tubos adequados, assim como a sequência de coleta, é de suma importância, pois os
aditivos presentes nos tubos anteriores podem contaminar os tubos seguintes. Também é importante
respeitar os volumes e as recomendações dos fabricantes.
Imagem: Shutterstock.com
 Sequência de tubos para coleta, segundo a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
 VOCÊ SABIA
Dependendo da conduta pré-analítica do profissional, a amostra poderá ser invalidada e desprezada.

Como, por exemplo, se:
A amostra estiver hemolisada ou coagulada.
O armazenamento e o transporte forem inadequados.
A amostra recebida estiver fora do prazo máximo para processamento.
A amostra estiver mal identificada.
A coleta for realizada no tubo errado.

Vale destacar que a amostra a ser coletada vai depender do estado do paciente e do exame solicitado.
Para os exames bioquímicos, podemos utilizar as amostras de sangue, urina, fezes, saliva, escarro,
LCR (líquido cefalorraquidiano), líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial (das articulações), entre
outros. No entanto, as amostras de sangue e de urina normalmente são as primeiras opções, devido à
facilidade da coleta e de processamento.
Agora que já sabemos em quais condições devemos rejeitar as amostras de sangue, como devemos
proceder com as outras amostras biológicas?
De maneira geral, os critérios são bem parecidos: falta de informação sobre a procedência, assim como
o dia e a hora em que a coleta foi realizada; embalagens inadequadas, com ou sem derramamento da
amostra; amostra não rotulada ou sem identificação; volume inadequado da amostra; amostra
incompatível com o exame solicitado.
Serão descartadas as amostras de urina coletadas há mais de 2 horas sem refrigeração; com presença
de fezes ou de corpos estranhos; e as amostras coletadas em recipientes diferentes do padronizado
para uso em laboratório.
As amostras de fezes serão rejeitadas caso venham contaminadas com urina; ou caso apresentem
corpos estranhos; em frascos inadequados.
 ATENÇÃO
Para entender melhor como deve ser o procedimento de coleta das amostras biológicas, quais são os
preparos necessários e outras informações relevantes, não deixe de ler o material Recomendações da
Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial: Coleta e preparo de amostras clínicas ,
presente no “Explore +”.
FASE ANALÍTICA
A fase analítica contempla basicamente a fase instrumental/experimental no laboratório, em que

devemos ter atenção com o uso de equipamentos e/ou kits e controle de qualidade de reagentes e
procedimentos. Diferentemente da fase pré-analítica, na fase analítica o foco é totalmente voltado para o
exame.
Com base nisso, a padronização de todos os processos envolvidos é de suma importância para se obter
e manter a qualidade dos testes realizados, pois, com todo processo padronizado, facilita-se a detecção
das fontes de erros, para que se possa tentar evitá-los e aprimorar a realização do exame sem
intercorrências, concomitante ao cumprimento de requisitos exigidos pela legislação.
Durante essa fase, conseguimos perceber o avanço tecnológico de automação nos laboratórios de
ponta; com isso, tem-se uma melhoria na reprodutividade dos dados obtidos, um aumento da
produtividade e um ambiente de trabalho mais seguro para o profissional quanto à manipulação das
amostras biológicas, que sempre devem ser consideradas “possivelmente contaminantes”.
Foto: Shutterstock.com
 A tecnologia nos laboratórios.
Vale destacar que, mesmo com toda a tecnologia empregada, podem e vão existir variações nos
resultados obtidos, e de maneira geral podem ser classificadas em dois grupos: variações biológicas e
variações analíticas.
A performance do exame é avaliada quanto à precisão e exatidão; e com base na sensibilidade e na

especificidade.
VARIAÇÕES BIOLÓGICAS E VARIAÇÕES

ANALÍTICAS
As variações biológicas estão relacionadas com o histórico do paciente (como abordado no

tópico “Fase pré-analítica”) e serão minimizadas pela adequação dos valores de referência, seja de
gênero, idade ou ciclo hormonal.
As variações analíticas precisam ser minimamente controladas e avaliadas, pois dependendo do

grau de variação, a performance do exame pode ser comprometida, invalidando seu resultado.
Você sabe o significado desses termos?

Precisão – Avalia o quão próxima uma medição está da outra, independentemente do valor de
referência.
Exatidão – Avalia o quão próxima uma medida está em relação ao referencial, independentemente
se está próxima ou não de outra medição.
No esquema a seguir, as medidas são representadas pelas bolas azuis e o referencial é o centro do
alvo. No gráfico as medidas estão em azul e o valor de referência é a linha tracejada.
PRECISO E NÃO EXATO
Imagem: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
PRECISO E EXATO
NÃO PRECISO E EXATO
NÃO PRECISO E NÃO EXATO

E sobre os termos abaixo, você sabe o significado?
Sensibilidade – É a capacidade que o teste tem de identificar como positiva a amostra que de fato
é positiva, ou seja, os resultados positivos verdadeiros.
Especificidade – É a capacidade que o teste tem de identificar como negativa a amostra que de
fato é negativa, ou seja, os resultados negativos verdadeiros.
 Sensibilidade × especificidade.
Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
Para conferir esses parâmetros que acabamos de ver, normalmente realizam-se controles internos e
externos para que possamos detectar, avaliar e minimizar os erros, sejam eles sistemáticos ou
aleatórios.
SISTEMÁTICOS OU ALEATÓRIOS
Entenda melhor sobre os erros:
Erros sistemáticos são aqueles que possuem sempre a mesma direção; as fontes normalmente
são oriundas no equipamento, em sua calibração ou no operador. Erros sistemáticos são
responsáveis pela inexatidão.
Erros aleatórios são imprevisíveis para mais ou para menos, não sendo possível detectar seu
valor; as fontes são as variabilidades analíticas. Erros aleatórios são responsáveis pela imprecisão.
CONTROLE INTERNO
O controle interno é o que chamamos de controle intralaboratorial. A realização dos testes das amostras-
controle deve ser diária. A sua realização é bem simples, uma vez que seus valores de referência sejam
conhecidos.
A amostra-controle normalmente deve ser passada antes de iniciar a rotina e, em alguns casos, pode
ser passada novamente de maneira simultânea às amostras dos pacientes, assim conseguimos
monitorar a precisão dos resultados obtidos. Com isso, podemos criar alertas, para prevenir que um
exame sem a qualidade requerida seja liberado, e/ou para indicar a necessidade de ações corretivas e
de repetição do exame.
Mas como obter esses alertas na prática laboratorial? Uma das técnicas utilizadas para analisar os
padrões avaliados é pelo gráfico de Levey-Jennings.
Como obter os resultados do controle interno pelo gráfico de Levey-Jennings?
Primeiramente é importante saber como é o gráfico de Levey-Jennings. Nele, temos uma “linha do
tempo” da dosagem do parâmetro a ser analisado. A cada dia deverá ser realizada uma leitura da
solução ou amostra-controle. O valor mensurado deverá ser plotado no gráfico. Veja ao lado.
 Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
Qual é a informação que estamos buscando nesse gráfico?
Estamos querendo ver como flutua a dosagem do parâmetro de interesse ao longo do tempo, pois com
isso vemos a performance do teste; ou seja, se o teste está com uma boa precisão e exatidão. Para
isso, realizamos três diferentes avaliações ao longo do tempo, clique para conhecer cada uma.
AVALIAÇÃO DIÁRIA
Verifica se o resultado está dentro ou fora dos limites estabelecidos. Essa verificação é importante para
identificarmos se a bateria de exames está dentro dos limites estabelecidos.
AVALIAÇÃO SEMANAL
Verifica se há uma tendência, algum desvio ou perda de exatidão e/ou perda de precisão.
AVALIAÇÃO MENSAL
Recalcula uma nova média e desvio-padrão com os últimos valores mensurados.
Na prática, como iniciamos o registro do controle interno para confecção do gráfico?
Assim que o aparelho que realizará as dosagens bioquímicas é instalado ou calibrado pelo técnico
responsável, a solução controle (Default tooltip) é passada e o aparelho é ajustado para que o valor
mensurado seja igual ou próximo ao indicado pelo fabricante da solução.
Vamos construir juntos um gráfico para verificação da dosagem de glicose? Acompanhe o passo a
passo descrito a seguir, clicando nas setas.
O técnico irá passar a solução de glicose com concentração conhecida no aparelho. Vamos supor que a
concentração seja de 80mg/dL. Ele irá ajustar todos os parâmetros do aparelho para que o resultado
obtido dessa dosagem gere um valor de 80mg/dL.
Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
Uma vez feito esse ajuste e que o aparelho esteja calibrado e liberado para uso, a leitura da amostra-
controle será diária e a referência da média adotada como padrão inicial será a setada na calibração.
A cada dia uma nova dosagem da amostra-controle (80mg/dL de glicose) será realizada.
A cada dia uma nova dosagem da amostra-controle (80mg/dL de glicose) será realizada.

Com o passar dos dias, teremos um gráfico completo.
Ao final dos primeiros 20 dias, poderemos obter uma análise crítica quanto à precisão, exatidão e
tendência do equipamento avaliado em relação à amostra-controle utilizada. A dosagem será compilada
e avaliada quanto aos desvios-padrão dos pontos mensurados.
80MG/DL
Prezado aluno: É importante que você saiba que as normas preconizadas pelo INMETRO
estabelecem que as unidades de medida devem estar separadas dos números por um espaço. No
entanto, limitações tecnológicas nos fazem juntar algumas das unidades aos números para tornar
o entendimento do nosso material didático mais fácil. Assim, se você encontrar número e unidades
juntos, saiba que foi feito para melhorar a sua visualização, mas que relatórios técnicos e demais
materiais escritos por você devem seguir o padrão internacional de separação dos números e
unidades.
O que fazer caso seja detectada alguma alteração na avaliação do gráfico Levey-Jennings?
Para delinear quais atitudes devem ser tomadas, normalmente seguimos as Regras de Westgard, que
preveem direcionamentos nos mais variados casos. Os mais comuns são:
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello
 Fluxograma das regras de Westgard. s = desvio padrão.
Vamos entender melhor essa regra, interpretando os gráficos, dos casos mais comuns, de Levey-
Jennings pela Regra de Westgard. Clique nas setas abaixo.
1:3s: Uma medição do controle excede ±3 desvios padrões. Normalmente indica erros aleatórios.
1:2s: Uma medição do controle excede o limite (±2s). Normalmente indica um alerta para as próximas
medições.
2:2s: Duas medições consecutivas do controle excede o limite (±2s). Normalmente é correlacionada a
erro sistêmico.
R:4s: Duas medições consecutivas do controle possuem diferença de 4 pontos. Normalmente é

correlacionada a erro aleatório.
4:1s: Quatro medições consecutivas do controle excedem o mesmo limite de ±1s. Normalmente indica
erro sistêmico.
10 média: Dez medições consecutivas do controle acima ou abaixo da média. Normalmente indica erro
sistêmico intenso.
Quais são os limites de variações estabelecidos?
De maneira geral, a variação aceitável é de ±2 desvios-padrão (SD ou S) da média calculada ou

informada, ficando de forma não consecutiva. A critério do laboratório, aceita-se 1 ponto mensurado fora
desse limite estabelecido de ±2 desvios-padrão, pois o intervalo de confiança é de 95%.
Quando se tem mais de cinco pontos consecutivos se aproximando dos limites ±2 desvios-padrão, é um
forte indicativo de perda de exatidão, que pode ser por erro sistêmico. Normalmente, sugere-se que as
análises sejam suspensas e que o possível erro seja corrigido antes de liberar os resultados.
Quando se identifica mais de cinco pontos mensurados beirando os limites de ±2 desvios-padrão

alternadamente, é um forte indicativo de perda de precisão, que pode ser por erro aleatório.

Quando mais de seis pontos mensurados estão de maneira crescente ou decrescente em direção aos
limites estabelecidos, é um forte indicativo de tendência, ou seja, quando os pontos vão em uma mesma
direção pouco a pouco, sem ter variações bruscas de desvio-padrão, indicando assim uma tendência de
subir ou descer em relação à média.
Quando uma leitura de amostra-controle é rejeitada, dependendo do caso, é indicado fazer uma
diluição/preparação de uma alíquota de amostra-controle; assim como deve-se realizar uma limpeza do
equipamento, ajuste da temperatura ambiente (caso o equipamento exija alguma faixa específica para
um bom funcionamento), e então repete-se a dosagem do parâmetro.
Caso persista a discrepância do parâmetro medido, a recomendação inicial é abrir um novo lote de
amostra-controle, pois dependendo de sua composição, poderá ser por perda de viabilidade,
contaminação, precipitação etc. Caso o problema continue com a nova amostra-controle, seria
enquadrado como uma “não conformidade”, e o recomendado seria inutilizar a máquina
momentaneamente e recalibrar o equipamento e/ou chamar a assistência técnica, para avaliar o motivo
da falta de precisão e/ou exatidão encontrado.
 SAIBA MAIS
Cabe ressaltar que, caso seja necessária uma recalibração e/ou manutenção técnica no aparelho, os
parâmetros do aparelho utilizados como referências devem ser “resetados”. Assim, a indicação é que se
comece um novo gráfico de Levey-Jennings e aguarde pelo menos 20 medições para obter uma análise
crítica do aparelho.
 ATENÇÃO
Quando o equipamento passa por uma recalibração, utilizamos o controle interno para saber o novo
valor de referência para o equipamento, ou ajustamos o equipamento para que a média daquela medida
se mantenha. O que será acompanhado ao longo dos dias é a variação após a
calibração/compensação. Por esse motivo, é importante começar um novo gráfico, pois a média pode
ser bem diferente do gráfico antes da calibração/compensação.
O registro de não conformidades, tomadas de decisão e dos seus respectivos resultados deve ser
anotado em caderno de registro de controle de qualidade da máquina, ou em algum documento similar
previsto na gestão de qualidade do laboratório.
 VOCÊ SABIA
Os laboratórios estão cada vez mais automatizados, dinâmicos e interfaceados, otimizando o

processamento e diminuindo o tempo de liberação dos resultados, assim como aumentando gatilhos de
alerta de possíveis erros ocorridos durante a fase analítica. Uma checagem que vem ganhando espaço
do laboratório clínico é a checagem delta (Delta Check ). Tal checagem é um mecanismo de
comparação eletrônica de resultados anteriores (realizados em outra data) do mesmo paciente a fim de
avaliar os níveis de variação entre os resultados e classificar se tais alterações são biologicamente
possíveis.
Controle externo
O controle externo é o que chamamos de controle interlaboratorial, comparando os resultados obtidos

com a média dos laboratórios participantes do mesmo controle.
A realização é a partir dos ensaios de proficiência, no qual o laboratório recebe periodicamente alíquotas
de materiais que são enviados para vários laboratórios simultaneamente.

O laboratório realiza a testagem e envia os resultados obtidos para a empresa que enviou a(s)
amostra(s).

Esta irá agrupar, avaliar e enviar os relatórios detalhados com os resultados obtidos e os valores
esperados.
A partir desse controle, o laboratório terá subsídios para garantir que seus resultados representam um
valor bem próximo ao real, dentro da variabilidade permitida.
Vale destacar que deve ser feita a realização do controle de qualidade interno e externo de todos os
testes realizados no laboratório, independentemente se possui caráter qualitativo, quantitativo e/ou
semiquantitativo. Caso o laboratório não consiga adquirir as amostras-controle, seja por questões
financeiras ou por indisponibilidade comercial, deverá recorrer a formas alternativas indicadas para o
caso na literatura. No caso de controle externo, algumas empresas disponibilizam kits comerciais
específicos para o teste, porém aceitam validar testes que utilizem os reagentes da rotina em vez do kit
comercial específico, desde que sejam respeitadas as especificações. No caso de controle interno do
teste, para validar os resultados podemos utilizar amostras previamente avaliadas e com resultados
conhecidos, como amostras sabidamente positivas ou negativas para determinada reação. Caso a
amostra usada como controle positivo não apresente resultado positivo, o teste precisa ser refeito.
 VOCÊ SABIA
O Programa Nacional de Controle de Qualidade (PNCQ) é considerado o maior provedor dos ensaios de
proficiência para realização do controle externo da qualidade obrigatório, segundo a RDC 302:2005 da
Anvisa.
FASE PÓS-ANALÍTICA
A fase pós-analítica compreende os procedimentos realizados após a análise técnica da amostra,

incluindo cálculos, digitação dos dados, armazenamento da amostra sobressalente, arquivamento dos
resultados, revisão e liberação dos laudos, disponibilização dos laudos e avaliação médica.
Os erros encontrados nessa fase, na maior parte dos casos, estão relacionados com letra/número
ilegível, conversão de escalas e unidades de medidas, digitação incorreta. Com o avanço da tecnologia
e do interfaceamento dos equipamentos com os softwares específicos para laboratórios clínicos, foi
percebida uma diminuição significativa nas fontes de erros.
Atualmente, na maioria dos laboratórios, as amostras recebem identificação com códigos de barras, que
é automaticamente reconhecida pelas máquinas e interfaceada com as máscaras dos exames
solicitados, suprimindo a necessidade de digitação de cada exame solicitado. Apesar de todas as
facilidades e benefícios com a transmissão da informação do equipamento diretamente para a máscara
do futuro laudo, é preciso estar atento, sempre monitorando e revisando os resultados a serem
liberados, pois erros e não conformidades ainda continuam ocorrendo.
 Amostras com código de barra.
Para minimizar tais fontes de erros, recomenda-se que as máscaras dos laudos sejam atualizadas
periodicamente e/ou quando houver mudança de equipamento, metodologia ou valores de referência.
É importante haver uma padronização e uma linguagem facilitada ao montar uma máscara de laudo,
principalmente em relação à disponibilização dos valores de referência quando estes modificam de
acordo com as variações biológicas, como idade, gênero etc. Afinal, a avaliação médica do resultado
liberado poderá ser de suma importância para a conduta médica, e se os resultados forem mal
interpretados, podem induzir o médico a tomar direcionamentos equivocados.
ACREDITAÇÃO LABORATORIAL
Este é um método de reconhecer e atestar a qualidade dos serviços oferecidos pelos laboratórios, que,
após a acreditação laboratorial, recebem um certificado de que atingiram as conformidades exigidas
para seu funcionamento ser controlado.
Qual é a importância de ter a acreditação de um laboratório?
De maneira geral, o laboratório que possui acreditação passará mais credibilidade em relação ao serviço
prestado, somada a eficiência, qualidade, segurança e eficácia na realização dos exames e no sistema
de gestão da qualidade, mantendo o foco na satisfação do cliente (paciente/médico solicitante).
Para um laboratório ser acreditado, ele precisa seguir as normas brasileiras específicas e ter uma rotina
de controle de qualidade. Tal rotina precisa incluir desde todos os itens de controle de qualidade interno
e externo já discutidos, até o controle de diversas variáveis, como temperatura do ambiente, iluminação,
umidade, temperatura das geladeiras e refrigeradores, lotes e validade dos reagentes etc. Com um
controle rígido e eficaz, considerando todas essas variáveis, a chance de se alcançar os requisitos para
obter a acreditação é muito alta.
 ATENÇÃO
Cabe ressaltar que o processo de acreditação é periódico e voluntário, e é outorgado por órgãos
credenciados com capacidade para avaliar e comprovar a implementação do sistema de qualidade
(organizacional e/ou técnica) no laboratório solicitante. E tais entidades credenciadas precisam ser
reconhecidas pela Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANS).
Para refletir
Alguns estudos realizados apontam que a fase mais crítica do processamento de um exame é a fase
pré-analítica, conforme mostrado na tabela abaixo.
Tabela 2.1 Distribuição dos erros nas três fases
Pré-analítica Analítica Pós-analítica
Plebani et al . 68% 13% 19%
Lapwort et al . 62% 32% 6%
Goldschimit et al . 53% 23% 24%
Nutting et al . 57% 13% 30%
Stahl et al . 75% 16% 9%
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
 Porcentagem de erros nas três fases de um exame clínico.

BARCELOS; AQUINO, p. 14, 2018.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. AS ETAPAS DA REALIZAÇÃO DE UM EXAME SÃO CLASSIFICADAS EM PRÉ-

ANALÍTICO, ANALÍTICO E PÓS-ANALÍTICO. A SEGUIR ESTÃO LISTADAS AS
CORRELAÇÕES ENTRE A ATIVIDADE E AS ETAPAS DO EXAME CLÍNICO.
ASSINALE A ALTERNATIVA QUE NÃO APRESENTA A CORRELAÇÃO CORRETA.
A) Coleta do material – fase pré-analítica.
B) Identificação dos tubos – fase pré-analítica.
C) Transporte do material coletado – fase pré-analítica.
D) Processamento dos dados do teste – fase pós-analítica.
E) Confirmação da identificação dos tubos e do paciente – fase pós-analítica.
2. O GERENTE DO LABORATÓRIO CENTRAL DE ANÁLISES CLÍNICAS

SOLICITOU A SEU FUNCIONÁRIO O GRÁFICO DE LEVEY-JENNINGS DO TESTE
DE GLICOSE, APRESENTADO A SEGUIR. AO AVALIAR OS 7 PONTOS DA ÚLTIMA
SEMANA, ELE SOLICITOU QUE O TESTE FOSSE INTERROMPIDO
MOMENTANEAMENTE DEVIDO À:
 ELABORADO POR FABIANA VIEIRA DE MELLO.
A) Perda de precisão.
B) Perda de exatidão.
C) Tendência à queda.
D) Tendência à alta.
E) Perda de sensibilidade.
GABARITO
1. As etapas da realização de um exame são classificadas em pré-analítico, analítico e pós-

analítico. A seguir estão listadas as correlações entre a atividade e as etapas do exame clínico.
Assinale a alternativa que não apresenta a correlação correta.
A alternativa "E " está correta.
O exame clínico é dividido em três fases: pré-analítica (antes da análise ser realizada); analítica (durante
a realização do exame); e pós-analítica (fase que contempla o processamento dos dados e sua
interpretação). A confirmação dos dados do paciente e do rótulo dos tubos deve ocorrer na fase pré-
analítica; ou seja, antes do exame ser analisado.
2. O gerente do laboratório central de análises clínicas solicitou a seu funcionário o gráfico de

Levey-Jennings do teste de glicose, apresentado a seguir. Ao avaliar os 7 pontos da última
semana, ele solicitou que o teste fosse interrompido momentaneamente devido à:
 Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
A alternativa "B " está correta.

Ao avaliar o gráfico apresentado, podemos ver que a partir do dia 13 todos os pontos estiveram abaixo
da média de referência, indicando uma perda de exatidão. A exatidão avalia o quão próximos da média
de referência os pontos estão, enquanto a precisão avalia o quão próximo um ponto está do outro,
desconsiderando o valor médio de referência.
MÓDULO 2
 Distinguir os diferentes métodos analíticos utilizados em bioquímica clínica, assim como a

função e a aplicabilidade dos métodos analíticos abordados na prática laboratorial
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS DE

BIOQUÍMICA CLÍNICA
Conforme vimos no módulo anterior, os laboratórios de análises clínicas (incluindo o setor de bioquímica
clínica) estão cada vez mais automatizados e tecnológicos. Apesar disso, o conhecimento dos princípios
básicos dos diferentes métodos empregados continua sendo fundamental, pois em alguns casos será o
alicerce para nortear a interpretação dos resultados de forma segura.
 Automação nos laboratórios de bioquímica.
Com base nisso, vamos relembrar algumas questões físicas e químicas, explorar os métodos analíticos
e correlacioná-los com os testes mais utilizados dentro do laboratório de bioquímica clínica atualmente.
É importante ressaltar que os testes, de maneira geral, podem ser classificados em:
Classificação Característica Exemplos
Definem se o resultado da amostra é Detecção de glicose na

Qualitativos
positivo ou negativo. urina.
Dosagem de ferro no
Quantitativos Têm como resultado valores/números.
sangue.
Quando a intensidade da positividade Dosagem de anticorpos com

Semiquantitativos
reflete em uma grandeza. base na titulação.
Dentre as principais técnicas utilizadas nos laboratórios de bioquímica clínica, podemos destacar a
espectrofotometria, a colorimetria, a turbidimetria, a nefelometria e a eletroforese. Ao longo do módulo,
vamos ver cada uma dessas técnicas e suas aplicações.
MÉTODOS FOTOMÉTRICOS
Diversas técnicas utilizadas em métodos quantitativos possuem como princípio base a fotometria, que
consiste na medição de parâmetros da luz correlacionados à emissão, dispersão, absorção, transmissão
e reflexão.
 Fenômenos da luz.
Para começarmos a entender como funcionam as técnicas, precisamos relembrar alguns conceitos.
VOCÊ LEMBRA O QUE SÃO TRANSMITÂNCIA E

ABSORBÂNCIA?
Escreva aqui sua resposta
A luz, ao incidir no objeto, pode percorrer três caminhos diferentes: a absorção, a reflexão e a
transmissão.
Resumidamente, temos a seguinte fórmula:
Vamos imaginar duas situações: na primeira, há uma luz passando por uma cubeta com uma solução
incolor; e na segunda há a mesma luz, de igual intensidade, passando por uma cubeta igual, porém com
uma solução azul.
Será que a intensidade de luz transmitida detectada será igual à intensidade de luz incidente? Ou será
que a intensidade de luz transmitida que foi detectada no caso da solução incolor será a mesma
intensidade de luz transmitida detectada com a solução azul?
 Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes características.
Pelo esquema anterior, podemos observar que a intensidade de luz incidente é maior do que a
intensidade de luz transmitida detectada em ambos os casos. Além disso, a intensidade de luz detectada
após a cubeta com a solução incolor é maior do que a intensidade de luz detectada após a cubeta com a
solução azul.
Mas por que isso acontece?
Ao longo do caminho óptico, ao passar pela cubeta, há a absorção da radiação luminosa, diminuindo
progressivamente a sua intensidade. Logo, a intensidade de luz detectada (I) será menor que a
intensidade de luz incidente (Ii). A relação entre essas duas medidas é o que chamamos de
Transmitância (T).
I
T=
II
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
A transmitância muitas vezes é apresentada em percentual, o que acaba gerando um resultado relativo.
Então, para facilitar a comparação dos resultados obtidos, utilizamos a Absorbância (A), que
matematicamente é o logaritmo negativo da transmitância:
A = - LOG
Além disso, podemos afirmar que a diferença encontrada entre as intensidades de luz que incide e a
intensidade de luz que é detectada após a cubeta se deve a três principais fatores:
Absortividade constante que depende do comprimento de onda;
Espessura da solução atravessada pela luz (cubeta);
Concentração da solução.
Com isso, fica estabelecido que a quantidade de intensidade de luz detectada diminui exponencialmente
em algumas situações, como:
Ao aumentar a espessura da cubeta com a solução, constituindo o que conhecemos como Lei de
Lambert.
Ao aumentar a concentração ou intensidade de cor da solução, constituindo o que conhecemos

como Lei de Beer.
LEI DE LAMBERT

 Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes tamanhos de cubeta.
LEI DE BEER
 Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes
concentrações/intensidade de cor.
Normalmente, o comprimento de onda é constante, a espessura da cubeta com a solução também é

considerada constante se utilizarmos a mesma cubeta (o que normalmente acontece nos laboratórios de
bioquímica clínica). Logo, o que muda de uma situação para a outra é a concentração da solução, que
justamente é o alvo dos nossos testes laboratoriais.
Com isso, a Lei de Lambert-Beer estabelece que a concentração da substância em solução é

diretamente proporcional à intensidade de luz absorvida, matematicamente representada por:
𝐴 = 𝑎𝑏𝑐
Em que:
a é a absortividade constante que depende do comprimento de onda;
b é a espessura da solução atravessada pela luz;
c é a concentração da solução.

Entre a transmitância e a absorbância, acabamos utilizando mais a absorbância por possuir uma relação
linear com a concentração de uma substância absorvente em solução.
 Relação Absorbância e % Transmitância.

Fotometria e Padronização, José Carlos Basques, 2010, pág. 9.
IMPORTÂNCIA DA LEI DE LAMBERT-BEER

PARA AS DOSAGENS BIOQUÍMICAS.
Neste vídeo, a especialista Jéssica Ribeiro Lima fala sobre a importância da lei de Lambert-Beer e os
conceitos de absorbância e transmitância para as dosagens em bioquímica clínica.
Vamos a um exemplo prático?
Com base nesses conceitos apresentados, como você acha que poderíamos utilizá-los na prática
laboratorial?
Iniciamos com uma referência para que o teste possa ser quantitativo. Para isso, teríamos que partir de
soluções com concentrações conhecidas, para que pudéssemos montar uma curva padrão. Vamos
montar um experimento juntos?
Vamos supor que gostaríamos de dosar a substância “F” nas amostras de três pacientes.
CURVA PADRÃO
É o conjunto de valores utilizados como referência para o teste a ser realizado.
PASSO 1
Para começar, precisamos fazer uma diluição seriada da substância “F” padrão que temos em nosso
laboratório. No nosso caso, diluímos em 11 amostras padrão. Após a diluição, precisamos incubar as
amostras padrão diluídas com o reagente, que irá gerar uma mudança de cor ao reagir com a
substância “F”.
PASSO 2
Precisamos também fazer uma cubeta com o reagente e sem nenhuma amostra, esse será o nosso
branco, que serve para setar o aparelho; ou seja, indica ao aparelho quanto da intensidade de luz é
refletida pela cubeta e quanto é absorvida somente pelo reagente. O valor gerado deverá ser
descontado das medições das amostras padrão e das amostras de interesse. Na maioria dos aparelhos,
esse desconto do valor encontrado no branco ocorre pela setagem para as medições seguintes, não
sendo necessário fazer nenhum cálculo adicional nos resultados obtidos.
 Esquema das amostras para realização da setagem do aparelho e curva padrão.
PASSO 3
Após o tempo necessário de incubação para a reação do teste, vamos realizar a leitura das amostras
padrão em um aparelho que emite uma intensidade de luz, que cruza a cubeta e detecta a intensidade
de luz que não foi absorvida nem dispersada.
PASSO 4
Para estabelecer uma correlação entre as concentrações conhecidas e a absorbância, montamos um
quadro conforme o exemplo a seguir:
Padrão Absorbância (595 nm) Concentração (µg/mL)
1 0,01 1
2 0,02 2
3 0,05 5
4 0,1 10
5 0,2 20
6 0,5 50
7 0,7 70
8 0,8 80
9 1,1 100
10 1,1 120
11 1,1 130
 Valores de absorbância comprimento de onda de 595 nm das soluções com concentrações

conhecidas.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello
PASSO 5
Com bases nas anotações, vamos plotar em um gráfico os resultados:
PASSO 6
Vamos calcular a equação da reta:
PASSO 7
Vamos incubar as amostras dos pacientes e realizar a leitura conforme fizemos com as amostras
padrão.
PASSO 8
Vamos anotar os valores de absorbância das amostras para calcularmos as concentrações da
substância “F” em cada uma das amostras.
Amostra Absorbância (595 nm) Concentração (µg/mL)
Paciente 1 0,6 ???
Paciente 2 0,35 ???
Paciente 3 0,72 ???
 Valores de absorbância comprimento de onda de 595 nm das soluções com concentrações

conhecidas.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello
PASSO 9
Com a equação da reta, calculamos as concentrações das amostras dos pacientes:
Equação:
𝑦 = 0, 0093𝑥 + 0, 0201
Em que: y = Absorbância; x = concentração da substância “F”.
Então:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0, 0093 (𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜) + 0, 0201

0, 0093 (𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜) = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 - 0, 0201
- 0, 0201
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎
0, 0093
Vamos calcular por paciente?
Paciente 1: Absorbância: 0,6 nm a 595 nm
0, 6 - 0, 0201
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 = 0, 0093
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 = 62, 35 Μ 𝑔 / 𝑚𝐿
0, 35 - 0, 0201
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 = 0, 0093
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 = 0, 72 0, -0093
0, 0201
Amostra Absorbância (595 nm) Concentração (µg/mL)
Paciente 1 0,6 65,35
Paciente 2 0,35 35,47
Paciente 3 0,72 75,26

PASSO 10
Plotamos no gráfico da curva padrão (pontos em vermelho):
PASSO 11
Conseguimos então calcular as concentrações da substância “F” nas amostras dos pacientes. E, ao
observar o gráfico, verificamos que tais dosagens estão dentro da margem segura da dosagem.
 ATENÇÃO
Você observou que as amostras padrão 9, 10 e 11 tiveram a mesma absorbância, mesmo tendo
concentrações diferentes da substância “F”? Pois é, isso se deve ao “platô” de saturação.
Independentemente da concentração, a partir da concentração da amostra padrão 9, o ponto máximo de
absorbância já foi detectado. Caso a dosagem da amostra do paciente caia próxima ao “platô”, é
importante repetir a dosagem diluindo a amostra do paciente, para que a dosagem caia no intervalo
seguro da curva padrão.
Com esse exemplo que construímos juntos ficou mais fácil de vermos a aplicação dessas propriedades,
não foi? E é assim que os exames que utilizam métodos fotométricos são realizados dentro do
laboratório clínico.
Claro que todos esses cálculos já são automatizados pelos softwares dos equipamentos e toda a
logística é facilitada, com utilização de kits em muitas situações. Mas se for necessário realizar um
exame de emergência e o software não estiver funcionando, você conseguirá realizar o cálculo da
concentração da substância com o nosso passo a passo, aplicando a Lei de Lambert-Beer.
ESPECTROFOTOMETRIA
A espectrofotometria (Espectrometria ou Espectroscopia) é uma das técnicas que utilizam a fotometria
como princípio.
 Exemplo de espectrofotômetro.
 Exemplo de espectrofotômetro.
A partir dela, é possível medir a absorção de luz visível e ultravioleta, associando-a com a técnica de
colorimetria, usando para isso os aparelhos espectrofotômetros.
Como mostrado no esquema a seguir, o espectrofotômetro apresenta uma fonte de luz, que será de
tungstênio para luz visível ou de deutério para luz ultravioleta. Essa luz emitida passa por um
monocromador, “transformando” essa luz em monocromática.
 Esquema simplificado dos componentes principais dos espectrofotômetros.
Atenção!
A luz visível compreende a luz com comprimento de onda de 400nm a 700nm.
Ao passar pelo monocromador, o feixe passa por uma fenda (slit ) que determina qual intervalo de
comprimento de onda será permitido na avaliação. Se o monocromador for ajustado para 595nm e o
aparelho tiver uma fenda de 10nm, por exemplo, o feixe de luz formado terá comprimento de onda de
590nm a 600nm.
Mas você deve estar se perguntando como esse intervalo é obtido. Vamos entender?
Quando o intervalo é de 10nm, isso indica que a avaliação será 5nm além do valor atribuído (590nm) e
5nm pra baixo (600nm). Por isso que no exemplo anterior, na fenda de 10nm, ajustado para 595nm, o
feixe terá de 590nm a 600nm.
Depois do local para inserir a cubeta com a amostra, tem um detector do tipo fotomultiplicador, que
transforma a luz transmitida pela amostra em impulso elétrico, que é amplificado e reconhecido
eletronicamente. De acordo com o software do equipamento, esse resultado será fornecido em
absorbância, transmitância e/ou concentração.
 DICA
Quanto menor for o limite inferior de abertura do slit , melhor será o espectrofotômetro; e quanto menor
a abertura da fenda utilizada, maior terá que ser a sensibilidade do fotomultiplicador.
Até o momento, nós discutimos que na espectrofotometria a luz será absorvida de acordo com a
coloração da amostra avaliada, e que a concentração será proporcional ao valor da absorbância. Mas
nem toda amostra terá uma cor diretamente relacionada com a substância de nosso interesse; assim
como nem toda substância a ser investigada possui uma cor.
Então como devemos proceder para que o teste no espectrofotômetro seja substância (ou característica)
específica? Como determinar a concentração da substância de interesse em uma amostra heterogênea
e previamente colorida?
Essas perguntas são muito pertinentes, e vamos entender todo o passo a passo necessário para
compreendermos a aplicação da espectrofotometria na prática clínica.
Para termos uma amostra viável para ser utilizada na espectrofotometria, precisamos realizar reações
bioquímicas colorimétricas, nas quais utilizamos reagentes que em contato com as substâncias de
interesse geram alterações na cor da solução, seja por consumo de substrato ou por formação de novos
produtos.
Essa cor gerada será proporcional à concentração da substância corada na solução e, por conseguinte,
obtemos a concentração da substância de interesse, de acordo com a reação bioquímica.
A cor da solução resultante das reações bioquímicas será avaliada de acordo com o comprimento de
onda de luz que absorve; ou seja, se uma solução apresenta cor azul, significa que ela transmite luz azul
e absorve a cor complementar, que é a luz amarela.
Logo, sua leitura deverá ser realizada com feixe no comprimento de onda de 580nm a 595nm, referente
à luz amarela. Clique e veja o esquema.
 Correlação dos comprimentos de onda e as cores absorvidas e complementares.

Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
No laboratório de bioquímica clínica, grande parte dos exames realizados se baseia nos métodos que
acabamos de estudar – fotometria e colorimetria –, tendo como valores finais as concentrações das
substâncias de interesse que são expressas em mg/dL, U/L, mmol/L, entre outras escalas.
As reações podem ter características qualitativas ou quantitativas, sendo os testes mais comuns para
dosagem/identificação de:
Proteínas, glicose, colesterol e lipídeos;
Íons: ferro, cálcio, magnésio;
Produtos nitrogenados: amônia, ureia e ácido úrico;

Enzimas: fosfatase alcalina, amilase;
Pigmentos endógenos: bilirrubina.
A seguir vamos conhecer algumas reações bioquímicas utilizadas na prática laboratorial. Lembrando
que hoje já são vendidos kits com todos os reagentes e parâmetros padronizados, facilitando a parte
operacional.
Analito Método Leitura
Glicose o -toluidina 600 nm a 650 nm
Creatinina sérica Cinético colorimétrico de tempo fixo 490 nm a 520 nm
Amilase Monitorização do tempo de hidrólise com iodo 660 nm
Fósforo Molibdato de amônio 650 nm
Ferro sérico Dissociação e redução do ferro 540 nm a 580 nm
Vamos conhecer melhor os métodos de detecção desses analitos:
Glicose: A molécula de glicose reage com a o- toluidina em um meio ácido e aquecido. Dessa reação
resultam a glicosamina e a base de Schiff, que produz coloração azul e será proporcional à
concentração de glicose presente na amostra avaliada.
Creatinina sérica: A molécula de creatinina reage com o picrato alcalino (pH 12,4) em meio tamponado,
gerando a molécula de picrato de creatinina de coloração vermelha, que será proporcional à
concentração de creatinina na amostra avaliada.
Amilase: essa técnica é realizada de forma pareada à amostra com um padrão. Preparam-se dois tubos
com amido e iodo, que será de cor azul. Será adicionado em um dos tubos a amostra para quantificar a
amilase. A amilase presente na amostra irá degradar o amido a 37 °C, e a avaliação será pela perda da
coloração azul; comparativamente com o tubo controle, onde o amido não foi degradado e continua com
a coloração azul. A absorbância detectada será inversamente proporcional à atividade da amilase na
amostra.
Fósforo: os íons de fósforo reagem com o molibdato de amônio quando em presença de ácido sulfúrico,
formando o fosfomolibdato de amônio. A esse produto será adicionado hidroxilamina em meio alcalino,
que resultará em azul de molibdênio, indicando a concentração de fósforo na amostra avaliada.
Ferro: a molécula de ferro sérico será dissociada da transferrina em meio ácido, reduzindo seu estado
férrico pela hidroxilamina. As proteínas são precipitadas com o ácido clorídrico, ácido tricloroacético e
ácido tioglicólico. Ao final, o ferro irá reagir com a ferrozina, formando um complexo de cor violeta que
indicará a concentração do ferro na amostra avaliada.
TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA
A turbidimetria e a nefelometria são métodos que também se baseiam na fotometria, uma vez que
utilizam a intensidade de luz como fonte para avaliar a concentração da substância de interesse na
amostra; porém diferem da espectrofotometria, por não associar a colorimetria, e sim a turbidez da
amostra e a consequente dispersão e/ou transmissão da luz incidente.
Essas técnicas visam avaliar a presença de complexos insolúveis, como complexos de antígeno-
anticorpo. A quantificação desse imunocomplexo será proporcional à dispersão da luz: quanto mais turva
for a amostra, mais concentrada está a substância de interesse e, consequentemente, mais a luz
incidente será dispersada.
Esses dois métodos são inversos e complementares, mas quais são as diferenças entre eles?
A turbidimetria avalia e quantifica a luz que não foi dispersada, ou seja, a luz que foi transmitida até os
detectores / fotomultiplicadores. Já a nefelometria quantifica a luz dispersada pelos detectores alocados
em ângulos entre 45° a 90°, sendo um método bem mais sensível do que a turbidimetria.

 Esquema que compara os métodos de nefelometria e turbidimetria.
Vamos entender melhor?

A intensidade de luz que é captada nos detectores, tanto na nefelometria quanto na turbidimetria, irá
variar de acordo com as características do complexo proteico formado, principalmente em relação ao
quantitativo, ao tamanho e à forma. Para intensificar a turbidez da técnica, muitos kits comerciais
utilizam partículas de látex revestidas pelos anticorpos contra a substância de interesse.
Imagem: U.S. Geological Survey / Wikimedia Commons / Domínio Público.

 Esquema ilustrando o aumento da turbidez da reação antígeno-anticorpo com o látex.
Assim como na espectrofotometria, a curva padrão (de calibração) é fundamental para que se possa ter
valores de referência e para que o aparelho seja calibrado de maneira correta antes de ser utilizado com
as amostras de interesse. Para zerar o aparelho, também se utiliza um tubo somente com o reagente,
chamado de branco.
A vantagem da turbidimetria é que pode ser realizada em aparelhos de espectrofotometria, enquanto a

nefelometria precisa de um aparelho específico e que nem sempre está disponível nos laboratórios de
análises clínicas.
De maneira geral, o método turbidimétrico é vantajoso pela sua rapidez de execução, exatidão e
facilidade operacional. Por outro lado, é preciso se certificar de que não haja coloração na amostra, pois
a coloração pode atrapalhar e acabar interferindo no resultado final.
A turbidimetria pode ser usada nos seguintes setores:
MICROBIOLOGIA
Para acompanhar o crescimento bacteriano por meio de turvação, mensuração da sensibilidade aos
antibióticos nas culturas.
IMUNOLOGIA
Para avaliação de Proteína C-reativa (PCR).
BIOQUÍMICA
Para quantificação da concentração de proteínas em diversos líquidos biológicos, como em LCR (líquido
cerebrospinal) e urina.
Já a nefelometria é frequentemente utilizada para exames de detecção de anticorpos, uma vez que são
mais sensíveis do que a turbidimetria, como detecção de fator reumatoide (FR).
Finalidade Método Leitura
Quantificação da Reação de aglutinação

Microalbuminúria 540 nm
albumina na urina. de antígeno-anticorpo.
Quantificação da ferritina Reação de aglutinação

Ferritina 540 nm
no soro. de antígeno-anticorpo.
Proteína C-reativa Quantificação da Proteína Reação de aglutinação

540 nm
(PCR) C-reativa no soro. de antígeno-anticorpo.
Vamos conhecer melhor os métodos de detecção desses analitos:
Microalbuminúria: quantificação da concentração da albumina de maneira diretamente proporcional à

aglutinação da albumina presente na amostra de urina avaliada com partículas de látex recobertas com
anticorpos antialbumina humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a
incubação com o reagente e após 2 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível
formação da aglutinação.
Ferritina: quantificação da concentração da ferritina de maneira diretamente proporcional à aglutinação

da ferritina presente na amostra de soro avaliada com partículas de látex recobertas com anticorpos
antiferritina humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a incubação
com o reagente e após 5 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível formação da
aglutinação.
Proteína C-reativa (PCR): quantificação da concentração da PCR de maneira diretamente proporcional

à aglutinação da PCR presente na amostra de soro avaliada com partículas de látex recobertas com
anticorpos anti-PCR humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a
incubação com o reagente e após 2 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível
formação da aglutinação.
MÉTODOS ELETROFORÉTICOS
A eletroforese é um método de separação baseado principalmente na diferença de migração dos
componentes/substâncias carregados sob influência de campo elétrico.
De maneira geral, as substâncias que possuem carga negativa migram em direção ao polo positivo
(ânodo), e as que possuem carga positiva migram em direção ao polo negativo (cátodo). Essa migração
é feita em uma “malha” onde as amostras são injetadas, podendo ser em capilar ou placa de gel. Essa
malha é embebida em tampão específico para a corrida das amostras. E é necessário um sistema
composto por:
 Apresentação esquemática da eletroforese em gel e a obtenção dos resultados.
Além da carga dos componentes da amostra, o tamanho e o volume também podem influenciar essa
separação. Quanto mais concentrada for essa malha, menores serão os poros, e mais lento será o
processo de separação.
Conforme acontece o processo de separação, formam-se bandas na malha, que diferem umas das
outras pela carga elétrica e/ou pelo tamanho das substâncias.
A corrente elétrica aplicada no método é contínua, e quanto maior ela for, menor tende a ser o tempo
para separação dos componentes, pois a velocidade será maior. Além disso, terá uma menor dispersão
da banda, sendo mais eficiente, porém gerará maior calor, que poderá gerar processos de convecção e,
assim, misturar as bandas já separadas.
 Esquema da amostra no gel antes e depois da eletroforese.
Com isso, os parâmetros aplicados, como corrente, tempo e concentração da malha, devem ser
avaliados caso a caso, conforme a necessidade operacional/experimental.
Vamos conhecer o que é necessário para realizar uma eletroforese:
SUPORTE E MALHA
Pode ser de gel de agarose, gel de poliacrilamida, acetato de celulose.
SOLUÇÃO-TAMPÃO
Formada por água, sal ácido ou sal básico (pode ser ácido ou alcalino, dependendo da necessidade).
CUBA DE ELETROFORESE
Permite que a malha fique embebida no tampão e possui os eletrodos positivo e negativo.
FONTE DE VOLTAGEM
Aparelho que transforma a corrente alternada em corrente contínua, permitindo a regulagem da

intensidade e determinando a polaridade dos compartimentos da cuba.
A escolha da malha precisa ser avaliada de acordo com a necessidade de cada caso. O acetato de
celulose permite uma separação proteica rápida e possibilita um armazenamento mais prolongado dos
filmes corados, além de ter um custo mais baixo, porém é um pouco limitado quanto à separação de
amostras muito heterogêneas.
 Aparato para a eletroforese em cuba vertical.
 Aparato para a eletroforese em cuba horizontal .
O gel de agarose possui ampla capacidade de separação proteica e permite avaliar substâncias com
peso molecular alto. Também possui custo relativamente baixo, porém não pode ser armazenado e
preservado por muito tempo.
O gel de poliacrilamida pode conter um reagente desnaturante, que facilita a separação das substâncias.
Comparada a outras técnicas, é a que apresenta melhor resultado em termos de visualização de
proteínas com baixas concentrações, porém é a de mais difícil execução para a rotina laboratorial,
sendo destinada para casos mais específicos.
Uma das aplicações da eletroforese no laboratório de análises clínicas é a avaliação das diferentes
proteínas nas amostras.
Para entendermos esse processo na prática, vamos ver um passo a passo de uma eletroforese em gel
de agarose de hemoglobinas na prática clínica.
Diluímos o pó da agarose em tampão, de acordo com a concentração desejada.
Colocamos a solução de agarose para solidificar no suporte específico, e com o “pente” que irá
demarcar os locais para aplicação das amostras no gel.
 Encaixe do “pente” no gel ainda líquido para formação dos poços, onde será feita a aplicação das
amostras.
Após a solidificação total, colocamos o gel dentro da cuba de eletroforese horizontal e acrescentamos a
solução-tampão.
Colocamos no primeiro poço para as amostras (slot ) um padrão de peso molecular ou um padrão dos
parâmetros a serem avaliados. No nosso caso, podemos colocar uma amostra padrão contendo
hemoglobina AS (traço falcêmico), uma contendo hemoglobina A (normal), no slot ao lado um padrão
de hemoglobina SS (falcêmico), e em outro a amostra de um paciente. Em todas as amostras, antes de
aplicá-las no gel, misturamos com um tampão de amostra para corrida.
 Aplicação das amostras nos poços do gel.
Após aplicar todas as amostras, cada uma em um poço, fechamos a cuba eletroforética e ligamos os
eletrodos à fonte. Atenção! Precisamos de muita atenção para colocar o gel de maneira que as
amostras (que estão carregadas negativamente) corram no gel em direção ao polo positivo; pois se
colocar o gel virado ao contrário, todas as amostras sairão do gel, invalidando a corrida.
Esperamos o tempo necessário para as substâncias migrarem pelo gel de agarose e se separarem
conforme carga elétrica.
 Gel com a migração das diferentes moléculas por amostra.
Imagem: Paulo Cesar Naoum, Hemoglobinas, 2013, p. 49 adaptado por Fabiana Vieira de Mello.
 Eletroforese em gel de agarose de hemoglobinas.
Analisaremos a distribuição de bandas das amostras comparando com a distribuição de bandas do

padrão.
A partir do gel, podemos observar que na amostra padrão da hemoglobina A e no paciente verificamos
uma banda mais forte (que seria a hemoglobina A) e uma banda mais fraquinha na parte inferior do gel
(que seria a hemoglobina A2), ambas as amostras com características de migração no gel similares. É
importante ressaltar que em indivíduos normais a hemoglobina é formada por quatro globinas (duas
cadeias alfa e duas cadeias beta) e um grupo heme. Na amostra padrão da hemoglobina AS temos três
bandas, sendo a mais fraquinha compatível com a hemoglobina A2, uma mais forte compatível com a
hemoglobina A e uma outra banda, compatível com a migração da hemoglobina S. A hemoglobina S

difere da hemoglobina A, pois a cadeia beta da globina apresenta uma substituição de um ácido
glutâmico por uma valina na sexta posição da cadeia de DNA que origina uma hemoglobina anormal.
Indivíduos que apresentam Hb AS apresentam traço falciforme e possuem aproximadamente 50% de
hemoglobina A e 50% de hemoglobina S. Já os indivíduos Hb SS apresentam anemia falciforme e têm
aproximadamente 100% da hemoglobina S. O nosso paciente em estudo não apresenta alteração na
hemoglobina.
 ATENÇÃO
Na bioquímica clínica, a eletroforese é muito utilizada para investigar a composição de proteínas na

urina e no soro, principalmente quando o paciente apresentou níveis anormais na dosagem de proteínas
totais, ou albumina, no exame anterior. O médico solicita esse exame de maneira complementar para
entender o que está afetando as concentrações dessas proteínas no sangue e/ou na urina.
A eletroforese de proteínas do sangue forma um padrão clássico de bandeamento de aproximadamente

5 grupos: albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama.
 Resultado típico do bandeamento das proteínas do soro humano.
Algumas doenças, porém, podem afetar essa produção equilibrada, aumentando o quantitativo de uma
banda específica, como no caso de mieloma múltiplo. Quando se detecta uma banda em quantidade
anormal, realiza-se um exame complementar de imunofixação.
Imagem: Paula Virginia Bottini, Testes laboratoriais para avaliação do componente monoclonal, 2007, p.
24.
 Eletroforese em gel de agarose. Em (A), paciente normal; e em (B), paciente com mieloma múltiplo.
Além do mieloma múltiplo, a eletroforese de proteínas também pode ser solicitada quando os sintomas
indicam algumas doenças autoimunes, inflamatórias, hepáticas ou renais.
Outra aplicação clínica é a avaliação do perfil de lipoproteínas por eletroforese, sendo utilizada como
auxílio no diagnóstico das dislipidemias primárias e secundárias. Onde tem-se como referência o padrão
de distribuição de:
alfa lipoproteínas (22,3 a 53,3%)
pré-beta lipoproteínas (4,4 a 23,1%)
beta lipoproteínas (38,6 a 69,4%)
lipoproteína-Lp(a) (Ausente)
A eletroforese também pode auxiliar no diagnóstico dos processos inflamatórios no sistema nervoso
central, como esclerose múltipla, a partir da análise eletroforética da composição proteica do líquor. Por
fim, conforme já falamos ao longo do módulo, a eletroforese é muito utilizada para o diagnóstico de
talassemias e hemoglobinopatias, sendo fonte de diagnóstico diferencial de microcitoses e anemias
hemolíticas.
PRINCIPAIS ERROS DE EXECUÇÃO DAS
TÉCNICAS DE ESPECTROFOTOMETRIA E
ELETROFORESE
A especialista Fabiana Vieira de Mello discute sobre os principais erros metodológicos na execução das
técnicas em laboratórios de bioquímica clínica.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. O TÉCNICO DO LABORATÓRIO PROCUROU O RESPONSÁVEL TÉCNICO
PARA APRESENTAR AS ABSORBÂNCIAS DA DOSAGEM DE DUAS AMOSTRAS
DENTRO DO GRÁFICO DA CURVA PADRÃO DIÁRIA, SOLICITANDO QUE VOCÊ
ASSINE O LAUDO PARA LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS.
 ELABORADO POR FABIANA VIEIRA DE MELLO.
NO GRÁFICO, AMOSTRAS EM TESTES ESTÃO SINALIZADAS PELO TRIÂNGULO

VERDE E PELO QUADRADO ROXO E AS AMOSTRAS PADRÃO,
REPRESENTADAS PELAS BOLAS BRANCAS. A PARTIR DOS RESULTADOS
APRESENTADOS, VOCÊ:
A) Assina o laudo e autoriza a liberação dos resultados com os valores apresentados.
B) Não assina o laudo e solicita que refaçam as dosagens das duas amostras.
C) Não assina o laudo, e solicita que refaça a dosagem da amostra quadrado roxa diluindo-a.
D) Não assina o laudo e solicita que refaça a dosagem da amostra triângulo verde diluindo-a.
E) Não assina o laudo e solicita que refaça a dosagem das duas amostras diluindo-as.
2. (ADAPTADA) SERVIÇO AUTÔNOMO DE ÁGUA E ESGOTO DE SÃO PAULO

(SAAE-SP) - DIVERSOS CARGOS (VUNESP - 2014). O ENSAIO QUE AVALIA A
TURBIDEZ DA AMOSTRA E COM A CONSEQUENTE DISPERSÃO DA LUZ
INCIDENTE É:
A) Eletroforese
B) Nefelometria
C) Turbidimetria
D) Espectrometria
E) Reação de aglutinação do látex
GABARITO
1. O técnico do laboratório procurou o responsável técnico para apresentar as absorbâncias da

dosagem de duas amostras dentro do gráfico da curva padrão diária, solicitando que você assine
o laudo para liberação dos resultados.
 Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
No gráfico, amostras em testes estão sinalizadas pelo triângulo verde e pelo quadrado roxo e as
amostras padrão, representadas pelas bolas brancas. A partir dos resultados apresentados,
você:
A alternativa "C " está correta.
A partir do gráfico, vemos que a amostra representada pelo quadrado roxo está na região “platô” da
curva padrão. Caso a dosagem da amostra do paciente caia próxima ao “platô”, é importante repetir a
dosagem diluindo a amostra do paciente, para que a dosagem caia no intervalo seguro da curva padrão.
Em relação à amostra representada pelo triângulo verde, podemos liberar o laudo, pois está dentro da
faixa de margem segura da dosagem.
2. (Adaptada) Serviço Autônomo de Água e Esgoto de São Paulo (SAAE-SP) - Diversos Cargos
(VUNESP - 2014). O ensaio que avalia a turbidez da amostra e com a consequente dispersão da
luz incidente é:
A alternativa "B " está correta.
A turbidimetria e a nefelometria são métodos que também se baseiam na fotometria, em que se utiliza a
intensidade de luz como fonte para avaliar a concentração da substância de interesse na amostra. A
turbidimetria avalia e quantifica a luz que não foi dispersada, e a nefelometria quantifica a luz
dispersada.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Como vimos, a realização de um exame requer muitos cuidados e ajustes laboratoriais, desde a fase
pré-analítica até a fase pós-analítica, para termos uma segurança na execução e na liberação dos
laudos para os pacientes. Compreender os controles de qualidade aplicados são de suma importância,
pois quando algum resultado gerado for discrepante, podemos rastrear e identificar se é devido a
alguma alteração fisiológica do paciente ou por erros no processamento da amostra, conseguindo assim
resolver a não conformidade.
Além disso, também visitamos o funcionamento das principais metodologias utilizadas na realização dos
exames bioquímicos, facilitando o entendimento por trás de cada resultado liberado.
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
ANVISA. Resolução RDC nº 302, de 13 de outubro de 2005. Dispõe sobre Regulamento Técnico para
funcionamento de Laboratórios Clínicos. Brasília, 2005.
BARCELOS, L. F.; AQUINO, J. L. Tratado de análises clínicas. 1. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2018.
cap. 1-2, p. 3-34.
BOTTINI, P. V. Testes laboratoriais para avaliação do componente monoclonal. Rev. Bras. Hematol.
Hemoter., São José do Rio Preto, v. 29, n. 1, p. 23-26, 2007.
BRACHT, A.; ISHII-IWAMOTO, E. L. Métodos de Laboratório em Bioquímica. 1. ed. Barueri: Manole,

2003. cap. 2, p. 27-56.
GAW, A. et al . Bioquímica clínica 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015. cap. 1, p. 14-43.
NAOUM P. C. Hemoglobinopatias e Talassemias. [S.l.:s.n.], 2013, p. 49.
WESTGARD, J. O. Multirule and “Westgard Rules”: What are They? 2002. Tradução de ControlLab,
2003.
XAVIER, R. M. et al . Laboratório na prática clínica. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2011. cap. 1-5, p. 33-
100.
EXPLORE+
Para entender as recomendações para coleta de amostra de exames específicos, consulte a

tabela baseada no livro Laboratório da prática clínica , de Xavier, Dora e Barros (2ª edição).
Para conhecer mais sobre a coleta e preparação de amostras, visite o site da SBPC e leia as
Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial: Coleta e
preparo de amostras clínicas .
Para aprofundar o conhecimento sobre as posturas adotadas na aplicação do gráfico de Levey-

Jennings, consulte: Regras múltiplas e “Regras Westgard”: o que são? Disponível na página da
Controllab.
Para aprofundar os conhecimentos nas regras dos laboratórios clínicos segundo a Anvisa, consulte
a RDC 302:2005.
Para ver uma execução de uma espectrofotometria, acesse o vídeo no canal ColtecTube:
#Química: Utilizando o espectrofotômetro . Disponível no YouTube.
Neste estudo, falamos sobre a importância da acreditação para o laboratório. Para buscar quais
entidades são credenciadas e quais laboratórios possuem acreditação, basta visitar o portal da
ANS.
CONTEUDISTA
Fabiana Vieira de Mello
 CURRÍCULO LATTES

1 Introdução À Bioquímica Clínica

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DESCRIÇÃO

Princípios básicos do funcionamento do laboratório de bioquímica clínica e principais métodos

Exames simples e muito convencionais, como dosagem de sódio.

Exames de amostras “dinâmicas”, como teste de tolerância à glicose.

Exames mais complexos, como a identificação de metabólitos intermediários.

Teremos uma noção da grandeza do processamento das amostras e a importância do controle de

 Analisar as etapas dos processos pré-analíticos, analíticos e pós-analíticos dos exames

ETAPAS DO EXAME CLÍNICO

 Fluxograma dos setores que compõem o laboratório de análises clínicas.

A realização de um exame clínico é potencialmente sujeita a muitos erros ao longo do processo, e é de

PRÉ-ANALÍTICA, ANALÍTICA E PÓS-ANALÍTICA

Pré-analítica - Antes da análise ser realizada.

Analítica - Durante a realização do exame.

Pós-analítica - Fase que contempla o processamento dos dados e sua interpretação.

Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.

A fase pré-analítica é iniciada na consulta, começando na prescrição e nas orientações do médico

Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.

USO ADEQUADO DO MATERIAL

Dependendo da conduta pré-analítica do profissional, a amostra poderá ser invalidada e desprezada.

A amostra estiver hemolisada ou coagulada.

O armazenamento e o transporte forem inadequados.

A amostra recebida estiver fora do prazo máximo para processamento.

A amostra estiver mal identificada.

A coleta for realizada no tubo errado.

A fase analítica contempla basicamente a fase instrumental/experimental no laboratório, em que

A performance do exame é avaliada quanto à precisão e exatidão; e com base na sensibilidade e na

VARIAÇÕES BIOLÓGICAS E VARIAÇÕES

As variações biológicas estão relacionadas com o histórico do paciente (como abordado no

As variações analíticas precisam ser minimamente controladas e avaliadas, pois dependendo do

Você sabe o significado desses termos?

PRECISO E NÃO EXATO

Imagem: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

NÃO PRECISO E EXATO

Imagem: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

NÃO PRECISO E NÃO EXATO

E sobre os termos abaixo, você sabe o significado?

Entenda melhor sobre os erros:

Como obter os resultados do controle interno pelo gráfico de Levey-Jennings?

Qual é a informação que estamos buscando nesse gráfico?

Na prática, como iniciamos o registro do controle interno para confecção do gráfico?

Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

R:4s: Duas medições consecutivas do controle possuem diferença de 4 pontos. Normalmente é

Gráfico: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.

Quais são os limites de variações estabelecidos?

De maneira geral, a variação aceitável é de ±2 desvios-padrão (SD ou S) da média calculada ou

Quando se identifica mais de cinco pontos mensurados beirando os limites de ±2 desvios-padrão

Os laboratórios estão cada vez mais automatizados, dinâmicos e interfaceados, otimizando o

O controle externo é o que chamamos de controle interlaboratorial, comparando os resultados obtidos

A fase pós-analítica compreende os procedimentos realizados após a análise técnica da amostra,

Qual é a importância de ter a acreditação de um laboratório?

Tabela 2.1 Distribuição dos erros nas três fases

Pré-analítica Analítica Pós-analítica

Plebani et al . 68% 13% 19%

Lapwort et al . 62% 32% 6%

Goldschimit et al . 53% 23% 24%

Nutting et al . 57% 13% 30%

Stahl et al . 75% 16% 9%

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal