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plantas medicinais
Marili Villa Nova Rodrigues, Vera Lcia Garcia Rehder, Adilson Sartoratto, Sinsio Boaventura Jnior, Adriana da
Silva Santos
Universidade Estadual de Campinas
CPQBA-UNICAMP
Diviso de Qumica Orgnica e Farmacutica
Caixa Postal 6171, CEP 13083-970, Campinas, SP.
E-mail: marili@cpqba.unicamp.br
Resumo
O extrato vegetal bruto constitui uma matriz bem complexa contendo centenas ou
milhares de metablitos, que diferem consideravelmente em seus parmetros fsico-qumicos
e espectroscpicos. Por isso, uma eficiente deteco e rpida caracterizao tm papel
fundamental na pesquisa de produtos naturais biologicamente ativos. Uma eficiente triagem
dos extratos alcanada atravs do monitoramento biolgico e qumico, realizados
concomitantemente. Para isso, a utilizao de tcnicas hifenadas de grande valia, pois
fornece numerosas informaes estruturais dos metablitos antes mesmo do seu isolamento.
A hifenao de um mtodo eficiente de separao com detetor espectromtrico constitui a
principal ferramenta utilizada no estudo de plantas medicinais, onde a cromatografia gasosa e
a cromatografia lquida ocupam posies de destaque entre os mtodos de separao. Para
compostos que apresentam grupos cromforos, o detetor de arranjo de diiodos (DAD)
normalmente empregado; caso contrrio, a deteco feita pelo detetor seletivo de massas,
por causa do grande nmero de informaes geradas. No estudo de plantas medicinais, na
maioria das vezes, torna-se necessrio o uso de tcnicas complementares para a identificao
dos componentes ativos, como o caso da combinao entre LC-NMR (cromatografia lquida
com detetor de ressonncia magntica nuclear), LC-DAD (cromatografia lquida com detetor
de arranjo de diiodos) e LC-MS-MS (cromatografia lquida com detetor seletivo de massas
tandem), graas complexidade do problema. Com os recentes avanos da tecnologia, os
pesquisadores podem contar com ferramentas poderosas na busca de novos compostos
bioativos.
Introduo
GC-MS-MS
LC-DAD
LC-MS
LC-MS-MS
LC-NMR
Caractersticas
Identificao de compostos.
Fornece informao estrutural da
molcula.
Permite comparao com
bibliotecas espectrais.
Confirmao estrutural de
molculas.
Identificao de compostos
conhecidos, atravs da comparao
do tempo de reteno e espectro UV
com o padro analtico. No fornece
informao estrutural.
GC-MS e GC-MS-MS
A cromatografia gasosa foi a primeira tcnica a ser interfaceada com o detetor de
massas, por causa da facilidade do manuseio do efluente gasoso do cromatgrafo. uma
ferramenta muito til na identificao de compostos de origem vegetal graas
disponibilidade de bibliotecas espectrais, com detetor de massas operando sob condies de
impacto de eltrons.
Atualmente, a cromatografia gasosa com detetor de massas sob condies de impacto
de eltrons o mtodo mais aplicado em laboratrios de pesquisa, uma vez que os espectros
obtidos so bem documentados em bibliotecas. A quantificao possvel com o uso de
padro interno, que compensa uma possvel baixa recuperao durante o processo de extrao
e a variao na resposta instrumental.
A principal dificuldade de acoplamento entre GC e MS foi em conseqncia da
introduo de um composto presso atmosfrica (proveniente da separao cromatogrfica)
dentro de um sistema a alto vcuo. Para contornar esse problema, diferentes interfaces foram
desenvolvidas (9).
Os principais requisitos para o desenvolvimento de interfaces para GC-MS levaram
em considerao a reduo do fluxo da coluna cromatogrfica para manuteno do vcuo, a
separao seletiva do analito do gs de arraste e a manuteno da separao cromatogrfica.
Dessa forma, o desenvolvimento das colunas capilares para GC foi em parte
responsvel pelo sucesso da hifenao GC-MS, em razo da reduo significativa do fluxo (1
2 mL/min) em relao s colunas empacotadas (30 60 mL/min), alm do aumento
significativo do poder de resoluo da cromatografia gasosa em relao lquida.
Embora existam vrias tcnicas de ionizao, as mais utilizadas em GC-MS so o
impacto de eltrons (EI) e a ionizao qumica (CI).
Na ionizao por impacto de eltrons, as molculas da amostra, vindas do sistema
cromatogrfico, entram na fonte de ons e so ionizadas pela coliso com os eltrons gerados
num filamento de tungstnio ou rnio. Essa coliso leva fragmentao e ionizao das
molculas da amostra.
Na ionizao qumica, as molculas do analito so ionizadas indiretamente, atravs de
reaes com os ons de um gs reagente (metano, isobutano, amnia ou gua). Essa tcnica
representa uma ionizao mais branda, j que a energia envolvida na coliso pequena (9).
Conseqentemente, ocorre uma menor fragmentao do analito e uma maior
abundncia dos ons moleculares.
Vantagens
Desvantagens
massa
Quadrupolo
Alta resoluo, alta sensibilidade, til para Custo mais elevado, difcil
compostos de alta massa molecular.
Ion trap
operao e manuteno.
rpida.
LC-DAD
A cromatografia lquida com o detetor de arranjo de diiodos (LC-DAD) uma tcnica
amplamente utilizada na anlise de produtos naturais desde que o analito apresente grupos
cromforos que propiciem a absoro de luz na regio de UV-visvel.
uma tcnica muito aplicada no controle de qualidade de produtos de origem vegetal;
porm, sua utilizao na identificao de compostos bioativos limitada, pois o LC-DAD
fornece apenas o espectro UV-Vis de cada substncia como informao estrutural, o que no
suficiente para a caracterizao, pois vrios compostos de um mesmo grupo qumico
apresentam espectros similares, impossibilitando sua distino. As informaes obtidas com
esta tcnica so complementares a outras tcnicas hifenadas em cromatografia lquida (LCMS, LC-NMR). Um exemplo desta aplicao anlise de compostos fenlicos utilizando-se
LC-DAD-MS (10).
A busca por mais informaes sobre a estrutura de compostos levou ao
desenvolvimento de novas tcnicas hifenadas como o LC-MS e LC-NMR.
LC-MS e LC-MS-MS
Dentre os acoplamentos, o LC-MS muito mais seletivo e, em certas circunstncias,
mais sensvel que o LC-DAD. J a identificao de compostos mais difcil e nem sempre
vivel, por causa da menor resoluo cromatogrfica (em comparao com GC) e a possvel
coeluio de compostos.
Uma dificuldade encontrada para acoplamento da LC com o MS era a manuteno do
vcuo no detetor de massas, o que foi resolvido em parte pela introduo da fase mvel de
HPLC na forma de spray dentro da fonte de ons do MS, onde apenas uma pequena frao
do solvente entra no analisador de massas (11).
O principal problema do uso da LC-MS na qumica de produtos naturais a ionizao
de uma grande variedade de compostos existentes no extrato bruto. Embora existam vrios
tipos de interfaces disponveis no mercado, nenhuma delas permite a deteco universal de
todos os constituintes da matriz vegetal. Cada interface tem suas prprias caractersticas e sua
faixa de aplicao (6).
Inicialmente a LC-MS foi desenvolvida para aplicao na confirmao da identidade
de compostos, mas sua preciso suficientemente alta para permitir a quantificao de
analitos por calibrao interna e externa.
O desenvolvimento de tcnicas de ionizao presso atmosfrica, tais como a
ionizao qumica presso atmosfrica (APCI) e a ionizao por eletronebulizao ou
eletrospray (ESI) tornaram a tcnica de LC-MS aplicvel para uma grande variedade de
matrizes. Mais recentemente a disponibilidade do equipamento com fotoionizao (APPI)
conferiu universalidade tcnica de LC-MS, permitindo a anlise de compostos com baixa
massa molecular at protenas (12).
Tipo de
ionizao
Vantagens e desvantagens
TSP
0,12
mL/min
CI+, CI-
APCI
0,22
mL/min
CI+, CI-
ESI
FAB
dinmica
Compostos
. resposta no linear
. variao na resposta
. menos sensvel
. necessita usar tampes
volteis
. bibliotecas para EI
. pouco polares a polares . fragmentao limitada e
. massa molecular de
dificilmente reprodutvel
100-2000
. nenhum espectro de
referncia
. instabilidade da intensidade
do sinal
. condies para LC limitadas
. pouco polares a polares . fragmentao limitada
. massa molecular de
. nenhum espectro de
100-1200
referncia
. altamente sensvel
. possibilidade de degradar
certos compostos termolbeis
. pouco polares a
. fragmentao limitada
altamente polares
. nenhum espectro de
. massa molecular baixa referncia
a elevada (formao de . altamente sensvel
ons com cargas
mltiplas)
. pouco polares a
. fragmentao limitada
altamente polares
. nenhum espectro de
. massa molecular baixa referncia
a elevada (formao de . utilizvel com colunas
ons com cargas
capilares
mltiplas)
. polares e altamente
. fragmentao limitada
polares
. nenhum espectro de
. massa molecular at
referncia
milhares de daltons
. baixo fluxo da fase mvel
LC-NMR
O uso do LC-DAD e LC-MS nem sempre suficiente para a identificao on-line de
produtos naturais pois, muitas vezes, faltam informaes estruturais conferidas pela LCNMR.
Os requerimentos bsicos para o acoplamento dessas duas tcnicas so:
pesquisadores do ramo dos produtos naturais. Este sistema de deteco uma ferramenta
poderosa na diferenciao entre ismeros, configuraes de acar e substituies no anel
aromtico, alm do que, seu acoplamento simultneo com o detetor seletivo de massas
13
C,
Flavonides encontrados
Referncia
bibliogrfica
Gentiana ottonis
Swertisina, iso-orientina
156
Hypericum perforatum
89
199
44
174
A tcnica de LC-NMR ainda no foi aceita amplamente pelos cientistas, por causa da
falta de sensibilidade, onde a maior dificuldade a de observar as ressonncias do analito na
presena de uma grande quantidade de fase mvel. Porm, constitui uma poderosa ferramenta
na identificao de compostos bioativos quando utilizada em combinao com outras tcnicas
hifenadas. At o momento no temos registro do uso desta tcnica no Brasil.
Concluso
A exigncia cada vez maior na obteno de produtos de origem vegetal com qualidade
requer o emprego de tcnicas analticas seletivas e eficientes, que possibilitem com segurana
a identificao e quantificao de diferentes classes de compostos, o que pode ser obtido com
a utilizao das tcnicas hifenadas.
Referncias Bibliogrficas
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Liquid
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