Universidade Federal de Pernambuco

Programa de Pós-graduação em Química

Programa de Pós-graduação em Ciências dos Materiais

Tópicos avançados em espectroanalítica e eletroanalítica – Módulo III

Gustavo Henrique Bastos da Silva

Larissa Fernanda Lima Ferreira

Líbna L. M. Claudino

Análise do artigo – “Potential for Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy

toward predicting antioxidant and phenolic contents in powdered plant matrices”

RECIFE
2021
 1. Introdução

O artigo, Potential for Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy toward predicting
antioxidant and phenolic contents in powdered plant matrices, publicado na Spectrochimica Acta Part
A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy (2020), mostra a aplicação da técnica de
espectroscopia de infravermelho médio – NIR, através de um novo método para a determinação de
agentes fenólicos e antioxidantes de 16 espécies de plantas diferentes, compreendendo 14 espécies
de 12 famílias, foram coletadas para esse estudo. A variedade das plantas analisadas provém de
espécies indianas e nativas da Austrália. No primeiro instante os autores complementam a literatura
com os seus resultados experimentais obtidos, visando a consolidação do método desenvolvido por
eles para potenciais aplicações principalmente na indústria farmacêutica, visto que a técnica não é
invasiva e é relativamente rápida. Joel Johnson et.al., sabem que a determinação de antioxidantes e
dos agentes fenólicos depende fortemente das condições selecionadas para um sistema de teste,
uma vez que os teores destas substâncias são bastante relativos e difíceis de comparar entre
laboratórios e até mesmo entre as mesmas espécies das plantas selecionadas, como cita Andlauer
W. e Héritier, J., em um trabalho que é direcionado a aplicação de técnicas eletroquímicas para
triagem rápida de agentes antioxidantes em amostras de chá; mesmo que a técnica usada por
Andlauer seja totalmente diferente da que é usada no presente artigo, NIR, pode-se observar a
abrangência desse estudo em outras áreas da química analítica.
Em relação aos reagentes utilizados, todos são de grau analítico, ou seja, possuem elevado
grau de pureza, uma vez que os analitos de interesse nas amostras são muito sensíveis a
contaminações, o que pode prejudicar o desempenho da análise. Basicamente, três principais
reagentes foram usados para o preparo e diluição das amostras das plantas liofilizadas: metanol
90%, ácido clorídrico (HCl) e carbonato de sódio, não foi mencionada a concentração destes dois
reagentes. As soluções padrão para as análises foram descritas conforme o desenvolvimento das
etapas de calibração e medição.

2. Coleta de dados FTIR

Para este trabalho os espectros no infravermelho médio foram coletados em um

espectrofotômetro com transformada de Fourier usando um espectrofotômetro Bruker Alpha FTIR.
−1
Os espectros foram gerados em faixa compreendida entre 400 a 4000 𝑐𝑚 utilizando resolução de 4
−1
𝑐𝑚 com um número de acumulações de 24 varreduras para cada espectro. Vale ressaltar que o
infravermelho médio é uma técnica fundamental para a determinação estrutural de espécies
orgânicas e bioquímicas, enquanto a transformada de Fourier possibilita a obtenção de uma melhor
relação sinal/ruído e menores limites de detecção. Portanto, O uso do infravermelho médio com
transformada de Fourier possibilita que seus espectrômetros apresentem maior sensibilidade na
conversão das frequências de infravermelho¹
 3. Extração de compostos antioxidantes e fenólicos

A extração dos compostos antioxidantes e fenólicos da matriz vegetal das plantas

selecionadas, deu-se através de um protocolo desenvolvido pelos próprios pesquisadores. Embora
cada laboratório de pesquisa adote metodologias de extração diferentes, nota-se uma similaridade na
sequência de procedimentos usados pelos pesquisados com as etapas adotadas em boa parte dos
processos de extração para compostos naturais, tais como: pesagem da matriz e determinação da
massa que será usada no processo, adição do solvente seguido do processo de agitação, cujo a
finalidade é misturar as amostras, utilização da centrífuga para separar o sobrenadante, emprego de
solventes com diferentes polaridades, devido a existência de compostos com polaridades distintas e
por fim a utilização de filtros de papéis para reter a amostra de análise.

4. Medição da capacidade antioxidante de redução cúprica

A medida da capacidade antioxidante total das amostras foi determinada pela capacidade
antioxidante redutora cúprica (CUPRAC). O reagente redox cromogênico utilizado neste método é
facilmente acessível, estável, seletivo e capaz de responder a todos os tipos de antioxidantes
biologicamente importantes. O método é baseado na medição da absorbância do quelato de Cu (I)
-neocuproína (Nc) formado como resultado da reação redox de antioxidantes de quebra de cadeia
com o reagente CUPRAC, Cu (II) -Nc, onde a absorbância é registrada no comprimento de onda de
absorção de luz máximo de 450 nm.²

5. Medição do Potencial antioxidante de redução férrico (FRAP)

Os autores não justificam o uso deste método, ressaltando somente que a análise é feita de
forma alternativa para fins de consistência e facilidade de acesso com comparação aos resultados do
CUPRAC, acrescentando que o reagente Trolox foi usado como padrão de espectroscopia na faixa
de 10–175 mg/L, porém, é mostrado que para os ensaios CUPRAC, poucos dados são encontrados
na literatura para as espécies das plantas estudadas ao passo que para o ensaio FRAP, para as
mesmas espécies, tem-se mais dados disponíveis na literatura o que permite maior respaldo na
comparação com o método estudado neste artigo. Os autores destacam que o método FRAP foi
desenvolvido por Benzie e Strain; uma análise crítica feita no artigo de Benzie e Strain, mostra que
ensaio FRAP é barato, os reagentes são simples de preparar, os resultados são altamente
reproduzíveis e o procedimento é simples e rápido, oferecendo um índice de potencial antioxidante,
ou de redução, de fluidos biológicos dentro do alcance tecnológico de todos os laboratórios, o que é
de extrema importância para o estudo de Joel e colaboradores.
 6. Medição do conteúdo de fenólicos totais

Após dos procedimentos experimentais, realizou-se a determinação do conteúdo fenólico

total utilizando para isso modificações no método Folin-Ciocalteu. O método espectrofotométrico com
reagentes de Folin-Ciocalteu é bastante utilizado na quantificação total de fenóis em amostras, pois
trata-se de um ensaio simples e reprodutível. Esses reagentes são empregados neste tipo análise,
uma vez que, constituem uma mistura de ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico que na presença
de compostos fenólicos reagem formando molibdênio azul e tungstênio azul, os quais são
identificados por espectrometria em um comprimento de onda específico, que varia de 720 a 760 nm
(VEBER; PETRINI; ANDRADE; SIVIERO, 2015). Assim, ao analisar as amostras os pesquisadores
obtiveram um absorbância de 760 nm, indicando a presença do conteúdo fenólico nas amostras.
Logo, a concentração fenólica total foi determinada em função da absorbância equivalente do ácido
−1 2
gálico na faixa de 20 a 120 mg/𝐿 (𝑅 = 0,9968).

7. Análise de dados

Para analisar os espectros de FTIR foi usado o Unscrambler X (versão 10.5; Camo ASA, Oslo,
Noruega). O pré-processamento dos espectros foi feito por várias técnicas como Suavização de
Savitzky-Golay, variação normal padrão (SNV), normalização da área de pico e a primeira e o
segunda derivada. os espectros FTIR individuais com os níveis médios de antioxidantes ou fenólicos
foram validados por regressão de mínimos quadrados parciais (PLS-R). Essas técnicas de
pré-processamento são essenciais para a precisão do modelo PLS-R. O uso deste modelo
potencializa a interpretação e modelagem do conjunto de dados sob análise. ³

8. Espectro Infravermelho Médio

Nas análises de FTIR, os autores selecionaram faixas espectrais entre 1800 e 800cm-1,
pertencente a região que houve a maioria dos picos em função da absorbância. Esta estratégia é
comum, uma vez que foi utilizado o modelo de PLS-R para a análise de dados que estão
correlacionados. Segundo Wold, S., de uma maneira geral, a regressão PLS relaciona a matriz X
(composta por variáveis de processo x) à matriz Y (composta por variáveis de produto y), permitindo
analisar dados com forte correlação, elevados níveis de ruído e desequilíbrio entre o número de
variáveis e observações. Tal regressão gera um conjunto de parâmetros que fornecem informações
sobre a estrutura e comportamento de X e Y, o que corrobora para sua ampla aplicação em
procedimentos de seleção de variáveis. No contexto em que a análise é sensível e os compostos são
reativos, evitar a inclusão de comprimentos de onda desnecessários no modelo utilizado pode gerar
dados desnecessários e/ou levar a falsas interpretações ao verificar o espectro; mesmo com estas
precauções, houve anomalias nos resultados das espécies Samadera sp. e em uma faixa espectral
da Hibiscus sabdariffa, que foram excluídas de análises posteriores.
 9. Valores fenólicos totais, CUPRAC e FRAP

Ao analisar os valores fenólicos totais encontrados em cada matriz utilizando os ensaios de

CUPRAC e FRAP observou-se em um contexto geral que os resultados obtidos foram bastantes
próximos com os valores presentes na literatura. Contudo, os autores destacam a presença de
variação nos valores para uma mesma amostra, e esta variação é associada aos procedimentos que
antecedem a análise, isto é, ao processo de extração e até mesmo o solvente empregado, pois
sabe-se que esses procedimentos podem apresentar variantes significativas no produto final,
principalmente no que tange o rendimento e pureza. Além disso, nota-se uma escassez de dados
com relação ao ensaio CUPRAC, pois apenas os valores referentes a Momordica charantia,
Pittosporum angustifolium, Citrus hystrix, Moringa oleifera foram encontrados na literatura para
suceder a comparação.

10. Predição de fenólicos totais

Neste artigo foi possível observar uma melhor validação pelo método de variação normal
padrão (SNV) obtendo um valor de R2 de 0,962, indicando linearidade bastante razoável, e uma
validação RMSE (Raiz do Erro Quadrático Médio) de 358 mg GAE 100 g−1 equivalente a 10,1%, dado
que o conteúdo médio de fenólicos totais das amostras eram de 3530 mg GAE 100 g -1. É importante
frisar que a SNV é uma ferramenta que tem como objetivo corrigir os efeitos aditivos e multiplicativos,
geralmente causados por espalhamento de radiação, desta forma, o método realiza uma
normalização pelo desvio-padrão dos valores de intensidade espectral de cada espectro precedido
de uma centralização na média do próprio espectro.4 Quando observamos a tabela 2 do artigo vemos
os valores de R2 e RMSE tanto de calibração quanto validação semelhantes do método de
normalização da área de pico quando comparado com SNV.

11. Predição de CUPRAC

É apresentada uma tabela, (Tabela 3), onde todas as derivadas e normalizações foram
distribuídas de acordo com o pré-processamento dos dados, segundo os resultados obtidos das
análises realizadas. O CUPRAC médio em todas as amostras foi de 9160 mgTE.100/g, tornando a
validação RMSE encontrada (2265 mgTE.100/g) equivalente a um valor relativo de 24,7%, o que
indicou um valor um pouco maior do que o desejável, em comparação com os resultados
encontrados para a previsão de fenólicos totais, porém os autores não descartaram o refinamento
destes dados a fim de serem usados para fins de triagem.

12. Predição de FRAP

O ensaio FRAP consiste em um método simples e automatizado utilizado para avaliar o

potencial antioxidante de amostras. Esse teste mede a capacidade de redução do ferro, assim, ao
promover a redução do íon férrico para ferroso ocorre a formação de um complexo colorido
denominado de ferroso-tripiridiltriazina (BENZIE; STRAIN, 1996). No presente estudo, o modelo
usado para determinação do FRAP foi obtido após um processo de suavização de variável normal
como método de pré-processamento. Se atentarmos a tabela 4 é possível identificar os tipos de
pré-processamento aplicados em cada amostra. Por sua vez, o conteúdo médio de FRAP
−1
determinado foi de 3230 mg TE 100 𝑔 e o RMSE relativo encontrado para validação correspondeu
a 18,7%.
Ao avaliar os picos do coeficiente de regressão referentes ao CUPRAC e FRAP, os
pesquisadores observaram que as posições eram quase idênticas, tal similaridade decorreu devido
os ensaios apresentarem as mesmas finalidades, ou seja, serem voltados a determinação do
potencial redutor de uma amostra. Os picos espectrais do FRAP foram catalogados em 1604,
−1
1523–1515, 1324, 1278–1239, 1165, 1124 e 825–814 𝑐𝑚 . Além disso, algumas associações
pertinentes a parte estrutural das amostras também foi realizada utilizados os espectros, de modo
que a maioria dos picos descritos para o CUPRAC foram associados a prováveis ligações
−1
etiológicas, já o pico localizado em 1324 𝑐𝑚 pode ser atribuído a curva proveniente de grupos
−1
hidroxilas presente em fenóis e álcoois, enquanto que o pico em 1124 𝑐𝑚 pode ser atribuído ao
trecho CO de álcoois terciários ou éteres alifáticos.

13. Discussão geral

Este artigo enfatiza o grande potencial da espectroscopia como uma ferramenta não invasiva
para auxiliar no processo de descoberta. As maiores vantagens dos instrumentos FTIR sobre os
espectrômetros dispersivos incluem uma maior velocidade e sensibilidade, melhor aproveitamento da
potência luminosa, calibração do comprimento de onda mais exata, desenho mecânico simples e a
eliminação virtual de problemas de radiação espúria e emissão IV.5
Ainda é possível aumentar a sensibilidade do método para detecção de traços de compostos
bioativos por meio da análise de amostras completamente desidratadas. Uma das desvantagens do
FTIR é analisar soluções aquosas pois a água absorve grande parte da radiação, gerando influência
da banda larga de OH, como foi possível ver na figura 1. Outra perspectiva futura que os
pesquisadores têm sobre o método, embora distante, é poder analisar amostras de plantas como
estão, sem qualquer preparação.
Neste estudo ficou constatado que a espectroscopia de infravermelho com transformada de
Fourier é uma ótima ferramenta na determinação de fenólicos totais e antioxidantes. Esta é uma
pesquisa de grande contribuição e interesse para bioprospecção no qual permite uma triagem mais
rápida de diversos tipos de espécies de plantas que podem encontrar aplicações em uma ampla
gama de indústrias.
 REFERÊNCIAS

1. Cienfuegos, F.; Vaitsman, D. Análise Instrumental. Rio de Janeiro: Interciência, 2000.

2. ÖZYÜREK, Mustafa; GÜÇLÜ, Kubilay; APAK, Reşat. The main and modified CUPRAC methods
of antioxidant measurement. Trac Trends In Analytical Chemistry, Istanbul, v. 30, n. 4, p. 652-664, abr.
2011. Elsevier BV. http://dx.doi.org/10.1016/j.trac.2010.11.016.

3. Bro, R.; Nielsen, H. J.; Savorani, F.; Kjeldahl, K.; Christensen, I. J.; Brunner, N.; Lawaetz, A.
J. Data fusion in metabolomic cancer diagnostics. Metabolomics, 9, 3-8, 2013.

4. FEARN, T. et al. On the geometry of SNV and MSC. Chemometrics and Intelligent
Laboratory Systems, v. 96, n. 1, p. 22–26, mar. 2009.

5. SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de Química Analítica, Tradução da 8ª

Edição norte-americana, Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.

Andlauer, W., Héritier, J.; Triagem eletroquímica rápida da capacidade antioxidante (RESAC) de
amostras de chá selecionadas; Vol.125, Edição 4, 15 de abril de 2011, Págs. 1517-1520.

WOLD, S.; SJÖSTRÖM, M.; ERIKSSON, L. PLS-Regression: a Basic Tool of Chemometrics.

Chemometrics Intelligent Laboratory Systems; v. 58, p. 109-130, 2001.

VEBER, J.; PETRINI, L.A.; ANDRADE, L.B.; SIVIERO, J.. Determinação dos compostos fenólicos e
da capacidade antioxidante de extratos aquosos e etanólicos de Jambolão (Syzygium cuminiL.).
Revista Brasileira de Plantas Medicinais, [S.L.], v. 17, n. 2, p. 267-273, jun. 2015. FapUNIFESP
(SciELO).

BENZIE, Iris F.F.; STRAIN, J.J.. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of
“Antioxidant Power”: the frap assay. Analytical Biochemistry, [S.L.], v. 239, n. 1, p. 70-76, jul. 1996.
Elsevier BV.