Sejam bem-vindos!!

GENÉTICA HUMANA E
MÉDICA - Unidade 3
Prof. Ma. Priscila Konrad
Tutora-Externa
APRESENTAÇÃO DA DISCIPLINA

Objetivo

 conhecer os fundamentos das principais técnicas genéticas e de

biologia molecular realizadas na rotina laboratorial;
 entender o papel da Biomedicina no campo da genética e
conhecer as principais áreas de atuação;
 compreender o fundamento de outros conceitos importantes da
genética, como a farmacogenética e os alimentos transgênicos;
 refletir criticamente sobre a importância da ética no campo da
genética.
PLANO DE ESTUDOS

 TÓPICO 1 – PRINCIPAIS TÉCNICAS GENÉTICAS E DE

BIOLOGIA MOLECULAR
 TÓPICO 2 – APLICAÇÕES DA GENÉTICA PARA O
BIOMÉDICO
 TÓPICO 3 – OUTRAS APLICAÇÕES DA GENÉTICA
CITOGENÉTICA

A citogenética molecular compreende as técnicas de hibridação in

situ por fluorescência (FISH), hibridação genômica comparativa (CGH)
e cariotipagem espectral (SKY), dentre outras (CHAUFAILLE, 2005).
Neste tópico iremos abordar a técnica de citogenética clássica e a
técnica de FISH.
CITOGENÉTICA CLÁSSICA

A citogenética clássica avalia os cromossomos a partir de células em

divisão. Para isso inicialmente são coletadas amostras de sangue,
pele ou de material obtido por amniocentese (feto) ou biopsia
(tumores), como você pode observar na Figura 1.
Ela é muito eficaz para detectar alterações numéricas e estruturais
dos cromossomos, no entanto, essa técnica possui a limitação de só
permitir a visualização de alterações maiores que 5 Mpb (5 milhões
de pares de bases), o que acaba limitando seu uso para pesquisas
mais específicas.
Além disso, é uma técnica lenta, pois requer o cultivo das células em
cultura, a preparação das lâminas e a análise dos cromossomos um a
um, o que requer pelo menos uma semana.
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU POR FLUORESCÊNCIA (FISH)

A principal vantagem da citogenética molecular,dentre elas a técnica

de hibridização in situ por fluorescência (do inglês fuorescence in situ
hybridization, FISH), é que ela permite a detecção de anormalidades
específicas, ou seja, no alvo predeterminado.
A técnica de FISH baseia-se no uso de uma sequência de bases
nitrogenadas (a qual chamamos de sonda ou, em inglês, probe) que é
complementar ao DNA alvo que se pretende analisar.
Assim, o termo hibridização refere-se à utilização dessa sonda
contendo a sequência conhecida de nucleotídeos que é
complementar a sequência de DNA que se deseja pesquisar
Na Figura 2 você pode observar as etapas principais da hibridização
por FISH.
Como é possível utilizar sondas marcadas com diferentes fluoróforos,
é possível localizar vários genes de interesse simultaneamente.
Além disso, tem a vantagem de ser uma técnica rápida, específica e
sensível (NEVES; GUEDES, 2012; MENCK; SLUYS, 2017).
A técnica de FISH é muito utilizada na clínica, tanto para detectar
anomalias genéticas quanto somáticas.
Pela técnica de FISH com a utilização de duas sondas diferentes (uma
emitindo fluorescência verde e a outra emitindo fluorescência
vermelha) é possível observar os genes BCReABL normais
(representados pelas fluorescências verde e vermelha,
respectivamente) e o gene fundido BCR/ABL representado pela
sobreposição das duas fluorescências.
Além da técnica de FISH, outras técnicas de citogenética molecular se
destacam:
 técnica de cariótipo espectral (SKY),
 técnica de hibridização genômica comparativa (CGH)
 técnica de hibridação genômica comparativa por micro arranjos
(CGH-array),

A técnica de SKY permite observar simultaneamente os 24 pares de

cromossomos através de um coquetel de sondas que identificam
cada par de maneira diferenciada.
Esse coquetel é formado por uma mistura de cinco fluorocromos
com diferentes espectros e as imagens são adquiridas em um
microscópio de epifluorescência.
A técnica CGH consiste na marcação do DNA do paciente com um
fluorocromo verde e, então, na sua mistura com DNA controle
marcado com um fluorocromo vermelho.
A proporção de fluorescência verde e vermelha, ou seja, a razão
entre a intensidade do sinal obtido entre a amostra-teste e o
controle, possibilita identificar pequenos segmentos de DNA
deficientes (microdeleção) ou em excesso (microduplicação).
A diferença essencial entre o CGH e o CGH-array é que a primeira é
realizada em células em divisão, enquanto que a segunda usa a
hibridização com uma série de sequências genômicas conhecidas e
fixas em uma lâmina
Atualmente há uma tendência mundial em se utilizar o CGH-array
como primeiro exame de investigação genética em crianças com
anomalias congênitas e déficit cognitivo, pois este é um método
sensível que permite detectar um maior número de anormalidades
cromossômicas (na ordem de 20%, contra 3% usando cariótipo
convencional).

As principais desvantagens dessas técnicas de citologia molecular é

que elas requerem kits e equipamentos próprios, além de
profissionais treinados, o que aumenta o custo dos exames e limita
seu uso.
BIOLOGIA MOLECULAR

A Genética Molecular é baseada no ramo da Biologia chamado

Biologia Molecular, que estuda as interações bioquímicas e
envolvidas na duplicação do material genético e na síntese proteica.

Os exames realizados por Biologia Molecular funcionam basicamente

pela amplificação do DNA do material a ser estudado, são altamente
sensíveis e específicos e esta é uma das áreas de maior potencial para
a realização de pesquisas na área clínica.

Algumas das técnicas utilizadas em biologia molecular com aplicações

na genética: a extração do DNA, a eletroforese de proteínas, a
reação em cadeia da polimerase (PCR) e o sequenciamento.
EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA/RNA

A alternativa que vem sendo cada vez mais utilizada por ser um
método não invasivo é a extração de material genético a partir de
raspado bucal.
Após a obtenção do material, a extração e purificação dos ácidos
nucleicos podem ser realizadas por protocolos que utilizam reagentes
preparados no próprio laboratório (o que chamamos de métodos in
house) ou através do uso de kits comerciais.
Em geral, todos os protocolos de extração de DNA envolvem as
seguintes etapas:
 Rompimento das membranas: primeiramente é preciso isolar as
células nucleadas do tecido (quando necessário) e realizar o
rompimento das membranas celular e nuclear para expor o DNA.
A lise de membranas celulares é realizada com soluções
detergentes que desestabilizam os lipídios das membranas,
liberando os ácidos nucleicos.
 Ligação à sílica: em todos os kits são utilizadas membranas ou
colunas de sílica nas quais o DNA se liga, o que permite a
retenção e concentração do material.
 Lavagens: uma vez que o DNA se ligou à sílica é preciso eliminar
as demais substâncias presentes na amostra. Essa etapa de
purificação é feita com sucessivas centrifugações a fim de
eliminar proteínas e gorduras contaminantes e de deixar apenas a
sílica com DNA.
Os restos celulares precipitam para o fundo do tubo após a
centrifugação, assim o sobrenadante contendo os ácidos nucleicos é
transferido para outro tubo no qual será adicionado etanol 70%.

 Eluição: agora que os resíduos da amostra já foram removidos na

etapa anterior, o último processo consiste em liberar o DNA da
sílica. O resultado deste processo é a obtenção do DNA isolado e
purificado.
ELETROFORESE

A eletroforese é uma das principais técnicas utilizadas em biologia

molecular e foi proposta pela primeira vez em 1937 pelo bioquímico
Arne Tisélius.
Ela permite a separação e a identificação de macromoléculas como
DNA, RNA e proteínas.
O princípio da técnica de eletroforese consiste na migração das
moléculas presentes em um gel de acordo com o seu tamanho (peso
molecular) e carga elétrica durante a aplicação de uma diferença de
potencial (corrente elétrica), conforme pode ser observado na Figura
5.
Em 1975, o pesquisador Ed Southern publicou um método
revolucionário que permitia localizar genes importantes em
fragmentos de DNA separados por eletroforese em gel.
O diferencial dessa técnica é que, após a separação, as moléculas de
DNA eram transferidas para membranas de nitrocelulose ou náilon, o
que permitia sua marcação com sondas fluorescentes.
Esse processo de transferência do DNA do gel para a membrana foi
chamado de Southern blot (Figura 6).
Alguns anos depois foi desenvolvida uma técnica similar de detecção
de moléculas de RNA chamada Northern blot.
O uso de RNA no lugar de DNA permitia a análise da expressão dos
genes em diferentes circunstancias, porém, como o RNA é muito
mais sensível à degradação, era preciso ter maior cuidado para evitar
contaminações.
Finalmente, uma técnica que permitia a análise de proteínas foi
desenvolvida: ela recebeu o nome de Western blot e é
extremamente importante para a pesquisa e para a clínica.
O western blot, através do uso de anticorpos primários e secundários
específicos, permite identificar a expressão de uma infinidade de
proteínas.
REAÇÃO EM CADEIRA DA POLIMERASE (PCR)

Um marco essencial para a aplicação dos fundamentos de biologia

molecular na rotina laboratorial foi o desenvolvimento da técnica da
reação em cadeia da polimerase (do inglês, Polymerase Chain
Reaction — PCR).
O fundamento da PCR consiste na multiplicação de qualquer região
do genoma em milhões de cópias através da enzima DNA polimerase,
o que permite o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico muito
mais sensíveis e específicas.
Atualmente, a PCR possui inúmeras aplicações em diversas áreas da
pesquisa e da clínica e, no âmbito da genética, permite a
identificação de mutações e/ou polimorfismos em amostras
biológicas de pacientes.
Para que se possa amplificar um segmento de DNA específico na qual
se suspeite que haja a presença de uma mutação, é necessário saber
as partes finais da sequência de nucleotídeos.
Sabendo disso, a reação de PCR é preparada a partir dos seguintes
componentes:
 uma solução contendo a amostra de DNA que se quer amplificar,
chamado DNA alvo (esse DNA pode ser extraído de amostras de
sangue, de culturas de microrganismos, de espécimes clínicos, de
plantas etc.);
 uma enzima DNA polimerase estável ao calor (chamada Taq
polimerase) que sintetiza novas fitas de DNA a partir da adição de
novos nucleotídeos complementares ao DNA alvo;
 quatro tipos de nucleotídeos com as bases nitrogenadas A, T, C e
G (chamados de dNTPs), essenciais para a formação de novo DNA;
 dois oligonucleotídeos chamados primers que são sequências de
nucleotídeos complementares às duas extremidades (5’ e 3’) do
fragmento de DNA a ser amplificado. Os primers são sintetizados
em laboratórios especializados e comprados para serem usados
na técnica;
 tampão de reação que fornece as condições de pH ideais para a
reação, além de cofatores como o cloreto de magnésio.
 Após o preparo da mistura para a reação, a amostra é colocada
em um aparelho chamado termociclador que realiza uma série
repetida de ciclos térmicos (em média de 30 a 40 ciclos)
alternando entre temperaturas altas e temperaturas mais baixas.
A técnica de PCR constitui-se de uma série repetida de ciclos
envolvendo os seguintes passos:
1. Desnaturação do DNA: o aquecimento da reação a 90-95 °C pelo
termociclador resulta na quebra das pontes de hidrogênio da
molécula de DNA, o que faz com que ele perca sua estrutura de
dupla-hélice, abra as fitas duplas e passe a se apresentar como duas
fitas simples.
2. Anelamento (hibridização dos primers): a reação é resfriada para
permitir a ligação do primer com o DNA alvo de fita simples. Cada
primer possui uma temperatura de anelamento ideal específica de
acordo com a sua composição em pares de base. Assim, a
temperatura dessa fase é variável e sempre irá depender do ponto de
fusão (Tm, do inglês melting temperature) do primer usado.
3. Extensão do DNA: a síntese de novo DNA a partir do molde da fita
simples original ocorre com o aquecimento da solução a 72 °C,
temperatura ótima para a Taq DNA polimerase. A enzima sintetiza a
nova fita a partir dos dois primers de oligonucleotídeos usando os
nucleotídeos (dNTPs) que foram adicionados ao tampão e que são
sempre complementares à fita-molde. Dessa maneira, são formadas
novas fitas de DNA de dupla hélice, correspondente a região-alvo de
amplificação (delimitada pelos primers).
Após o término de um ciclo (desnaturação, anelamento e extensão),
todo o processo é repetido várias vezes até que se obtenha grande
quantidade do DNA a ser amplificado. A cada ciclo de amplificação, o
número de cópias da sequência-alvo é duplicado e, com a evolução
dos ciclos da reação, ocorre aumento exponencial do número dessas
sequências. O aumento do número de ciclos não é aconselhado, em
decorrência da redução da especificidade da reação.
VARIAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR

1. RT-PCR: o nome RT-PCR deriva do princípio da técnica que consiste

em uma reação da enzima transcriptase reversa seguida de reação
em cadeia da polimerase. Em outras palavras é uma PCR realizada a
partir de uma molécula de RNA mensageiro (mRNA). Como o mRNA
é uma molécula instável, é preciso usar a enzima transcriptase
reversa para sintetizar uma fita de DNA complementar (chamada
cDNA) a ela. Para isso são usados primers especiais constituídos
apenas de uma sequência de nucleotídeos T (chamados primers oligo
dT) que irão se ligar à terminação poli A do mRNA e, assim, obter o
cDNA (para revisar a estrutura do RNA e do DNA, acadêmico, revise a
Unidade 1 deste livro). Após a obtenção do cDNA é feita uma reação
de PCR normal (Figura 8).
2. PCR Multiplex: é uma variação da técnica normal de PCR, na qual
são amplificados simultaneamente mais de um fragmento de DNA
em um mesmo tubo de reação. Neste caso, são utilizados mais de um
par de primers que hibridizam em regiões distintas do DNA. A PCR
multiplex permite, assim, a detecção de múltiplas mutações em uma
única análise.
3. Nested PCR: é uma variação usada para aumentar a sensibilidade
e a especificidade do DNA amplificado. Nessa técnica são utilizados
dois grupos de primers em duas reações sucessivas. Na primeira PCR
usa-se o primeiro par de primers; o produto gerado pode conter
regiões amplificadas que não faziam parte do DNA alvo (devido a
reações inespecíficas). O produto da primeira PCR é então utilizado
como modelo para a segunda PCR usando o segundo par de primers
e aumentando a especificidade da reação.
4. PCR em tempo real (qPCR): também chamada de PCR
quantitativa, a qPCR permite a coleta de dados durante a
amplificação do DNA e não apenas no final do processo como a PCR
tradicional. Isso é possível graças ao uso de corantes que se ligam ao
DNA, como o corante SYBR Green ou, de maneira ainda mais
específica, com o uso de sondas especiais ligadas à enzima Taq DNA
polimerase (sondas TaqMan). Assim, a qPCR combina a técnica de
PCR convencional (que consiste na amplificação do DNA) com uma
técnica de detecção e quantificação desse DNA por fluorescência.
Todos esses processos ocorrem de forma simultânea em uma única
etapa, o que permite obter resultados mais rápidos e com maior
precisão.
SEQUENCIAMENTO

A técnica de sequenciamento tradicional é feita pelo método de

Sanger (Figura11)queconsistenaincorporaçãoaleatóriadeddNTPs
(dideoxinucleotídeos trifosfatos) em uma fita de DNA alvo pela
enzima DNA polimerase. A diferença entre ddNTPs e dNTPs é que os
primeiros não possuem uma hidroxila na região 3’ o que paralisa a
síntese sempre que um ddNTP é incorporado, resultado na formação
de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos.
CLONAGEM

Em 1997, quando cientistas anunciaram a clonagem da ovelha Dolly,

o assunto virou uma notícia de grande impacto mundial. A Dolly, é
um processo muito mais complexo e que só foi possível com o
avanço da engenharia genética e da biotecnologia.
Na biologia molecular, clonagem consiste na produção de cópias
exatas de um gene, ou seja, é uma técnica que replica o DNA
desejado diversas vezes para gerar um número enorme de cópias
idênticas. O primeiro evento básico de uma experiência de clonagem
é a extração do DNA a ser clonado através de técnicas semelhantes a
que você estudou no início desta unidade. Com o DNA extraído, as
demais etapas da clonagem serão descritas a seguir e apresentadas
na Figura 12.
DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS

Apesar do avanço das técnicas de citogenética e biologia molecular,

é importante lembrar que algumas doenças genéticas podem ser
diagnosticadas com simples exames bioquímicos.
Por exemplo, uma criança com atraso no desenvolvimento e
características faciais específicas pode ser suspeita de ter uma
doença autossômica recessiva chamada mucopolissacaridose.
Em outros casos, o médico pode suspeitar de uma anormalidade
cromossômica ao detectar, por exemplo, alterações físicas
compatíveis com síndrome de Down em um bebê.
Alterações cromossômicas também podem ser detectadas pela
técnica de hibridização com sondas fluorescentes de FISH.
O diagnóstico de Síndrome de Down por FISH, por exemplo, utiliza
sondas marcadas com sequências de nucleotídeos complementares
a regiões do cromossomo 21.
A presença de três cromossomos marcados no microscópio de
fluorescência confirma o diagnóstico (BROWN, 2009), como você
pode ver na Figura 13.
A técnica de FISH é também muito utilizada no diagnóstico de
síndromes congênitas causadas por microdeleções, perdas tão
pequenas de parte do DNA de um cromossomo que não são
detectadas pela cariotipagem clássica.
Um exemplo é a síndrome Lissencefalia-Miller Dieker, causada por
microdeleções no braço curto do cromossomo 17.
Junto com FISH e CGH-array, as técnicas de PCR e sequenciamento
são as mais utilizadas no diagnóstico de doenças e alterações
genéticas, como a fibrose cística.
Doenças genéticas que podem ser detectadas por diagnóstico
molecular são (FLEURY, 2008):

 Esclerose lateral amiotrófica — ELA;

 Cânceres — mama, cólon e próstata;
 Intolerância à lactose;
 Doença — Alzheimer e Parkinson;

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL
TESTE DE PATERNIDADE Sabendo que ela recebe de cada
genitor um cromossomo de cada
par de cromossomos homólogos,
cerca de metade dos marcadores
do seu perfil provém de sequências
de DNA herdadas da mãe, e a
outra metade, do pai. Assim,
quando os perfis são comparados,
todas as bandas no perfil de DNA
da criança devem estar presentes
nos perfis de DNA combinados dos
pais biológicos. Diante disso,
podemos afirmar que o pai
biológico da criança do exemplo é
o número 2.
ANÁLISE FORENSE

A chamada Ciência Forense é uma área de atuação interdisciplinar

que utiliza diversos conhecimentos científicos e técnicas
especializadas para solucionar questões legais.
No caso de estupros, por exemplo, é possível identificar o DNA do
sêmen deixado na vítima, enquanto que o sangue de uma faca usada
em um assassinato pode identificar o DNA do agressor.
Até um fio de cabelo ou raspados de pele podem ser utilizados, pois
basicamente qualquer material é capaz de fornecer DNA para análise.
A Figura 17 mostra o tipo de perfis de STR usados em processos
judiciais. Quatro lócus estão sendo comparados na figura (VWA,
TH01, TPOX e CSF1PO) e, comparando os perfis de fluorescência
mostrados no gráfico, podemos ver que o DNA obtido do sangue
encontrado na cena do crime corresponde ao perfil do Suspeito 2,
mas não ao perfil do suspeito 1.
É importante lembrar que esse resultado não é suficiente para
afirmar que o Suspeito 2 cometeu o crime, mas indica que, pelo
menos, ele esteve na cena do crime.
REPRODUÇÃO HUMANA
TERAPIA GÊNICA

A terapia gênica pode utilizar técnicas físicas (Ex.: biobalística),

químicas (Ex.: lipossomos) e/ou biológicas (Ex.: vetores virais) para
inserir o transgene no alvo e pode ser realizada in vivo ou ex vivo.

A seguir iremos conhecer algumas etapas dessa técnica:

1ª ETAPA – Isolar o gene;

2ª ETAPA – Definir se a técnica será in vivo ou in vitro;
3ª ETAPA – Introdução do gene na célula-alvo;
4ª ETAPA – Produção das células com DNA recombinante;
5ª ETAPA – Introdução das células no paciente;
A Farmacogenética e a Farmacogenômica são as ciências que
estudam a variabilidade das respostas a fármacos em função das
variações genéticas dos indivíduos.
Dessa forma é possível identificar quais medicamentos serão mais
efetivos para um paciente específico baseado nas suas características
genética, permitindo a individualização do tratamento.
A Nutrigenômica tem o objetivo de estabelecer dietas
personalizadas, com base no genótipo de cada indivíduo, para a
promoção da saúde e redução do risco de doenças crônicas, como o
câncer.
Hoje são conhecidos mais de 200 genes relacionados ao desempenho
físico humano.
Esse conhecimento pode ser aplicado em atletas de alto rendimento,
selecionando potencialidades e prevenindo lesões, porém, também
pode ser utilizado, de forma ilegal, no doping genético.
Alimentos transgênicos são organismos que, através de técnicas de
engenharia genética, receberam genes de outro organismo a fim de
melhorar as características do alimento original, como torná-lo
resistente a pragas.
Os avanços recentes em Genética, Biologia Molecular, Biotecnologia
e Engenharia Genética possibilitaram o avanço de técnicas
laboratoriais que permitiram aos cientistas manipular o DNA de
plantas, animais e mesmo de seres humanos, com o objetivo de
alterar suas características originais.
A Bioética busca aplicar a ética no contexto da biomedicina e da
tecnologia para proteger a vida e a dignidade humana, o meio-
ambiente e o futuro do planeta.
 Dica para um bom estudo:

• Ler os tópicos mencionados em aula, com calma e tentando entender seu significado;
• Estudar pelo menos uma hora por dia;
• Realizar meu próprio resumo ;
• Realizar a prova com calma também;