Laboratório de Virologia

e de Micologia Clínica
Introdução ao Estudo de Virologia e Micologia Clínica

Responsável pelo Conteúdo:

Prof. Me. Elias da Rosa Hoffmann

Revisão Textual:
Prof. Me. Claudio Brites
 Introdução ao Estudo de
Virologia e Micologia Clínica

• Biossegurança em Laboratório de Virologia

Clínica e em Laboratório de Micologia Clínica;
• Conceito, Aplicabilidade e Importância do
Diagnóstico Molecular na Área da Saúde;
• Aspectos Gerais do Diagnóstico Imunológico/Sorológico.

OBJETIVOS

DE APRENDIZADO
• Apresentar conceitos gerais aplicados em diagnóstico molecular e em diagnósticoimunológico;
• Aprender as metodologias mais utilizadas para os setores de biologia molecular e imunolo-
gia voltados para o diagnóstico em virologia e micologia;
• Correlacionar o quadro clínico encontrado com os exames solicitados, além de possibilitar a
interpretação de método utilizado nesse caso.
UNIDADE Introdução ao Estudo de Virologia e Micologia Clínica

Biossegurança em Laboratório de Virologia

Clínica e em Laboratório de Micologia Clínica
De acordo com Programa Nacional de Controle de Qualidade (PNCQ) e a Fiocruz, os
laboratórios para Micologia são enquadrados como nível de biossegurança N2, nos quais
são feitos diversos testes para a identificação, o cultivo e a sensibilidade a antifúngicos.
Já o laboratório para Virologia é considerado com o nível de biossegurança N3, pois os
vírus são considerados potencias patógenos e há a necessidade de um rigoroso controle
para a manipulação dos mesmos.

Saiba mais sobre o assunto lendo a matéria “Níveis de Biossegurança”., disponível

como Material Complementar ao fim desta unidade.

A seguir, estudaremos os aspectos gerais do Diagnóstico Molecular.

Conceito, Aplicabilidade e Importância do

Diagnóstico Molecular na Área da Saúde
Diagnóstico Molecular
Com os avanços das tecnologias para a área da saúde e a engenharia biomédica, a
biologia molecular é uma ferramenta que está em constante desenvolvimento. Alguns
laboratórios têm seus setores específicos para esse tipo de metodologia molecular, mas
sabemos que esse é um setor que demanda tempo, estudo e investimento.

Hoje a utilização de métodos moleculares serve para auxílio do diagnóstico e prog-

nóstico na patologia clínica. O nome diagnóstico molecular baseia-se na ideia de identi-
ficar moléculas genômicas, ou seja, material genético contido em amostras de diversos
materiais (sangue, soro, plasma, tecido, liquido cefalorraquidiano etc.)

Nesse contexto, são diversos os patógenos que só podem ser identificados ou diag-
nosticados por meio de métodos moleculares, como exemplo podemos citar micror-
ganismos não cultiváveis, os quais, mesmo com o advento de novos meios de cultura
para o crescimento e enriquecimento, não foram possíveis ainda isolar na microbiologia
clássica. Mutações autossômicas ou ligadas ao cromossomo sexual também podem ser
diagnosticadas utilizando métodos moleculares, além disso, a identificação de vírus e de
alguns microrganismos dependentes da maquinaria celular hospedeira, em sua maioria,
necessita de técnicas moleculares para acontecer.

Também é um campo para identificação de genes responsáveis por resistência a

fármacos. Com o diagnóstico molecular, pode-se identificar e separar essas resistências
que não podem ser visualizadas nas metodologias clássicas de microbiologia.

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Comparação entre diagnóstico convencional e molecular
Mesmo com os avanços tecnológicos, não podemos substituir totalmente a microbio-
logia clássica pela molecular. Contudo, mesmo assim podemos adaptar diversas formas
de identificação e diagnóstico.

Atualmente, temos diversas metodologias moleculares que auxiliam e determinam

patógenos e patologias, mas ainda assim é necessário fazer a identificação clássica
e clínica, como podemos observar em casos de identificação de microrganismos
saprófitos e colonizadores em amostras clínicas sem importância clínica para o quadro
do paciente.

Podemos usar como exemplo uma amostra de líquido cefalorraquidiano coletado

para pesquisa de bactérias em meningites bacterianas. Na prática clínica, o comum de
aferirmos nesse tipo de meningite são os seguintes elementos: diversos polimorfonu-
cleares, presença de proteinorraquia aumentada e muitas vezes glicorraquia diminuída
– esse é um quadro comum de meningite bacteriana. Após a coloração de Gram, que
é utilizada na microbiologia clássica, podemos separar entre Gram positivos e Gram
negativos os microrganismos encontrados para continuarmos na identificação do pos-
sível patógeno.

Seguindo o fluxo de identificação, após a coloração de Gram, é possível escolher os

meios de culturas mais condizentes com o possível microrganismo encontrado. Então,
utilizam-se técnicas de microbiologia clássica para a semeadura do material e, em segui-
da, a identificação, dependendo do crescimento; mas isso pode levar dias.

Com o advento da biologia molecular para identificação do microrganismo, podemos

em algumas horas fazer a identificação desses e, dependendo, a da resistência a alguns
fármacos. Contudo, o custo para as análises moleculares ainda é mais elevado do que
as metodologias convencionais e, em alguns casos, os planos de saúde não cobrem esse
custo. Além disso, hoje em dia existem métodos de identificação baseados em testes
imunológicos que facilitam em alguns casos a identificação rápida e confiável.

Desvende como funciona a coloração de Gram de acordo com o tamanho da parede celular
das bactérias. Por que chamamos de Gram positivas e Gram negativas?

O dogma fundamental da biologia molecular

Em 1958, Francis Crick descreveu o dogma da Biologia molecular onde o DNA (Áci-
do desoxirribonucleico) é transcrito para um RNA (ácido ribonucleico) e, a partir desse,
ocorre a tradução para uma proteína. Com os anos, foram sendo descobertas proteínas
e como funciona a replicação para a conservação do DNA, a transcrição e a transcrição
reversa em seguida, o processamento para remoção dos íntrons, permanecendo os
exons e, após, a tradução para uma proteína.

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Figura 1 – Dogma da Biologia Molecular

Fonte: Adaptada de Wikimedia Commons

Sabendo sobre essa conversão, podemos trabalhar na biologia molecular com técnicas que
possibilitam a conversão de um RNA para um DNA complementar (cDNA), entre outras.

Para mais informações, faça leitura da apostila de biologia molecular “Unidade:

Dogma central (DNA a RNA a proteína)”. Disponível como Material Complementar
ao fim desta unidade.

Procedimentos de biotecnologia e conhecimento

de ferramentas moleculares aplicadas ao diagnóstico
Com o avançar da tecnologia, podemos desenvolver diversas metodologias mole-
culares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sequenciamento de genes
lamp etc. Com o advento no final dos anos 1980 e começo dos anos 1990 da Bioin-
formática, isso facilitou entender os processos moleculares juntando a informática com
ciências biomédicas.

Hoje o principal método utilizado na biologia molecular para identificação de fungos

ou vírus é a PCR (polimerase chain reactio), no qual podemos amplificar o material
genético e, dependendo da metodologia, quantificar a carga fúngica ou viral encontrada
em amostras clinicas. Utilizando a técnica de PCR, podemos seguir um fluxo de etapas
para conseguirmos identificar o microrganismo de interesse:

Extração do material genético

O objetivo dessa etapa é destruir a camada, membrana e/ou parede celular, para
conseguirmos ter acesso ao material genético. Além disso, dependendo do processo de
extração, podemos fazer diversos protocolos com o objetivo de eliminar os interferentes
e inibidores que podem atrapalhar a amplificação do material genético.

Amplificação do material genético

Nessa etapa, utilizamos enzimas polimerases com cofatores para copiar o gene de
interesse que buscamos. Durante esse momento, separamos por ciclos de três estações:
Desnaturação, Anelamento e Polimerização.

Para auxiliar no entendimento desse processo, assista ao vídeo “Reação em cadeia da

polimerase (PCR)”. Disponível como Material Complementar ao fim desta unidade.

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 Dependendo do equipamento e da técnica utilizada, temos dois tipos: PCR con-
vencional, que necessita de um pós-processamento com a visualização do gel de
eletroforese ou poliacrilamida; PCR em tempo real, no qual podemos acompanhar
a amplificação em tempo real através da fluorescência emitida por sondas ou inter-
calantes de DNA.

Com a tecnologia empregada no aprimoramento e desenvolvimento de novas meto-

dologias, houve um grande crescimento nessa área. Com isso, foi possível a utilização de
enzimas que clivavam DNA e, assim, a clonagem de fragmentos importantes.

Para entender melhor a clonagem, assista ao vídeo “Clonagem de DNA e DNA re-
combinante”. Disponível como Material Complementar ao fim desta unidade.

Definição de sequência alvo no diagnóstico molecular

Primeiramente buscamos referencias na literatura para compreender melhor o pa-
pel da proteína envolvida e o gene que é responsável pela informação. Sabendo qual
é o gene, vamos em busca da sequência através da bioinformática no banco de genes
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool); a partir da sequência identificada, utili-
zamos ferramentas da bioinformática para desenhar os oligonucleotídeos iniciadores,
dependendo de qual das metodologias moleculares utilizaremos.

Aspectos gerais no diagnóstico molecular de

infecções virais e na detecção de fungos
Dados clínicos que são cruciais para entendermos o possível microrganismo: o
sito da infecção, o material destinado para a análise e como o material se encontra,
conservação da amostra, qual o possível microrganismo. Parecem perguntas óbvias,
mas a necessidade de detalhes minuciosos sobre a amostra pode fazer grande dife-
rença no resultado.

O sito da infecção é necessário para uma investigação mais abrangente. Podemos

usar como exemplo um lavado brocoalveolar, suspeitando de uma bola fúngica vista em
exames de imagem. O que se espera é um paciente imunocomprometido e provável
aspergilose, ou até mesmo padrão miliar no pulmão, uma suspeita de histoplasmose
disseminada. A preocupação no tipo de material e como esse está acondicionado é ex-
tremamente relevante, pois temos diversas DNAases e RNAses que degradam o material
genético, podendo diagnosticar erroneamente um paciente como falso-negativo. Outro
problema é em qual meio ocorrem essas amostras – exemplo, meios que contenham
formaldeído podem inibir a reação em cadeia da polimerase.

Uma possível ideia sobre qual microrganismo estamos buscando é essencial para sua
identificação. Além das informações clínicas, como a biologia molecular trabalha com
oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada microrganismo, é necessário termos
uma ideia de qual possível patógeno está acometendo esse paciente.

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Procedimentos operacionais padrão de diagnóstico molecular.

Padronização de exames moleculares, validação e acreditação
O laboratório de biologia molecular no Brasil é algo novo ainda, quando fazemos
uma comparação com outros países desenvolvidos. Por isso a necessidade de padroni-
zação e validação segue aos critérios de cada lugar ou órgão responsável pelas aferições.

Para compreender qual seria o ideal para montar um teste molecular e disponibili-
zá-lo para a comunidade, o artigo “Validation of Laboratory-Developed Molecular
Assays for Infectious Diseases” auxilia a validar o método molecular para utilização
de testes moleculares em doenças infecciosas. Disponível como Material Comple-
mentar ao fim desta unidade.

Entretendo, existem programas de acreditação e controle de qualidade que estão

atualmente trabalhando para uma segurança maior com os laboratórios que utilizam o
diagnóstico molecular em sua rotina – os principais são o Programa de Acreditação de
Laboratórios Clínicos (PALC), Programa Nacional de Controle de Qualidade (PNCQ)
e ControlLab.

Normas requeridas para a montagem

de um laboratório molecular
Como discutido antes, os laboratórios de biologia molecular ainda são novos no Bra-
sil, por isso a preocupação dos patologistas clínicos é com a contenção desses micror-
ganismos que serão trabalhados no local. É sugerido para os locais nos quais ocorre
esse tipo de análise separar as salas por etapas do processamento da amostra, com um
sentido único, ou seja, nunca voltar com a amostra para o setor inicial.

Setores sugeridos
• Setor de Extração: necessário um setor exclusivo para recebimento de amostras, o
qual esteja interligado por uma passadeira de materiais entre o setor de reagentes.
Nesse setor, são feitos os processos de extração do material genético, o ambiente
deve ser controlado como laboratório de nível de biossegurança 3. Deve conter
câmaras ou estufas para cultivo celular;
• Setor de Reagentes: deve ter conexão com a passadeira para o setor de PCR e outra
para o setor de extração. Nele não podem entrar amostras sem estarem extraídos o
seu material genético. Este setor é exclusivo para misturas e preparos de reagentes
para a PCR e para outros que não podem ter contato direto com a amostra;
• Setor de PCR ou Amplificação: no qual permanecem os termoblocos e as máqui-
nas para amplificação em tempo real ou convencional. Nesse local é feita a amplifica-
ção do material genético, gerando diversas cópias do gene alvo que buscamos. Caso

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 o setor tenha aparelhos de amplificação em tempo real, não é necessário o pós-pro-
cessamento, pois a amplificação pode ser acompanhada no próprio equipamento;
• Setor de eletroforese e câmara escura: este setor é exclusivo para locais
nos quais se faz uso do PCR convencional e de algumas outras técnicas que
têm a necessidade de eletroforese e revelação do gel em câmara escura.

• O que é Bioinformática?
• O que são e para que servem os oligonucleotídeos iniciadores?
• Por que necessitamos fazer uma transcrição reversa em moléculas de RNA para a metodo-
logia de reação em cadeia da polimerase?

Aspectos Gerais do Diagnóstico

Imunológico/sorológico
É fundamental compreender o conceito, a aplicabilidade e importância do Diagnós-
tico Imunológico/sorológico na área da saúde. O diagnóstico imunológico se baseia na
interação de um anticorpo com um antígeno especifico, formando o que chamamos de
modelo “chave-fechadura”. Podemos utilizar diversas metodologias nesse tipo de modelo
e uma das mais utilizadas é o método de imunoensaio enzimático conhecido como mé-
todo de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).

Alguns outros testes também se enquadram no laboratório de imunologia, como tes-

tes utilizando proteínas ligas ao látex, imunodifusão, imunofluorescência, radioimunoen-
saio, quimioluminescência e eletroquimioluminescência. Os testes utilizados no setor de
imunologia/sorologia são essenciais para a identificação de anticorpos por contato com
algum antígeno ou mesmo com vacinas; além disso, podem detectar o próprio antígeno
no patógeno.

Para entender como funciona a metodologia de ELISA, assista ao vídeo “Teste de

ELISA”, disponível como Material Complementar ao fim desta unidade.

Comparação entre diagnóstico molecular

e diagnóstico Imunológico/sorológico
Os testes imunológicos e moleculares corriqueiramente são comparados em artigos,
mas lembramos que um detecta o material genético e outro detecta partículas internas
ou externas de um microrganismo. Podemos fazer ainda a comparação principalmente
com a presença do material genético com a memória imunológica, correlacionando as
duas metodologias para um melhor diagnóstico.

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UNIDADE Introdução ao Estudo de Virologia e Micologia Clínica

Metodologias clássicas e avançadas utilizadas

na detecção de proteínas em laboratórios clínicos
Existem diversas metodologias utilizadas no laboratório de Imunologia/sorologia para
a detecção de antígenos na imunologia. A seguir, descreveremos algumas delas.
• ELISA: Metodologia muito utilizada, que se baseia na ligação de anticorpos com
antígenos (Ac/Ag) ou anticorpo com anticorpo (Ac/Ac) junto com um substrato que
dará a coloração para ser feita a leitura visual ou, com o auxílio de um equipamento,
a quantificação;

Figura 2 – Tipos de ELISA

Fonte: Wikimedia Commons

• Latex: Testes utilizando uma molécula de látex, também são chamados de testes
de aglutinação. Utilizados como testes para identificação rápida a diversos tipos
de patógenos;
• Imunodifusão: Utilizado na microbiologia, é identificada a presença de anticorpos
que tiveram contato com o antígeno de um microrganismo – infelizmente, como
o teste apresenta baixa sensibilidade e especificidade, está caindo em desuso para
alguns tipos de detecção.

Apresentação de epítopos para reconhecimento humoral

Os microrganismos têm em sua parede ou membrana proteínas que são reconheci-
das por anticorpos, esses são os chamados epítopos. Para que um patógeno seja reco-
nhecido, deve expor essas proteínas de superfície, assim, nosso sistema imunológico
identifica um material desconhecido e exógeno, podendo gerar anticorpos específicos
para tal epítopo.

Nosso sistema imunológico tem duas respostas: a inata e adaptativa. No caso da

adaptativa, temos a formação dos anticorpos específicos para o patógeno que está aco-
metendo ao paciente.

Para entender melhor como são formadas essas respostas do sistema imunológico,
leia o artigo “Sistema imunológico”, e assista ao vídeo “Tipos de resposta imune:
inata e adaptativa, humoral vs. mediada por células”, ambos disponíveis como Ma-
teriais Complementares ao fim desta unidade.

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Pesquisa de antígenos circulantes
Hoje existem diversos testes imunológicos que podemos trabalhar para buscar antí-
genos circulantes no soro, urina e em outros fluidos do paciente. O principal teste é o
ELISA, com o qual buscamos encontrar por meio da conjugação do anticorpo marcado
com o antígeno. Assim, podemos expressar um valor com pontos de corte para estabe-
lecer se o paciente está infectado ou não por um determinado patógeno.

Figura 3 – Resposta Imunológicas inata e adaptativa

Fonte: ABBAS, et al., 2012

Expressão heteróloga de proteínas e produção de anticorpos

Na Biotecnologia, podemos trabalhar com proteínas exógenas em uma determinada
célula, ou seja, podemos inserir a informação de uma proteína em uma célula para que
essa célula fabrique essa proteína heteróloga.

Esse processo é feito utilizando um vetor, clivando uma região na qual haja alta pro-
dução de proteínas e inserindo-o na região de interesse.

Para entender melhor como funciona a produção de uma proteína heteróloga, as-
sista ao vídeo “Expressão Heteróloga de Proteínas”, disponível como Material Com-
plementar ao fim desta unidade.

Aspectos gerais no diagnóstico imunológico/sorológico

de infecções virais e na detecção de fungos
Para a detecção de infecções virais e fúngicas, podemos utilizar di-
versas metodologias imunológicas. Importante salientar que os reagentes
e kits disponíveis apresentam sensibilidade e especificidade variada, por
isso a necessidade da busca de um teste diagnóstico mais sensível e mais
específico. Além disso, em testes sorológicos, podemos ter também as

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reações cruzadas, onde o teste específico pode acusar falso-positivo por

causa de uma proteína semelhante ou parecida com a proposta indicada
do fabricante, necessitando às vezes de um teste confirmatório ou um
mais específico para auxiliar no diagnóstico.

• Qual a diferença de um teste de ELISA direto de um indireto?

• Temos 5 tipos de anticorpos: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. Caracterize cada um deles e suas
funções.

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Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

Vídeos
Replicação do DNA e transcrição e tradução do RNA | Macromoléculas | Biologia | Khan Academy
https://youtu.be/U1hnrmyxk1M
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
https://bit.ly/3lxD62n
Clonagem de DNA e DNA recombinante
https://bit.ly/2Nr0X7g
Teste de ELISA
https://youtu.be/iembKqz1z_4
Expressão Heteróloga de Proteínas
https://youtu.be/hNH3NBSxnvw

Leitura
Níveis de Biossegurança
https://bit.ly/3eO3HXJ
Tipos de resposta imune: inata e adaptativa, humoral vs. mediada por células
https://bit.ly/30WVHeE
Unidade: Dogma central (DNA a RNA a proteína)
https://bit.ly/30UsgtR
Validation of Laboratory-Developed Molecular Assays for Infectious Diseases
Como validar um teste molecular para doenças infeciosas
https://bit.ly/2P3M63f
Sistema imunológico
https://bit.ly/3loFhoS
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
https://bit.ly/3bYhskD

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Referências
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. H. I. V. Imunologia celular e molecular. 
7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2012.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C.  Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre:
Artmed, 2017.

TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 6. ed. São Paulo: Atheneu, 2015.

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