Diferenciacao Bacs Lab

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
HOSPITAL DE CLÍNICAS
Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 1/17

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
Documento
Título do ROTINAS DE TRABALHO NO SERVIÇO DE Emissão: 22/10/2021 Próxima revisão:
Documento MICROBIOLOGIA Versão: 1 22/10/2023
1. OBJETIVO
O objetivo desse Procedimento Operacional Padrão (POP) é apresentar a
padronização das rotinas de trabalho no serviço de microbiologia da Unidade de Laboratório de
Análises Clínicas e Anatomia Patológica (ULACAP) do Hospital de Clínicas da Universidade Federal
do Triângulo Mineiro (HC-UFTM).
2. ÂMBITO DE APLICAÇÃO
Funcionários do setor de Microbiologia, da ULACAP do HC-UFTM.
3. DESCRIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS

O Laboratório de Microbiologia desempenha um papel importante para o sucesso de
um programa de controle de infecção hospitalar. A introdução de novas metodologias na prática
laboratorial nas últimas décadas, a expansão da lista de patógenos nosocomiais relevantes e o
crescente cenário de microrganismos multirresistentes tem tornado a interface entre essas duas
áreas mais ampla e complexa.
Dentre as atribuições do Laboratório de Microbiologia Clínica podemos destacar:
1. Isolamento rápido e identificação acurada de microrganismo envolvido em processo
infeccioso;
2. Determinação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos;
3. Vigilância de microrganismos problemas dentro da Instituição;
4. Fornecimento de dados epidemiológicos dos diferentes agentes etiológicos de infecção
hospitalar e perfil de susceptibilidade;
5. Suporte microbiológico na investigação de surto e realização de estudos de tipagem, se
necessário, para determinar a similaridade dos isolados;
6. Participação ativa na equipe de especialistas em infecção hospitalar, proporcionando
correlação clínico-laboratorial adequada;
7. Educação continuada em Microbiologia para Residentes e Especialistas em infecção
hospitalar;
8. Armazenamento de cepas de interesse local para estudos posteriores.
Em relação aos itens 1, 2 e 3 algumas considerações são importantes para que o especialista em
infecção hospitalar possa interpretar corretamente os resultados gerados pelo laboratório.
3.1 Isolamento e identificação acurada de microrganismos

A coleta e o transporte dos diferentes materiais biológicos são fatores fundamentais
para o sucesso na recuperação de um determinado agente, assim como para uma correlação
clínica adequada. Não existe em nenhuma outra área laboratorial tamanha diversidade quanto
aos espécimes clínicos passíveis de serem cultivados, além de extensa lista de possibilidades
etiológicas.
Para o diagnóstico adequado de um processo infeccioso, a seleção apropriada de um
espécime biológico envolve o conhecimento prévio da história natural da infecção em questão.
Um laboratório de microbiologia altamente equipado e capacitado, com pessoal especializado,
Cópia Eletrônica não Controlada

Permitida a reprodução parcial ou total, desde que indicada a fonte e sem fins lucrativos.
® 2021, Empresa Brasileira de Serviços Hospitalares. Todos os direitos reservados
www.Ebserh.gov.br

Documento
pouco contribuirá para o diagnóstico de uma doença infecciosa se não houver qualidade durante
todo o processo de seleção, coleta e transporte do material biológico.
O impacto negativo de uma coleta inadequada quanto ao desperdício de recursos
utilizados e instituição de tratamentos inadequados não deve ser subestimado, além de
comprometer diretamente a qualidade dos resultados gerados pela Comissão de Controle de
Infecção Hospitalar (CCIH).
É de responsabilidade do laboratório a realização do manual de coleta e transporte
dos diferentes materiais biológicos, sendo que laboratório e CCIH são parceiros na divulgação e
supervisão destas recomendações junto ao corpo clínico.
A identificação a nível de gênero e espécie deve ser realizada em microrganismos
considerados verdadeiros patógenos. Informações como Klebsiella spp., tem pouco valor do
ponto de vista epidemiológico e podem obscurecer a detecção de um surto de determinada
espécie.
3.2 Determinação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos.

A determinação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos constitui atribuição
fundamental do laboratório, cujo, objetivo fundamental é auxiliar na escolha do antimicrobiano
mais adequado, contribuindo para o sucesso terapêutico. Deve ser realizado somente nos
microrganismos considerados verdadeiros patógenos e não em microbiota normal ou
contaminantes. Além disso, os dados acumulados de resistência permitem a monitorização do
perfil de susceptibilidade de microrganismos de interesse, funcionando como um sistema de
alerta precoce de emergência de multirresistência ou perfis não usuais.
Existem várias metodologias bem padronizadas que podem ser empregadas como:
 Métodos quantitativos que determinam a concentração inibitória mínima (macrodiluição,
microdiluição e Etest);
 Métodos qualitativos que informam a categoria de sensibilidade do patógeno isolado
(método de disco difusão) e;
 Métodos automatizados (por exemplo, o sistema Vitek2).
A definição de utilização de determinada metodologia envolve questões relacionadas
aos custos, facilidade de execução, acurácia do teste e preferências individuais. Todas possuem
vantagens e limitações que devem ser conhecidas e entendidas pelos especialistas em infecção
hospitalar.
A detecção acurada da resistência de certos microrganismos, como por exemplo,
Estafilococos resistentes à oxacilina (MRSA) podem ser problemáticos se o laboratório não
estiver sempre atualizado em relação às normas do BrCAST para a realizar as modificações
necessárias nas rotinas destes testes.
A definição do painel de antibióticos a serem testados é uma decisão que envolve o
laboratório de microbiologia, a farmácia, o infectologista e o especialista em infecção hospitalar.
São levadas em consideração as metodologias disponíveis, a prevalência de resistência na
Instituição e disponibilidade local dos antimicrobianos testados.
Em hospitais onde o controle de antimicrobianos de amplo espectro é mais
complicado, a utilização do antibiograma seletivo pode ser bastante útil. Nesse caso, o painel de
www.Ebserh.gov.br

Documento
drogas é testado de rotina, mas a informação dos resultados de determinados antibióticos é

restrita ao corpo clínico, mas acessível à CCIH. Por exemplo, no caso de Estafilococos sensível à
oxacilina (MRSA), o resultado da sensibilidade da vancomicina pode se restrito numa tentativa
de minimizar o uso irracional e abusivo de antimicrobianos.
Outro aspecto fundamental é a atualização contínua dos pontos de corte utilizados
para classificar os isolados corretamente. Anualmente, diferentes organizações como por
exemplo o CLSI, publicam documentos contendo revisão dos pontos de corte utilizados com
diversas drogas, incluindo novos antibióticos, para diferentes microrganismos para os quais o
teste está padronizado e o microbiologista deve informar qualquer modificação a equipe da CCIH.
3.3 Vigilância de microrganismos problema

Nas últimas duas décadas, a incidência de infecções nosocomiais causadas por
microrganismos multirresistentes vem sendo relatada mundialmente trazendo um desafio a mais
para todos os profissionais de saúde envolvidos no cuidado ao paciente. O laboratório de
microbiologia deve estar atento e capacitado para detectar e comunicar precoce e corretamente
esses patógenos, possibilitando a introdução de terapêutica adequada, além de instituição de
medidas de controle para prevenir disseminação intra hospitalar.
Dentre esses patógenos pode-se destacar os enterococos resistentes à vancomicina
(VRE), Enterobactérias produtoras e Beta lactamases de espetro estendido (ESBL),
Enterobactérias resistentes à carbapenens (principalmente KPC), Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter baumannii multirresistentes, MRSA e VRSA (Staphylococcus aureus resistentes à
vancomicina).
A detecção de pacientes colonizados precocemente constitui importante estratégia
para minimizar a disseminação nosocomial desses patógenos. Entretanto, esses programas de
vigilância podem exigir esforços excepcionais do laboratório de microbiologia. Desta forma,
laboratório e CCIH devem discutir conjuntamente as estratégias a serem implementadas,
definindo quais são os microrganismos problema dentro da instituição, sua real prevalência,
quais as que demandam ações prioritária, qual universo de pacientes incluídos, a estimativa do
número de culturas, frequência de coleta, duração da vigilância, impacto na rotina e recursos
financeiros disponíveis. Todas essas informações são cruciais para permitir uma avalição prévia
da viabilidade do programa e planejamento adequado pelo laboratório.
Vários meios de cultura seletivos podem ser utilizados para aperfeiçoar os recursos
laboratoriais durante os programas de vigilância, além dos métodos alternativos para agilizar
identificação e determinação de susceptibilidade.
Finalmente, toda informação gerada deve ser disponibilizada o mais rápido possível
à CCIH e, esta tem também a responsabilidade de reavaliar continuamente os resultados e
validade do programa partilhando as informações com o laboratório.
São muitos os fatores no cenário laboratorial que interferem no trabalho da CCIH e a
comunicação frequente e contínua entre essas duas áreas é fundamental para o planejamento e
execução bem-sucedida das estratégias de um programa de controle de infecção hospitalar.

www.Ebserh.gov.br

Documento
4. ROTINAS DE CULTURAS DO SETOR DE MICROBIOLOGIA

O laboratório de microbiologia da ULACAP possui três bancadas de serviço, cada uma
desenvolvendo uma rotina de trabalho específica. Possui também uma sala para limpeza,
esterilização e descarte de todo material utilizado para os exames:
 A bancada 1 é responsável pela semeadura, identificação e realização do antibiograma das
amostras de urinas e fezes.
 A bancada 2 é responsável pela semeadura, identificação e realização dos antibiogramas de
secreções e líquidos corpóreos em geral.
 A bancada 3 é responsável pela realização dos exames de hemocultura, repiques,
isolamento, identificação e antibiograma. É também responsável pela pesagem, preparação e
realização do controle de qualidade dos meios de cultura utilizados na rotina.
O controle interno e o controle externo da qualidade ficam a cargo do responsável
pelo laboratório, assim como as atualizações do Manual de Biossegurança e Manual de Coleta de
Materiais para Exames Microbiológicos, assim como esse manual de rotinas.
As colorações de Gram e Ziehl-Neelsen são de responsabilidade de cada bancada de
acordo com a necessidade de realização do exame.
A colaboração entre funcionários é de extrema importância, pois sempre haverá
alguém disponível, enquanto o outro poderá estar sobrecarregado. Tem-se que ter em mente o
tamanho da importância no diagnóstico laboratorial das infecções e o quanto as atitudes irão refletir
no sucesso terapêutico instituído ao paciente.
Neste documento procurou-se definir os pontos principais da rotina de trabalho do
laboratório de microbiologia fazendo o máximo para executar com qualidade todos os
procedimentos necessários para que o resultado final seja a melhoria da saúde e qualidade de vida
do paciente.
Antes do início da rotina de trabalho, todo o ambiente é limpo e desinfetado com
álcool a 70%. Com auxílio de uma compressa de pano as bancadas, assim como alças e agulhas de
platina, estantes e todo material que será utilizado são desinfetados. Caso aconteça algum acidente
(derrame) com culturas de microrganismo durante o trabalho, imediatamente é colocado água
sanitária sobre o material e deixado por 10 minutos. Após esse tempo, limpa-se com compressa de
pano e desinfetando novamente com álcool a 70%. No final da rotina, todo o ambiente é novamente
desinfetado.
4.1 Rotina de trabalho para bancada 1

A bancada 1 é utilizada para a realização de urocultura e coprocultura. Ambas as
amostras deverão chegar ao laboratório acondicionadas em fracos estéreis, devidamente
identificados (nome e RG do paciente, nome do material biológico). Não processar amostras sem
identificação.
4.1.1 Urocultura
Homogeneizar bem a o frasco contendo a urina ainda bem fechado. Esterilizar uma
alça calibrada de 1 µL (0,001 mL), esperar esfriar, abrir a tampa e introduzi-la na amostra.

www.Ebserh.gov.br

Documento
Semear de forma quantitativa (Figura 1) em ágar Cled a fim de obter colônias isoladas no final
da semeadura, possibilitando a sua contagem.
Figura 1: Técnica de semeadura de urina para cultura quantitativa .
Após 24 horas de incubação em estufa a 35°C analisar o tipo morfológico das colônias
e o número de UFC (Unidade Formadora de Colônias). Geralmente as infecções do trato
urinário contém um tipo morfológico apresentando contagem superior a 1000 UFC, o que
corresponde a mais de 100.000UFC/mL de urina. Se houver mais de um tipo morfológico com
contagem superior a 100 UFC descartar a placa e solicitar nova coleta de amostra. Se a
contagem for menor que 100 UFC ou não houver crescimento algum, o resultado será
negativo.
Diante de uma cultura positiva (> 100.000 UFC/mL analisar o aspecto da colônia
presumindo a sua identificação. Colônias maiores geralmente são bacilos Gram negativos da
família Enterobacteriaceae e devem ser identificadas utilizando uma bateria de 10 provas
bioquímicas (TSI, Fenilalanina, Citrato, SIM, Uréia, VM, VP, Lisina, Arginina e Ornitina)
interpretando de acordo com a tabela de identificação. Realizar antibiograma utilizando os
discos padronizados aplicando os critérios de interpretação dos pontos de cortes do BrCAST.
Outro bacilo Gram negativo frequentemente encontrado em uroculturas de paciente
internado é a Pseudomonas aeruginosa. Colônias suspeitas tem um odor característico de
“uva” e produzem reação de citocromo oxidase positiva. Para complementar a identificação
pode-se fazer as provas de OF (oxidação-fermentação), Lisina, Arginina, controle de
aminoácidos e crescimento a 44°C. A P. aeruginosa tem metabolismo Oxidativo, é lisina
negativo, arginina positivo e crescimento a 44°C positivo. O Acinetobacter baumannii é outro
patógeno comumente encontrado no HC-UFTM, sendo isolado também de amostras do trato
urinário. Apresenta colônias mucoides, brilhantes, esbranquiçadas. Em ágar MacConkey
apresenta coloração salmão e deve ser identificada realizando as provas de citocromo
oxidase, OF, Citrato e crescimento a 44°C. Fenotipicamente apresentam metabolismo
Oxidativo, são oxidase negativo, citrato positivo e só o A. baumannii cresce a 44°C.
Colônias médias sugerem estafilococos, sendo os de interesse clínico, neste material,
o S. aureus e o S. saprophyticus (este em mulheres em idade fértil). Realizar uma coloração de
www.Ebserh.gov.br

Documento
Gram para confirmação da presença de cocos Gram positivos, fazer a prova da catalase
(positiva para estafilococos) e coagulase (positiva para S. aureus). Para identificação do S.
saprophyticus testar o disco de novobiocina de 5µg (resistente).
Colônias pequenas com aspecto puntiforme sugerem estreptococos, dos quais os
mais importantes são: Streptococcus agalactiae e, também, os enterococos. Realizar uma
coloração de Gram para confirmação de cocos Gram positivos em cadeias curtas e catalase
negativo. Fazer o teste PYR que irá determinar o próximo passo da identificação: Se positivo,
fazer as provas para enterococos (bile esculina, NaCl 6,5%, Manitol, Arabinose e Xilose) e
realizar antibiograma utilizando os discos padronizados para enterococos. Se PYR negativo,
repicar em ágar sangue de carneiro 5% para posterior evidenciamento de beta hemólise,
realizar o teste de CAMP e fazer o antibiograma em ágar Müeller Hinton acrescido de 5% de
sangue de carneiro. Confirmará a espécie se as colônias apresentarem beta hemólise e teste
CAMP positivo (figura 2).
As leveduras também podem ser isoladas em ágar Cled, devendo para isso serem
confirmadas pela coloração de Gram e enviadas ao setor de micologia para identificação.
Figura 2: CAMP teste positivo a direita e negativo a esquerda.
4.1.2 Coprocultura
A realização de exame microbiológico das fezes tem o objetivo de isolar e identificar
bactérias potencialmente capazes de causar síndromes diarreicas, infecção gastrointestinais,
etc. As principais espécies são Salmonella spp. Shigella spp., e Escherichia coli
enteropatogênica.
Semear a amostra por esgotamento (figura 3) em ágar MacConkey e ágar SS (ágar
Salmonella Shigella). Escolher as partes que contém muco e/ou sangue. Incubar em estufa a
35°C por 24 horas. Geralmente as fezes contém uma microbiota abundante que crescem junto
com as bactérias patogênicas. Observando a placa de ágar MacConkey devemos estar atentos
às colônias lactose negativas, pequenas e translúcidas (sugestivo de Shigella e Salmonella).

www.Ebserh.gov.br

Documento
Escherichia coli apresentam colônias lactose positivas, secas e bordas irregulares. No ágar SS
colônias apresentando o centro enegrecido são suspeitas de Salmonella.
Todas as colônias suspeitas devem ser repicadas para outro ágar MacConkey e
incubadas por 24h a 35°C. A identificação deve ser realizada utilizando uma bateria de 10
provas bioquímicas para Enterobactérias como descrito em uroculturas.
A bactéria identificada deve ser confirmada como patogênica por sorotipagem,
utilizando os anti-soros disponíveis no laboratório: Escherichia coli invasora A e B; E. coli
clássica A e B; E. coli O:157; Salmonella spp. polivalente; Shigella boydii; S. sonney; S.
dysenterie e S. flexneri.
Realizar o antibiograma para qualquer desses isolados.
Figura 3: Semeadura por esgotamento.
4.1.3 Identificação de bactérias gram negativas
4.1.3.1. Enterobactérias
As bactérias da família Enterobacteriaceae crescem bem em ágar MacConkey, que é
um meio seletivo para bactérias Gram negativas. Apresentam colônias médias, mucoides,
lisas e com bordas bem definidas. São citocromo-oxidase negativas, com exceção do
gênero Plesiomonas e Aeromonas.
Figura 4: Ágar MacConkey mostrando de um lado colônias Lactose positiva e Lactose negativa.
www.Ebserh.gov.br

Documento
As provas utilizadas pelo laboratório de microbiologia do HC-UFTM são:

 TSI – Tríplice Sugar Iron;
 FENILALANINA;
 CITRATO;
 SIM;
 UREIA;
 VM – Vermelho de metila;
 VP – Voges Proskauer;
 LISINA;
 ARGININA;
 ORNITINA.
Após a inoculação das provas bioquímicas e incubação por 24 horas em estufa a 35°C,
devemos revelar quatro das dez provas: fenilalanina, motil, VP e VM.
 Fenilalanina – colocar 2 gotas de cloreto férrico e agitar. Se o meio ficar verde escuro
a prova é positiva. O grupo Proteus, Providencia e Morganella são Fenilalanina positivos.
 Motil – Colocar 5 gotas de Reativo de Kovacs e homogeneizar. Se aparecer uma
coloração rósea a prova é positiva.
 VP – Colocar 600 µL de reagente A, homogeneizar bem. Adicionar 200 µL do reagente
B e homogeneizar bem. Esperar 5 minutos, se aparecer um anel de coloração rósea a prova
é positiva.
 VM – Colocar 5 gotas de reagente VM, homogeneizar bem e se a solução ficar
vermelha a prova é positiva.
Para identificação das espécies deve-se obedecer a uma estratégica sequência de

análise das provas:
A primeira prova a ser analisada é o TSI para confirmar que a bactéria é fermentadora
de glicose (família Enterobacteriaceae).
TSI: Glicose/ Lactose/ Sacarose

O meio TSI é originalmente vermelho. Quando se torna totalmente amarelo a
bactéria é fermentadora de glicose, lactose e sacarose (tubo 1); quando a parte inclinada
permanece inalterada e a base amarela, a bactéria é fermentadora, porém lactose negativa
(tubo 2); quando a base se torna enegrecida, considera-se a bactéria fermentadora com
H2S positivo (tubo 3); no tubo 4 tem-se uma bactéria não fermentadora, pois o meio
permaneceu inalterado. O meio pode mostrar também a produção de gás como no tubo 1.

www.Ebserh.gov.br

Documento
Figura 5: Meio de TSI mostrando os vários perfis de reação. Tubo 1: uma bactéria fermentadora com produção
de gás; tubo 2, uma bactéria fermentadora lactose negativo. No tubo 3: uma bactéria fermentadora com
produção de gás sulfídrico (H2S). O tubo 4 representa uma bactéria não fermentadora.
A segunda prova a ser interpretada é a Fenilalanina. Se positiva, a bactéria pertence

ao grupo Proteus, Providencia ou Morganella, excluindo todas as outras espécies.
Figura 6: Prova bioquímica da Fenilalanina mostrando um teste positivo à esquerda e negativo à direita.
A terceira prova na sequência de identificação é o citrato. Essa prova testa a

capacidade da bactéria em utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono. O meio
original é verde e quando positivo ele vira para azul. Frequentemente, encontramos uma
prova positiva que apresenta crescimento, mas permanece verde. Uma prova de citrato
positiva exclui E. coli.

www.Ebserh.gov.br

Documento
Figura 7:Prova do Citrato mostrando um teste positivo à esquerda e negativo à direita. Notar que o tubo
positivo mostra também o crescimento bacteriano.
Na sequência de identificação:
 H2S (+) Preto
(+) Salmonella – Edwardsiella
 Motilidade e Indol: Revelar com Reativo de Kovacs
(+): Rosa
(-): Incolor
(+) Enterobacter
(-) Klebsiella
 Ureia
(+): Rosa
(-): Amarelado
(+) Klebsiella
(-) Enterobacter
 VP (+) Halo Rosa - Reagente A (500uL) e B (200uL)
VM (+) 5 gotas de Vermelho de Metila
 Aminoácidos (AA) Ornitina, Arginina e Lisina – Colocar óleo antes de incubar
(+) lilás
(-) amarelo
Lembrando:
 Escherichia coli: Fenil (Neg) - Citrato (Neg) - Indol (+) – Motil (+) – Lisina e Ornitina (+)
 Enterobacter spp.: Fenil (Neg) – Citrato (+) – Motil (+) – Uréia (Neg) –
Se apenas Lisina Negativo: Enterobacter cloacae
Se apenas Arginina Negativo: Enterobacter aerogenes = Serratia
*Observação (OBS): necessário fazer Dnase para diferenciar
www.Ebserh.gov.br

Documento
Não se pode observar fenotipicamente ESBL em Enterobacter spp., pois esta é

naturalmente resistente a Cefoxitina.
 Klebsiella pneumoniae: Fenil (Neg) – Citrato (+) – Motil (Neg) – Uréia (+) – Lisina (+) –
Indol (Neg)
Fenil Citrato Indol Motil Ureia Lisina Arginina Ornitina
E. Coli - - + + - + - +
Enterobacter - + - + - - - +
spp. cloacae aerogenes
*OBS
Klebsiella - + - - + + - -
Pneumoniae
 Dnase: Diferenciar Enterobacter aerogenes de Serratia marcescens (provas

bioquímicas similares)
Serratia: Dnase Positiva
Na placa de Dnase:
 Utiliza-se como controle positivo Staphylococcus aureus;
 Teste: Bactéria a ser identificada;
 No dia seguinte: Ácido clorídrico 0,1% (HCL).
Figura 8: Teste da Dnase positivo a esquerda e negativo a direita
Bacilos Gram Negativos não fermentadores

Acinetobacter ou Pseudomonas ???

www.Ebserh.gov.br

Documento
Acinetobacter baumannii:
 Citrato (+)
 2 OF: 1 com óleo - Oxidativo (Amarelado nas extremidades)
 Oxidase em tira (Neg)
 Caldo BHI a 44º: crescimento (+)
Pseudomonas aeruginosa:
 2 OF: 1 com óleo – Negativo em ambos (Verde)
 Oxidase em tira: (+)
 Caldo BHI a 44º: crescimento (+)
 (AA): Lisina, Arginina e Controle (Com óleo): Apenas Arginina (+)
No ATB: São naturalmente resistentes a Ceftriaxona (CRO), Sulfazotrim (SUT) e Ertapenem

Antibiograma: Discos para não fermentadores
Imipenem + Meropenem + Piperacilina/Tazobactan
*OBS: Para Acinetobacter: Polimixina B
ESBL
 Para ATB de Gram Negativos sempre dispor na seguinte sequência:
 Acrescentar o disco de CFO (Cefoxitina) (não liberar no laudo) próximo ao CAZ
(ceftazidima).
Figura 9: Teste de aproximação em discos de uma amostra de K. pneumoniae para confirmação do fenótipo de
ESBL. O aumento do diâmetro do halo de inibição ou o aparecimento da zona fantasma, distorção do halo ao
redor do disco β-lactâmico, indica a presença de uma amostra produtora de ESBL.

www.Ebserh.gov.br

Documento
Teste confirmatório para ESBL

No Ágar Mueller Hinton, após preparar suspensão, semear a bactéria. Colocar dois
discos de AMC (Amoxicilina+ácido clavulânico) e deixar por 30 minutos; retirar os discos de
AMC e no local colocar CTX (Cefotaxima) e CAZ (Ceftazidima). Colocar mais dois discos de
CTX e CAZ e incubar 35°C 24h. No dia seguinte observar diferença de halo > 5mm (Positivo).
Figura 10: Detecção fenotípica de uma amostra de K. pneumoniae produtora de ESBL pelo método de disco
combinado, utilizando disco de ceftazidima (CAZ) e cefotaxima (CTX) associado ou não ao ácido clavulânico.
Observar um aumento maior que 5 mm entre os dois discos de ceftazidima e cefotaxima com àqueles
associados ao ácido clavulânico.
Teste de Hodge modificado- Teste fenotípico para identificação presuntiva de KPC

(Klebsiella pneumoniae carbapenemase)
 Identificar resistências aos carbapenens:
 Preparar a suspensão correspondente a 0,5 na escala de McFarland com bactéria
Escherichia coli ATCC 25922. Estriar em todo ágar Mueller Hinton. Colocar um disco de
Ertapenem no centro e passar a bactéria pura no sentido do centro para a lateral.
Lembrar: é nescessária a confirmação por PCR.

www.Ebserh.gov.br

Documento
Figura 11: Notar a distorção do halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela amostra de K.
pneumoniae testada, pelo método de disco-difusão.
4.1.4 Identificação de bactérias Gram positivas

 Crescimento em Ágar Sangue (Meio não seletivo)
 Coloração de Gram
Teste do KOH 1%: O teste do KOH baseia-se na resistência diferencial de hidróxido de potássio
1% entre as células positivas e Gram negativas em que uma parte de uma colônia é misturado
com um pequeno volume de KOH a 1% em uma lâmina de vidro por cerca de 60 segundos. Se
a células sofrerem lise o DNA celular será liberado e ocorrerá a formação de uma mistura
viscosa ou “fibrosa”. Caso ocorra a formação de um fio viscoso a bactéria é Gram negativa e
caso contrário a bactéria será Gram positiva.
Figura 12: Resultado do teste de KOH 1%.

www.Ebserh.gov.br

Documento
 Catalase: Água oxigenada

(+) Staphylococcus
(Neg) Streptococcus ou Enterococcus
 Staphylococcus spp.
 Coagulase
(+) Staphylococcus aureus
(Neg) Staphylococcus spp. em Sangue
(Neg) Staphylococcus saprophyticcus (Importância clínica apenas em urina de mulheres com
idade fértil), sendo:
Cocos Gram Positivos
Catalase (+)
Coagulase (Neg)
Lactose: sempre negativa
No ATB: Disco de Novobiocina Sensível
Se Resistente contaminante: Liberar no laudo resultado negativo.
 Antibiograma
Discos testados, mas não liberados no laudo:
 Furozolidona (FRZ): Sensível sempre (Comprova se é Staphylococcus):
 Novobiocina (NOV): Resistente sempre quando S. saprophyticcus
 Cefoxitina (CFO): Apenas para medir o halo, e liberar sensível ou resistente para Oxacilina
(OXA)
Discos testados:
Clindamicina, Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Cefoxitina, Gentamicina, Levofloxacina,
Sulfametoxazol/trimetoprim, Teicoplanina, Amicacina, Vancomicina (Utilizar MIC), Penicilina
(para liberar Vancomicina), Amicacina. Urina: Nitrofurantoína, Norfloxacino.
 Staphylococcus resistente à Vancomicina

Confunde-se halo grande com Sensível ou Intermediário.
Não se pode liberar resultado de Vancomicina por disco difusão.
É necessário utilizar MIC (Concentração Inibitória Mínima).
Utiliza-se disco de Penicilina > 28mm é sensível
 Staphylococcus (Gene erm) D TEST
Resistência induzível a Clindamicina
Produz o Gene erm: apresenta halo grande no Müeller Hinton, porém é resistente.
4.2 Rotina de trabalho para a bancada 2

Nessa bancada de trabalho são realizadas culturas de líquidos em geral, secreções,
além de realizar culturas de vigilância de patógenos multirresistentes, cultura de água dos poços
artesianos do hospital e culturas dos fluidos das máquinas de hemodiálise.

www.Ebserh.gov.br

Documento
A semeadura de cada material biológico deve ser pesquisada no POP de Semeadura

de Material Biológico.
Após incubação das primeiras 24 horas, analisar atentamente a morfologia das
colônias crescidas valorizando aquelas suspeitas de serem patogênicas, de acordo com o sítio
corpóreo. Para isso, deve-se conhecer bem a microbiota normal do corpo humano para que se
possa isolar e identificar um patógeno verdadeiro, evitando gastos desnecessários, além de
influenciar negativamente na instituição da terapia adequada. Toma-se como exemplo um
isolado de Streptococcus viridans em cultura de orofaringe: nesse caso a realização do
antibiograma não será necessária, pois se trata de microbiota normal. Diferentemente
aconteceria se essa bactéria fosse isolada em amostra de sangue.
A experiência diária facilita uma identificação presuntiva de determinada bactéria,
mas a prudência mostra que não se deve deixar de fazer alguma etapa para ganhar tempo. Por
exemplo, deixar de fazer uma coloração de Gram pode levar a erro na escolha das provas de
identificação e atrasar o exame e pelo menos 24 horas.
A observação do tipo de hemólise (alfa, beta ou gama) provocada no ágar sangue de
carneiro juntamente com a origem do material biológico é de fundamental importância, pois
direciona rapidamente a identificação. Um exemplo disso é uma placa de ágar sangue de carneiro
contendo colônias puntiformes apresentando alfa hemólise onde foi semeado um líquido pleural
sugerindo, portanto, um isolado de Streptococcus pneumoniae. Outro bom exemplo é a presença
de colônias pequenas apresentando beta hemólise em ágar sangue de carneiro onde foi semeado
uma secreção de pele. O Streptococcus pyogenes é frequentemente encontrado nesse tipo de
material e deve ser identificado após a coloração de Gram mostrar cocos em cadeias.
Os bacilos Gram negativos (BGN) são frequentemente isolados de amostras clínicas
nesse setor. A identificação de colônias suspeitas de BGN também será realizada utilizando as 10
provas bioquímicas disponíveis e interpretadas de acordo com a tabela no Anexo 1. Após
semeadura primária, é muito importante a observação detalhada dos tipos morfológicos que se
apresentam na placa de ágar. Não raro, deve-se fazer um repique em ágar MacConkey para
obtenção de colônias isoladas a fim de realizar as provas de identificação e o antibiograma.
Todas as culturas que apresentarem crescimento fúngico deverão ser encaminhadas
para o setor de micologia, excetuando as hemoculturas que serão processadas no setor
utilizando o equipamento Vitek 2 (identificação e antifungigrama).
4.3 Rotina de trabalho para a bancada 3

A terceira bancada é utilizada par a realização de hemoculturas. Também é utilizada
para produção de meios de culturas e provas bioquímicas juntamente com a cabine segurança
microbiológica.
A hemocultura é realizada no equipamento Bactec FX, que possui 4 compartimentos
com capacidade de 100 frascos cada. De acordo com a solicitação médica colhemos 8 a 10 mL de
sangue para exame de paciente adulto (frasco Plus Aerobic/F com lacre azul) para cultura de
bactérias; 1 a 5 mL de sangue para cultura de fungos e micobactérias (frasco MycoF Lytic com
lacre vermelho) e 1 a 3 mL de sangue total para hemocultura de crianças (frasco Peds Plus com
lacre prateado).
www.Ebserh.gov.br

Documento
Quando há crescimento bacteriano, o equipamento emite um sinal sonoro e acende

a luz vermelha do compartimento onde está o frasco. Após retirá-lo, fazer assepsia com álcool
70% na tampa de borracha e aspirar com agulha e seringa aproximadamente 1 mL de sangue
repicar em ágar chocolate, colocar em jarra com vela e incubar me estufa a 35°C. Fazer uma
lâmina, corar pelo Gram e reportar o resultado imediatamente.
Leveduras do gênero Candida também crescem no frasco aeróbio e no pediátrico.
Os fungos que causam micose sistêmica demoram entre 14 e 30 dias para crescer,
mas o frasco tem protocolo de negatividade de 42 dias, ou seja, o equipamento somente liberará
como negativo após esse tempo.
O crescimento de micobactérias no frasco MycoF se dá depois de aproximadamente
15 dias de incubação. Ao sinal de positivo, retirar o frasco, fazer assepsia da tampa de borracha
com álcool 70%, retirar mais ou menos 1 mL de amostra e preparar 2 lâminas; uma para coloração
de Gram e outra para Ziehl-Neelsen. Se for positivo para bacilos álcool ácido resistentes (BAAR)
repicar em ágar Lowenstein-Jensen; se positivo para fungos, repicar em dois tubos de ágar
Sabouraud.
5. REFERÊNCIAS
1. Henry J.B., Diagnósticos Clínicos Tratamento por Métodos Laboratoriais, 20ª ed., 1680 p., 2008.
2. Koneman, E.W. et al. Diagnostic microbiology. 5th. Ed. Philadelphia, Hippincott. 1991.
3. Moura R. A., Técnicas de laboratório. 3ª ed., Rio de Janeiro, Atheneu, 511 p., 1987.
4. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Carmen Paz Oplustil, Cássia Maria Zoccoli.
Editora Savier, 2004.
5. Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial (SBPC/ML):
boas práticas em microbiologia clínica. -- Barueri, SP: Manole: Minha Editora, 2015.
6. HISTÓRICO DE ELABORAÇÃO/REVISÃO
VERSÃO DATA DESCRIÇÃO DA AÇÃO/ALTERAÇÃO
1 02/07/2021 Atualização do documento
Elaboração – Versão1 Data: 22/10/2021

Marcelo Costa Araújo
Paula Cristina Silva Almeida
Leonardo Eurípedes Andrade e Silva
Validação
André Luiz Maltos, Responsável Técnico
Tatiana Silva Campos, chefe da ULACAP
Luciana Paiva Romualdo, chefe da Unidade de Gestão de Riscos Assistenciais
Registro, análise e revisão
Ana Paula Corrêa Gomes, chefe da Unidade de Planejamento
Aprovação (Gerente da área)
Marina Casteli Monteiro, chefe da Divisão de Apoio Diagnóstico e Terapêutico

www.Ebserh.gov.br

Diferenciacao Bacs Lab

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Diferenciacao Bacs Lab

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 1/17

3. DESCRIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS

3.1 Isolamento e identificação acurada de microrganismos

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 2/17

3.2 Determinação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos.

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 3/17

drogas é testado de rotina, mas a informação dos resultados de determinados antibióticos é

3.3 Vigilância de microrganismos problema

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 4/17

4. ROTINAS DE CULTURAS DO SETOR DE MICROBIOLOGIA

4.1 Rotina de trabalho para bancada 1

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 5/17

Figura 1: Técnica de semeadura de urina para cultura quantitativa .

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 6/17

Figura 2: CAMP teste positivo a direita e negativo a esquerda.

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 7/17

Figura 3: Semeadura por esgotamento.

4.1.3 Identificação de bactérias gram negativas

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 8/17

As provas utilizadas pelo laboratório de microbiologia do HC-UFTM são:

Para identificação das espécies deve-se obedecer a uma estratégica sequência de

TSI: Glicose/ Lactose/ Sacarose

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 9/17

A segunda prova a ser interpretada é a Fenilalanina. Se positiva, a bactéria pertence

A terceira prova na sequência de identificação é o citrato. Essa prova testa a

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 10/17

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 11/17

Não se pode observar fenotipicamente ESBL em Enterobacter spp., pois esta é

Fenil Citrato Indol Motil Ureia Lisina Arginina Ornitina

 Dnase: Diferenciar Enterobacter aerogenes de Serratia marcescens (provas

Figura 8: Teste da Dnase positivo a esquerda e negativo a direita

Bacilos Gram Negativos não fermentadores

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 12/17

No ATB: São naturalmente resistentes a Ceftriaxona (CRO), Sulfazotrim (SUT) e Ertapenem

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 13/17

Teste confirmatório para ESBL

Teste de Hodge modificado- Teste fenotípico para identificação presuntiva de KPC

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 14/17

4.1.4 Identificação de bactérias Gram positivas

Figura 12: Resultado do teste de KOH 1%.

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 15/17

 Catalase: Água oxigenada

 Staphylococcus resistente à Vancomicina

4.2 Rotina de trabalho para a bancada 2

Cópia Eletrônica não Controlada

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 16/17

A semeadura de cada material biológico deve ser pesquisada no POP de Semeadura

4.3 Rotina de trabalho para a bancada 3

Tipo do POP.ULACAP.007 – Página 17/17

Quando há crescimento bacteriano, o equipamento emite um sinal sonoro e acende

Elaboração – Versão1 Data: 22/10/2021

Cópia Eletrônica não Controlada

Você também pode gostar