IMUNO-HISTOQUÍMICA

Imuno-Histoquímica

A contribuição dos exames de imuno-histoquímica para o diagnóstico assertivo e o sucesso

do tratamento

A imuno-histoquímica é um método de análise dos tecidos via microscópio, buscando identificar ca-
racterísticas moleculares das doenças. Tem diversas aplicações, como o diagnóstico de doenças in-
flamatórias, infecciosas e neoplasias. Também é muito importante para determinação de fatores pre-
ditivos e prognósticos no câncer.

Em diversos casos é necessário utilizar o exame imuno-histoquímico, por exemplo, para fornecer da-
dos mais preciosos e individualizados sobre o melhor tratamento e provável evolução do câncer.

Esse exame pode auxiliar em diversas situações, tais como o diagnóstico de tumores indiferenciados
- definir se um tumor é um carcinoma, linfoma, melanoma ou sarcoma. Como cada tipo de tumor tem
um tratamento e evolução diferente, é importante tentar diferenciá-los através da imuno-histoquímica,
que vai pesquisar moléculas associadas a diferentes tipos de tumor.

O professor do departamento de patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

(USP), Venâncio Avancini, ressalta outra importante contribuição da imuno-histoquímica: o diagnós-
tico de doenças infecciosas e a identificação de antígenos específicos para cada possível agente in-
feccioso.

Esse exame é importante especialmente nas condições em que os patógenos não são visualizáveis
pela morfologia convencional, que por si só já é resolutiva em numerosas situações em que se identi-
ficam plenamente vermes, protozoários, fungos, além de algumas bactérias, sendo possível a carac-
terização indireta de vírus pelo efeito citopático a que induzem. Outros avanços podem ser obtidos
pelo estudo dos padrões de resposta inflamatória do hospedeiro, muitas vezes decisivos na avaliação
prognóstica e até na seleção terapêutica, explica.

Na visão de Venâncio Avancini, o cenário atual da imuno-histoquímica proporciona, pela automação,

maior controle na qualidade do processo.

A digitalização das imagens e os softwares computacionais já oferecem a possibilidade de análises

quantitativas, várias das quais já geraram pesquisas para validação no contexto clínico, opina.

Participando do desenvolvimento da imuno-histoquímica nos últimos 34 anos, o professor Venâncio

Avancini pontua que a área mais promissora da imuno-histoquímica é a contribuição no conjunto de
informes multidisciplinares oferecidos ao médico clínico ou cirurgião para sua decisão da estratégia
terapêutica.

As informações obtidas pelos métodos de imagem e, em especial, pelo detalhado informe dos acha-
dos histopatológicos, continuam a ser o eixo das informações, adicionando-se, nos últimos anos, os
estudos dos biomarcadores, que, hoje, já são muitos.

Na verdade, quase todo novo avanço no conhecimento bioquímico ou imunológico no conhecimento

sobre mecanismos de formação e de progressão de doenças traz a possibilidade de identificação de
proteínas ou carboidratos modificados que podem servir como antígenos para a produção de novos
anticorpos, propiciando assim sua identificação pela imuno-histoquímica, cada vez mais integrada
também aos demais métodos moleculares como as Hibridizações in situ, as Reações em Cadeia por
Polimerases, sequenciamento gênico e outras?, diz.

O professor ressalta que alguns dos principais focos de contribuição da imuno-histoquímica ao diag-
nóstico anatomopatológico são a caracterização de linhagens de diferenciação de células tumorais.
Ele conta que em recente visita a Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), o
respeitado professor Robert Gillies, da Flórida, conclamou os pesquisadores da área de medicina mo-
lecular a valorizar cada vez mais o estudo do fenótipo das doenças, expressão máxima da relação
dos produtos de expressão de distúrbios genéticos com as respostas do hospedeiro.

Tais avanços têm permitido, em conjunto também com os métodos de imagem, identificar com preci-
são cada vez maior os sítios de origem de neoplasias clinicamente detectadas através de suas me-
tástases, destaca.

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Mais do que nunca os estudos de imagem e as pesquisas laboratoriais morfológicas e moleculares

como a imuno-histoquímica oferecem informações de grande valia para as decisões terapêuticas, ca-
bendo ao médico a integração de todos esses aspectos para o benefício de seu paciente.

Imuno-histoquímica (IHQ) é o método de identificação de antígenos nos tecidos, utilizando o princí-

pio da ligação específica de anticorpos e antígenos. Este termo derivou das palavras imuno e histolo-
gia. A primeira estuda o sistema imunológico, a segunda estuda tecidos e órgãos por meio da micros-
copia, sendo que, para facilitar a observação, diferentes tipos de colorações podem ser utilizadas
para identificar diferentes partes de um tecido.

Este método de diagnóstico é rotineiramente usado para diagnosticar células anormais, como por
exemplo, as encontradas em neoplasias. Específicos marcadores moleculares caracterizam aconteci-
mentos celulares particulares, como, por exemplo, proliferação ou apoptose (morte celular). A IHQ
também é muito utilizada na pesquisa básica que visa compreender a distribuição e localização de
distintos biomarcadores e proteínas expressas em várias partes do organismo.

A observação de uma interação antígeno-anticorpo pode ocorrer de diferentes maneiras. Mais comu-
mente, um anticorpo conjuga-se com uma enzima, que por sua vez, irá catalisar uma reação que irá
gerar coloração. De modo alternativo, o anticorpo pode ser marcado com um fluoróforo (fluoresceína,
rodamina, Flúor DyLight ou Flúor Alexa).

Foi no fim dos anos 80, início da década de 90, que o uso desta técnica começou a ser amplamente
aplicada na patologia clínica, pois o surgimento de novas técnicas criou uma detecção mais sensível.
A técnica de hibridização tornou mais fácil o desenvolvimento da IHQ com a produção de anticorpos
monoclonais altamente específicos, idênticos e em abundância.

Os anticorpos utilizados para a detecção específica podem ser de dois tipos: policlonais ou monoclo-
nais. Estes últimos normalmente são considerados mais específicos. Os anticorpos policlonais resul-
tam de injeções de um antígeno peptídico em animais e, por conseguinte, a um estímulo de resposta
imune secundária, os anticorpos são isolados a partir do soro. Deste modo, os anticorpos policlonais
são uma mistura heterogênea de anticorpos capazes de reconhecer epítopos distintos.

Os anticorpos também podem ser classificados como reagentes primários ou secundários. Os primá-
rios são sintetizados contra um antígeno determinado e são tipicamente não-conjugados (não-marca-
dos). Já os anticorpos secundários são sintetizados contra anticorpos primários, responsáveis por re-
conhecerem imunoglobulinas de uma dada espécie e são conjugados à biotina ou a uma enzima fos-
fatase alcalina ou uma peroxidase.

A preparação das amostras varia de acordo com o tecido que será estudado, e também, do propósito
do estudo. Podem ser feitos cortes delgados no material (4-40 µm), ou, caso o tecido não seja muito
espesso, pode ser utilizado inteiro. Os cortes são feitos através de um micrótomo e, por conseguinte,
colocados em lâminas.

Previamente, são preparadas lâminas de controle, com resultados já conhecidos, que podem ser fa-
bricadas com tecidos do próprio paciente ou de outro indivíduo. Isto é feito para tentar reduzir faltas
de padronização de processamento e fixação.

Para a detecção IHQ de antígenos nos tecidos, existem duas estratégias: método indireto e método
direto. Em ambas as situações, a maioria dos antígenos também necessita de passos adicionais de
desmascaramento, o que normalmente produz a diferença entre coloração e não coloração. Habitual-
mente, utilizam-se detergentes como o Triton X-100, capazes de diminuir a tensão superficial, possi-
bilitando o uso de menos reagente para alcançar melhor e maior cobertura da amostra.

O método direto é considerado um método de coloração de um passo (one-step), e engloba um anti-

corpo marcado conjugado que se encontra reagindo diretamente com o antígeno que está na amostra
de tecido. Este é um procedimento simples e rápido, pois utiliza apenas um anticorpo. Contudo, pode
passar por determinados problemas, como sensibilidade, em conseqüência da diminuta amplificação
de sinal, sendo utilizado em menor proporção quando comparado com o método indireto.

O método indireto abrange um anticorpo primário não-marcado que reage com o antígeno presente
no tecido, e um anticorpo secundário marcado, capaz de reagir com o anticorpo primário. Esse mé-
todo é mais sensível do que o anterior por apresentar a amplificação de sinal por meio de diferentes

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reações de anticorpos secundários com distintos sítios antigênicos de anticorpo primário. A camada
de anticorpo secundário pode ser marcada com corante fluorescente ou uma enzima.

O método indireto, além de apresentar alta sensibilidade, apresenta a vantagem de que apenas uma
pequena quantidade de anticorpos secundários conjugados necessita ser produzido.

A IHQ é indicada para as mais distintas pesquisas em um laboratório de patologia clínica, dentre elas:

Diferenciação entre proliferação celular benigna e maligna;

Identificação do tecido de origem de uma neoplasia morfologicamente indiferenciada;

Apontar o órgão de origem de uma neoplasia diferenciada;

Subtipagens de neoplasias (como no caso de linfoma);

Pesquisa de fatores prognóstico, terapêutico e índices proliferativos de determinada neoplasia;

Elucidação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células;

Detecção de células neoplásicas metastáticas.

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