Bacteriologia - 1º/2018 04/04/2018

Diagnóstico Microbiológico

Identificação e Tipagem Bacteriana

Prof. Cláudio Galuppo Diniz

Diagnóstico clínico
• Sinais (mensuráveis) e sintomas (subjetivos)
• Origem
• Etiologia
• Natureza

Diagnóstico laboratorial
• Identificação agentes envolvidos em patologias
• Suporte para o diagnóstico/tratamento clínico
• Investigação epidemiológica
• Investigação científica

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Microbiota indígena Monomicrobiana

ORIGEM ETIOLOGIA

Microbiota exógena Polimicrobiana

Infecciosa

NATUREZA

Não-infecciosa

A utilidade do resultado liberado pelo laboratório de

microbiologia depende da qualidade da amostra recebida para
investigação.

A investigação baseia-se na construção de um estudo extremamente

cuidadoso para a identificação correta de determinada espécie ou linhagem
bacteriana.

Linhagem microbiana:

- Grupo de indivíduos, que de acordo com um sistema de identificação são

indistinguíveis e podem ser diferenciados de outros grupos/indivíduos de uma
mesma espécie em uma população.

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DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRETO

Pesquisa da presença de agentes causais de processos infecciosos em espécimes clínicos.

Em termos gerais o diagnóstico direto pode ser feito de quatro formas diferentes:

• Cultivo de microrganismos em meio de cultura específicos;

• Visualização direta do patógeno por técnicas de microscopia;
• Detecção de antígenos específicos do patógeno. Estes métodos requerem a utilização de técnicas
imunológicas ou de biologia molecular;
• Detecção de seqüências de ácidos nucléicos do patógeno pela utilização de sondas ou amplificação
gênica;

A visualização e o cultivo são, em geral, as técnicas mais utilizadas para se realizar diagnóstico
microbiológico.

• São técnicas mais simples;

• Requerem menor infraestrutura;
• Tem menor custo.

O diagnóstico microbiológico por cultivo dos microrganismos permite a recuperação do agente etiológico e
sua utilização futura para estudos científicos

• Epidemiológicos;
• Susceptibilidade a drogas.

Alguns microrganismos não podem ser visualizados ao microscópio óptico e outros não
crescem em meios de cultivo.

Neste caso, devemos nos ater aos métodos moleculares de diagnóstico ou às técnicas de diagnóstico
indireto.

• As técnicas moleculares oferecem uma capacidade de discriminação muito maior além de seus
resultados representarem dados mais precisos, apesar da necessidade de técnicos especializados.

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A detecção de antígenos e de ácidos nucléicos não permite recuperar células microbianas.

• Estas técnicas são mais eficientes na pesquisa de agentes não cultiváveis ou em concentrações muito
baixas nos espécimes clínicos.

Outra vantagem destas técnicas é sua rapidez.

• Apresentam um tempo de resposta muito menor do que as técnicas de cultivo porque não dependem
do crescimento in vitro do patógeno.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRETO

É possível diagnosticar uma infecção estudando-se o sistema imunológico do paciente pela pesquisa de
anticorpos formados pela resposta imune específica.
• A pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos específicos de um dado microrganismo possibilita o
diagnóstico de infecções crônicas ou agudas.

Toda informação proveniente do serviço de microbiologia depende da qualidade do espécime.

O diagnóstico incorreto pode ter conseqüências diretas no curso do tratamento adequado aos pacientes.

Colheita incorreta, escassez, contaminação ou transporte deficiente - pode resultar em falhas na

recuperação de patógenos predominantes ou responsáveis pelo processo infeccioso.

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Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um

"falso" agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada

Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível;

Instruir claramente o paciente sobre o procedimento;

Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos;

Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado;

Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos, causadores

de diarréia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a
fase aguda ou diarréica do processo infeccioso intestinal.

Quantidade adequada de material deve ser coletada para permitir uma completa análise
microbiológica;

O pedido do exame deve conter dados como idade, doença de base e indicação do uso de
antibióticos.

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Métodos broncoscópicos: => Escovado brônquico => Lavado broncoalveolar

Métodos não broncoscópicos: => Aspirado endotraqueal => Coleta às cegas

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CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÃO DE SISTEMAS DE INVESTIGAÇÃO

Aplicabilidade: possibilidade de resultado positivo, nulo ou

indistinguível entre diferentes amostras

Reprodutibilidade: fatores técnicos e biológicos.

Poder discriminatório: capacidade de discriminação entre as

linhagens.

Facilidade de execução: infra-estrutura pessoal e material.

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As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou

ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou
estruturais.

Biotipagem (isolamento e identificação);

Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;

Sorologia;

Fagotipagem;

Tipagem por bacteriocinas;

Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;

Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)

Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia

As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou

ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou
estruturais.

Biotipagem (isolamento e identificação);

Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;

Sorologia;

Fagotipagem;

Tipagem por bacteriocinas;

Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;

Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)

Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia

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BIOTIPAGEM

Também utilizado para taxonomia bacteriana – manual e automatizada.

Princípio: o perfil de atividades metabólicas expressado por uma dada amostra

bacteriana que inclui características como:

Morfologia colonial e celular;

Reações bioquímicas
Tolerância ambiental (meios seletivos, atmosfera, pH, temperatura, salinidade)

Desvantagens: mutações ou mesmo condição fisiológica sob diferentes condições de

estresse podem trazer resultados errôneos de tipagem e identificação.

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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS

- Muito utilizado nos centros de saúde para monitoramento dos níveis de resistência.

- Alteração nos padrões susceptibilidade a drogas antimicrobianas pode ser indicativo da

ocorrência de novas linhagens na comunidade e seu isolamento de vários pacientes pode
ser considerado como primeiro indicativo de um surto.

Princípio:

Avaliação do perfil de susceptibilidade a drogas clinicamente importantes.

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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS

Desvantagens:

A ausência da pressão seletiva dos antimicrobianos pode resultar em perda dos

marcadores de resistência;

Os mecanismos de recombinação genética bacteriana permitem a troca de

marcadores de resistência em diferentes circunstâncias, o que dificulta a determinação
de marcadores epidemiológicos.

Resistência cruzada a diferentes drogas antimicrobianas leva a uma identificação

equivocada dos marcadores epidemiológicos.

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SOROLOGIA

- Este método tem sido largamente utilizado na identificação microbiana, sendo uma das
ferramentas clássicas para os estudos epidemiológicos.

Princípio: baseados na observação de que microrganismos de mesma espécie podem

expressar diferentes determinantes antigênicos na superfície. Variadas estruturas da
superfície apresentam propriedades antigênicas, como:

Lipopolissacarídeo (LPS);

Polissacarídeo capsular;

Proteínas de membrana;

Organelas extracelulares (flagelos e fímbrias)

A determinação isolada de anticorpos específicos oferece pouca informação porque qualquer contato
com antígenos vai desencadear sua produção.
Para se estabelecer um diagnóstico sorológico confiável é necessário comparar-se a quantidade de
anticorpos em períodos distintos do processo infeccioso

Como outros métodos, a sorologia está sujeita a erros

• Em alguns casos a presença de anticorpos circulantes indica que certa pessoa esteve em contato com um
agente infeccioso e não, necessariamente, apresenta uma doença.

• Janela imunológica - causa freqüente de falsos negativos: período compreendido entre o contato com o
agente infeccioso, seu reconhecimento pelo sistema imunológico e a produção de anticorpos específicos.

• Reações cruzadas podem ser a causa de falsos positivos.

- Estruturas antigênicas semelhantes podem favorecer o reconhecimento inespecífico de antígenos.

• Imunossupressão pode induzir uma queda ou inibição da resposta imune específica impedindo a detecção
de anticorpos mesmo durante uma doença infecciosa.

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SOROLOGIA

-Várias são as técnicas disponíveis para os ensaios sorológicos, como:

Reações antígeno-anticorpo;
Soroaglutinação;
Aglutinação de partículas;
Neutralização
Marcação enzimática;
Fluorescência;
Aplicação de anticorpos monoclonais, etc .

Desvantagens:

- Técnicas sorológicas exigem um grande controle de qualidade nos reagentes desde sua
pureza e as soluções preparadas.

- Considerando-se células bacterianas, estas técnicas podem apresentar um baixo poder

discriminatório devido à diversidade de determinantes antigênicos em uma mesma
população bacteriana.

Aplicabilidade de técnicas
moleculares no diagnóstico
microbiológico

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Técnicas de diagnóstico molecular, geralmente caras, não devem ser usadas

no lugar de técnicas convencionais que são reconhecidamente rápidas,
sensíveis, reprodutíveis e que possuem um alta relação custo benefício.

• A decisão por um diagnóstico molecular deve levar em consideração

principalmente o impacto da nova técnica na prática clínica e a economia de
gastos associados à intervenção e para o paciente.

• A detecção rápida de bactérias multirresistente pode resultar em um

isolamento mais rápido do paciente, terapia mais apropriada e diminuição da
infecciosidade do paciente.

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diminuição do custo-benefício da
Contenção do
espalhamento da
infecção
+ tempo de
morbidade do = utilização de técnicas
moleculares para
paciente diagnóstico

• Apesar de toda rapidez e sensibilidade, o diagnóstico molecular não pode

substituir os métodos culturais e sorológicos convencionais em todos os
momentos.

• Os resultados do diagnóstico molecular e dos métodos culturais e sorológicos

têm significado diferente.

A detecção ou amplificação de ácidos nucléicos

determinam se existe DNA ou RNA de um organismo
particular em uma amostra biológica

• Não revela dados sobre a viabilidade do organismo

• Não diz se um microrganismo está envolvido em um processo

infeccioso

• Permite avaliar a clonalidade dos diferentes organismos e

permite avaliação de surtos e geração de conhecimento
epidemiológico

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