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RELATÓRIO DE ESTÁGIO EM MICROBIOLOGIA - FARMÁCIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO EM MICROBIOLOGIA - FARMÁCIA

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RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA DO CURSO DE FARMÁCIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA DO CURSO DE FARMÁCIA

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UNIVERSIDADE PRESIDENTE ANTÔNIO CARLOS COORDENAÇÃO DE ESTÁGIO PROFESSOR ORIENTADOR: Túlio Lage ESTAGIÁRIO(A): Gesiane Gonçalves Ferreira

MICROBIOLOGIA CLÍNICA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR - I

EMPRESA: UNIPAC SETOR: de Microbiologia PERÍODO DE REALIZAÇÃO: 18/06/2011 a 30/06/2011 TOTAL DE DIAS: 5 dias TOTAL DE HORAS: 25 horas NOME DO(A) SUPERVISOR(A): Túlio Lage FUNÇÃO: Professor / Supervisor de estágio FORMAÇÃO PROFISSIONAL: Bacharel e licenciado em Biologia

Ipatinga - MG 2011

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................................2 2 CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO................................................................4 3 SÍNTESE DA CARGA HORÁRIA SEMANAL....................................................................5 4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.......................................................................................6 4.1 Coleta, transporte e conservação de amostra........................................................................6 4.2 Esfregaço...............................................................................................................................7 4.2.1 Fixação do Esfregaço.........................................................................................................8 4.3 Exames diretos sem coloração .............................................................................................9 4.3.1 Salina .................................................................................................................................9 4.3.2 Hidróxido de potássio........................................................................................................9 4.4 Coloração de Gram.............................................................................................................10 4.5 Procedimentos para semeadura em meios de cultura..........................................................11 4.5.1 Semeadura qualitativa......................................................................................................11 4.5.2 Semeadura quantitativa....................................................................................................11 4.5.3 Procedimentos gerais.......................................................................................................12 4.6 Incubação............................................................................................................................13 4.7 Características macroscópicas das colônias........................................................................14 4.8 Identificação de Staphylococcus ........................................................................................16 4.9 Identificações de Streptococcus e Enterococcus ...............................................................16 4.10 Provas de identificação de cocos Gram positivos ............................................................17 4.10.1 Prova da catalase ...........................................................................................................17 4.10.2 Coagulase ......................................................................................................................17 4.10.3 Teste de CAMP .............................................................................................................18 4.11 Enterobactérias .................................................................................................................18 4.12 Bacilos Gram negativos não fermentadores......................................................................19 4.13 Meios de cultura................................................................................................................20 4.14 Teste de suscetibilidade antimicrobiana...........................................................................21 4.14.1 Prova de sensibilidade por Disco-Difusão (Kirby-Bauer)............................................21 5 CONCLUSÃO.......................................................................................................................22 REFERÊNCIAS........................................................................................................................23

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1 INTRODUÇÃO

O Laboratório de Microbiologia possui o objetivo de apontar o responsável por um determinado estado infeccioso e indicar através do monitoramento de populações microbianas qual o perfil dos microrganismos que estão interagindo com o homem. Com essas informações, a equipe de saúde é capaz de definir quais microrganismos podem ser responsáveis pelo quadro clínico do paciente e assim, propor um tratamento mais adequado. As atividades em um laboratório de microbiologia incluem estabelecer informações sobre a melhor amostra biológica, reconhecer a flora normal e os contaminantes, determinar o tratamento que beneficiará o paciente, identificar microrganismos com propósitos epidemiológicos, obter resultados rápidos em casos de emergência, racionalizar no uso de antimicrobianos, relatar os resultados e ainda, manter uma educação médica contínua em relação aos aspectos das infecções (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2002; MURRAY et al.,2002). Diferentes microrganismos como bactérias, fungos, e vírus causam infecções ao organismo humano. O grupo patogênico em destaque são as bactérias que constituem a flora humana e que normalmente não trazem risco aos indivíduos saudáveis, devido sua baixa virulência, mas que causam infecções em indivíduos em estado clínico comprometido, por isso são denominadas como bactérias oportunistas (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2002). O segundo grupo de importância médica nas infecções são os fungos, sendo a Cândida albicans e o Aspergillus os patógenos mais freqüentes. Dentre as viroses, o vírus da hepatite B e C, enteroviroses e viroses associadas com pneumonia são comumente registrados (MURRAY et al.,2002). Os patógenos implicados nas infecções são transmitidos ao indivíduo tanto via endógena, ou seja, pela própria flora do paciente, quanto pela via exógena. Esta última é veiculada pelas mãos, secreção salivar, fluidos corpóreos, ar e materiais contaminados, como por exemplo, equipamentos e instrumentos utilizados em procedimentos médicos invasivos, que facilitam a penetração destas barreiras de modo a elevar o risco de infecção (MURRAY et al.,2002). Os principais fatores que influenciam a aquisição de uma infecção são o estado imunológico, idade (recém-nascidos e idosos são mais vulneráveis), uso abusivo de

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antibióticos, procedimentos médicos (invasivos), imunossupressão e falhas nos procedimentos de controle de infecção (ROSSI e ANDREAZZI, 2005). O estágio de Microbiologia tem o objetivo de ampliar e aprimorar os conhecimentos sobre a área de atuação clínica microbiológica, preparar o estudante para a rotina de um laboratório de microbiologia tomando por conhecimento os princípios de elaboração e da colheita, conservação e transporte do material de interesse clínico; estabelecer e executar rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos vigentes, que permitam o isolamento e identificação dos principais agentes infecciosos de importância clínica; determinar a sensibilidade às drogas antimicrobianas; efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilização e divulgar e pôr em prática normas de Biossegurança. Este relatório tem como objetivo descrever as atividades desenvolvidas no estágio de Análises Clínicas no setor de Microbiologia no Laboratório de Microbiologia da Faculdade Presidente Antônio Carlos, assim como as principais atribuições do profissional farmacêutico neste setor.

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2 CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO

O estágio de parasitologia clínica foi realizado no laboratório 417 no quarto andar da Faculdade Presidente Antônio Carlos, Campus Ipatinga, localizado na Rua Salermo, 299 Bairro Bethânia. As atividades foram instruídas e supervisionadas pelo professor Túlio Lage. O laboratório onde foram feitas as atividades do estágio é amplo, disposto com bancadas nas quais estão dispostos os microscópios, também: cadeiras, televisor, lousa branca, armários com equipamentos e materiais para a realização de análises diversas, pia, armários, produtos químicos, materiais de coleta de urina e equipamentos de laboratório como capela de fluxo laminar e centrífuga.

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3 SÍNTESE DA CARGA HORÁRIA SEMANAL

Semana 18.06.11 20.06.11 – 21.06.11- 22.06.11 30.06.11

Número de dias 01 03 01

Número de horas 05 15 05

4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

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Durante o período de estágio foram ministradas pequenas aulas teóricas antes de iniciar as práticas, com ilustrações dos procedimentos e esquemas das técnicas que seriam realizadas. Estas atividades e as informações concedidas durante o estágio em microbiologia estão descritas a seguir. 4.1 Coleta, transporte e conservação de amostra Todo resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é consequência da qualidade da amostra recebida. O material coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado e escolhido o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um tratamento não apropriado. Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um “falso” agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada. O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia. A amostra deve conter: • • • • • • • 4.2 Esfregaço Nome e registro do paciente Leito ou ambulatório e especialidade Material colhido Data, hora e quem realizou a coleta Assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório Evitar o contato prolongado dos microorganismos com anestésicos utilizados Evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e

Transportar as amostras imediatamente ao laboratório para: de microbiologia trabalha basicamente em função da viabilidade dos microrganismos. durante a coleta, pois eles poderão exercer atividade bactericida. lavado broncoalveolar.

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Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para revelar as características do agrupamento. Os melhores resultados serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso. A técnica para preparo do esfregaço deve ser realizada da seguinte maneira: • • • • • Identificar a lâmina. Rolar toda a superfície do swab sobre a lâmina para não destruir as células. Fixar rapidamente na chama. Quando material é escasso, demarcar a área do esfregaço. Proceder o método de coloração mais apropriado.

Amostra coletada com swab ‫ ـ‬Rodar o swab suavemente pela lâmina limpa, evitando a destruição dos elementos celulares e dos grupamentos ‫ ـ‬Quando somente um swab for coletado, colocá-lo em um tubo estéril contendo uma pequena quantidade de salina estéril (0,4 ml) e agitar (vortex) ‫ ـ‬Comprimir o swab contra as paredes do tubo e utilizá-lo para fazer o esfregaço. O restante do material pode ser inoculado nos meios de cultura. Observação: materiais clínicos coletados com swab são menos recomendados para cultura. Coletar, sempre que possível, dois swabs: um será utilizado para fazer o esfregaço e o outro para cultura. Aspirados, exsudatos, etc. ‫ ـ‬Materiais recebidos em seringas serão transferidos para um tubo estéril e agitados (vortex), quando necessário ‫ ـ‬Selecionar a porção mais purulenta ou mucosa com pipeta ou alça bacteriológica ‫ ـ‬Amostras muito espessas ou purulentas podem ser diluídas com uma gota de salina estéril e espalhadas sobre uma grande área da lâmina formando um esfregaço delgado

Escarro

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‫ ـ‬Com auxílio de alça bacteriológica ou um palito de madeira, “pescar” uma porção purulenta do escarro que seja representativa ‫ ـ‬Rolar esta porção na parede do frasco para separar do material salivar ‫ ـ‬Em seguida, colocar o material na extremidade de uma lâmina limpa confeccionando um esfregaço delgado ‫ ـ‬Quando a quantidade de saliva for grande e pequenas porções purulentas forem visíveis, transferir a amostra para uma placa de Petri para facilitar a retirada do material representativo Urina jato médio - Homogeneizar bem o material e utilizar uma gota da amostra, sem centrifugação Cultura em caldo - Transferir uma a duas gotas para uma lâmina limpa utilizando alça bacteriológica ou pipeta; - Espalhar suavemente o material a fim de obter um esfregaço delgado. Meio sólido - Utilizar uma gota de salina estéril em uma lâmina limpa; - Transferir uma pequena porção da colônia com alça bacteriológica; - Misturar suavemente para obter um esfregaço levemente turvo e homogêneo. Observação: para evitar a formação de aerossóis, nunca misturar o material vigorosamente. 4.2.1 Fixação do Esfregaço Todo o esfregaço, antes de ser submetido à coloração, deve estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando à 50ºC. A fixação excessiva e o superaquecimento irão distorcer a morfologia celular e a fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o processo de coloração. Deixar a lâmina esfriar antes de iniciar a coloração. A fixação pelo metanol ou etanol também pode ser utilizada. Além de prevenir a lise das hemácias, evita que os esfregaços, principalmente os de urina, desprendam-se no momento da coloração. Deixar o esfregaço secar numa superfície plana; após, colocar uma a

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duas gotas de álcool (1min), drenando o excesso, sem lavar. Não aquecer a lâmina antes da coloração.

4.3 Exames Diretos sem Coloração 4.3.1 Salina O exame direto com salina permite observar a morfologia bacteriana e verificar a existência de motilidade. É utilizado também para pesquisa à fresco de Trichomonas em secreções e fungos (leveduriformes ou filamentosos) em diversos materiais. Materiais - Salina (Soro fisiológico a 0,85%) - Lâmina - Lamínula Procedimento - Goteja-se uma gota de salina no centro da lâmina de microscopia e nela suspende-se uma colônia ou uma alçada do material a ser investigado. - Cobre-se com a lamínula e observa-se ao microscópio em objetiva de 40X ou 100X. 4.3.2 Hidróxido de potássio É utilizado para pesquisar fungos (leveduriformes e principalmente filamentosos) em material biológico na presença de muco, restos celulares, escamas de pele, pelos e unhas. A adição de hidróxido de potássio facilita a microscopia já que esse dissolve a queratina e o muco destacando as estruturas fúngicas, quando presentes. Materiais - Hidróxido de potássio em solução aquosa a 10% ou 20% - Lâmina - Lamínula Procedimento: - Coloca-se uma pequena quantidade do material no centro da lâmina - Adiciona-se uma ou duas gotas de KOH

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- Cobre-se com a lamínula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente para acelerar o clareamento - Examina-se com objetiva de 10X ou 40X. Obs: As lâminas poderão ser colocadas em câmara úmida e, após 24 horas, realizar segunda leitura ao microscópio.

4.4 Coloração de Gram A coloração de Gram é usada para classificar as bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratório de microbiologia clínica este é um teste rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também utilizado para avaliar a qualidade da amostra clínica analisada. As interpretações dos esfregaços corados pelo Gram envolvem considerações relacionadas com as características da coloração, tamanho, forma e agrupamento das células. Estas características podem ser influenciadas por vários fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubação e a presença de substâncias inibidoras. É o método de análise utilizado para bacterioscopia da maioria dos materiais biológicos ou culturas de microrganismos em meios sólidos ou líquidos; para as amostras analisadas de culturas jovens (<24h) de meio de cultura sem inibidores e amostras clínicas recém-coletadas, para as quais fornecem os melhores resultados, e ainda, para a verificação da morfologia bacteriana a partir de esfregaços de cultura em caldo. Procedimento: - Cobre-se a área com a solução de cristal-violeta por cerca de um minuto. - Decanta-se o cristal-violeta e lava-se suavemente com a própria solução de iodo ou água da torneira. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células Gram-positivas). - Cobre-se a área do esfregaço com a solução de iodo Lugol durante cerca de um minuto. - Descora-se a lâmina com a mistura álcool-acetona (1:1), até que o solvente escorra incolor. - Alterna-se com água corrente. O tempo usualmente utilizado nesta etapa é de cerca de 10 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta

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das células Gram-positivas, assim como, a pouca descoloração pode resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactérias Gram-negativas). - Cobre-se o esfregaço com a solução de safranina (ou Fucsina básica 0.1% a 0.2%), por cerca de 30 segundos. - Lava-se com água corrente. - Deixa-se secar ao ar, em temperatura branda (50ºC). As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina) e se apresentam róseas.

4.5 Procedimentos para semeadura em meios de cultura 4.5.1 Semeadura qualitativa A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feito com o próprio swab ou amostra do material removida com alça flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentração do inóculo, que permita o isolamento de todas as colônias diferentes. Recomenda-se que a semeadura e a leitura das placas sejam realizadas pelo mesmo profissional para aprimorar a técnica de semeadura e isolamento de colônias.

Fonte: ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2002.

4.5.2 Semeadura quantitativa O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do número de UFC (unidades formadoras de colônia) obtidas após incubação. Utilizam-se dois artifícios para o efeito de diluição do material: - Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100 µL. O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo ao volume inoculado;

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1.000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por alça calibrada ou pipeta com ponteira estéril. - Técnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluição seriada do material em escala decimal, isto é, 1:10, 1:100, 1:1.000 … O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo à diluição utilizada; 10, 100, 1.000 ..., respectivamente. 4.5.3 Procedimentos gerais - Descarrega-se o material num canto da placa; - Flamba-se a alça; - Esfria-se a alça em um canto do ágar; - Semea-se partindo da ponta da primeira semeadura. - A cada mudança de direção flamba-se a alça e esfria-se. - Homogeneiza-se o material com agitação manual em diferentes direções ou em vortex (mixer). - Obtém-se o volume definido pela técnica com o auxílio de uma pipeta com ponteira estéril ou alça calibrada. No caso da alça, observa-se a integridade da película formada até depositá-la na parte superior da placa. Ainda com a alça, sem flambar até o final da semeadura, distribuir o material em linha reta até a outra extremidade. Perpendicularmente, distribui-se o material por toda a superfície de maneira uniforme. Repete-se o mesmo procedimento por 3 vezes, ou até que a superfície da placa esteja seca, alterando a direção da estria (vide figura abaixo). - Evita-se o uso de placas úmidas e, após semeada, não incubar caso haja umidade na superfície do ágar. - Evita-se o rompimento do ágar, estriando o material suavemente.

Fonte: ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2002.

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4.6 Incubação A incubação deve seguir alguns parâmetros determinados: Atmosfera - Para bactérias não exigentes em secreções, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera ambiente. - Para bactérias exigentes tais como: pneumococos, hemófilos e Neisserias ou fastidiosos incubar em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 3-5% de CO2). - Para Campylobacter é necessário tensão de 5 a 10% de CO2 e restrição de O2 sendo conveniente o uso de geradores específicos. - Para bactérias anaeróbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita. Temperatura - 36oC +/- 1oC é a temperatura para a grande maioria das bactérias da rotina, incluindo os anaeróbios e micobactérias. - Fungos podem ser cultivados a 30oC ou 25 e 35oC. - Temperatura à 42oC pode ser necessário para isolar espécies de Campylobacter, Acinetobacter aumannii, e algumas espécies de Pseudomonas. Umidade - Bactérias fastidiosas e exigentes (neisserias patogênicas e hemófilos) crescem melhor se forem incubadas num recipiente com tensão de 5% de CO2 com um chumaço de algodão embebido em água estéril. Tempo - Em geral a primeira leitura é realizada com 18 a 24 horas de incubação ou em casos de urgência para iniciar a identificação e antibioGrama, a partir de 6 horas é possível visualizar crescimento de algumas enterobactérias. - Para anaeróbios é recomendável a primeira leitura com 48 a 72 horas de incubação. - Para bactérias exigentes ou de crescimento lento o período de incubação pode ser bastante prolongado: Micobactérias de 3 a 45 dias; Nocardia, 4 a 7 dias; Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas até 45 dias).

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4.7 Características macroscópicas das colônias Alguns aspectos são fundamentais na leitura inicial das placas para se estabelecer um diagnóstico presuntivo e direcionar o exame: Tamanho O tamanho das colônias deverá ser considerado na placa como um todo, uma mesma cepa pode formar colônias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa: - Puntiforme (<1 mm de diâmetro) - colônias muito pequenas, características de bactérias mais exigentes. - Pequena (até 2 mm de diâmetro) – Shigella e Yersinia costumam crescer em MaC Conkey e Salmonella-Shigella como colônias pequenas e lactose negativa. Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp, Enterococcus spp, pneumococos, Streptococcus spp. Cândida spp e alguns esfafilococos coagulase negativo também costumam formar colônias pequenas. - Média (até 3 mm de diâmetro) – Enterobactérias, não fermentadores e Estafilococos. - Grandes (mais de 4 mm de diâmetro) – Bacillus spp, algumas enterobactérias como Klebsiella e Enterobacter, o mesmo ocorre com não fermentadores como Pseudomonas. Vale lembrar a formação de véu, característico do gênero Proteus, Comamonas e algumas cepas de Pseudomonas. Cor A coloração dependerá do meio de cultura utilizado. Meios não diferenciais – pode-se identificar a coloração características de alguns microrganismos: - S. aureus – amarelo - Micrococcus – amarelo - Serratia – avermelhado - Roseomonas - róseo - Pseudomonas – diferentes tons de verde e castanho - Enterococcus casseliflavus – amarelo Meios diferenciais – a coloração da colônia sofre interferência das reações que ocorrem com substratos dos meios de cultura: - Utilização da lactose no Mac Conkey – vermelho - Utilização da lactose no CLED – amarelo - Utilização do manitol em Ágar manitol salgado – amarelo

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- Produção de H2S no Hecktoen Enteric e Salmonella-Shigella – negro Hemólise Baseada na lise de hemácias contidas no Ágar Sangue (5%) - Lise total – denominada beta-hemólise, ocorre a formação de halo de transparência ao redor e/ou sob a colônia: S. pyogenes, S. agalactiae, Listeria, S. aureus, S. haemolyticcus, Enterococcus. - Lise parcial – denominada alfa-hemólise, há formação de halo com coloração esverdeada: S. viridans, S. pneumoniae, Enterococcus. - Ausência de lise – definida como gama-hemólise, meio de cultura inalterado: Enterococcus, Estafilococos coagulase negativo. Forma da colônia - Redonda – E. coli, Klebsiella, Serratia, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos - Irregular – Pseudomonas, Proteus, Providencia, Morganella, Bacillus - Produção de véu – Proteus, Comamonas, Pseudomonas - Filamentosas – fungos filamentosos - Formando pontas, como estrelas – Cândida - Com depressão no centro – Pneumococo - Cerebriforme – Pseudomonas stutzeri - Elevada – Klebsiella, Bacillus - Chata – Enterobacter, Pseudomonas Consistência - Friável, quebradiça - Moraxella - Mucóide – Klebsiella, Pseudomonas, Bacillus - Seca – E. coli, Citrobacter, S. aureus - Butirosa (manteiga) – Candida Cheiro - Eikenella corrodens – cheiro de cloro - Pseudomonas – cheiro adocicado

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- Anaeróbios – cheiro fétido Densidade - Opaca: E. coli, Candida, S. aureus - Brilhante: Stenotrophomonas, Pneumococo

4.8 Identificação de Staphylococcus Para a identificação de bactérias do gênero Staphylococcus, principalmente o Staphylococcus aureus, uma das espécies de maior importância médica, utiliza-se a prova da coagulase. De maneira geral, os estafilococos são divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos. Este teste, pode, ainda, ser realizado de duas formas: em lâmina e em tubo.

4.9 Identificações de Streptococcus e Enterococcus Para se diferenciar as espécies dentro do gênero dos estreptococos são utilizadas três etapas de identificação: 1. Propriedades sorológicas (grupos de Lancefield). 2. Padrões hemolíticos 3. Propriedades bioquímicas (fisiológicas) A identificação sorológica é feita apenas para os estreptococos β-hemolíticos, porém, essa prova não é acessível a todos os laboratórios. É importante notar que as identificações devem ser feitas e ágar sangue e elas se dividem em: • • • β-hemolítico α-hemolítico γ-hemolítico

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4.10 Provas de identificação de cocos Gram positivos 4.10.1 Prova da catalase Reagentes: Peróxido de hidrogênio 3% armazenado em frasco âmbar. Cultura de 10 a 48 horas do microorganismo a ser testado Procedimento: Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Coloca-se sobre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas. Interpretação: O teste é positivo se houver formação de bolhas rapidamente. Interferentes: Algumas bactérias contêm outras enzimas, que não catalase, que podem decompor o peróxido de hidrogênio, mostrando o aparecimento de bolhas pequenas após 20 a 30 segundos. Nesse caso, o teste é considerado negativo. A catalase está presente nas células vermelhas do sangue, por isso deve-se tomar cuidado para não carregar porções do ágar sangue juntamente com as colônias para evitar a obtenção de resultados falso-positivos. 4.10.2 Coagulase A maioria das cepas de S. aureus possui a coagulase ligada – fator de aglutinação “clumping factor”- na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do plasma causando coagulação do mesmo. Reagentes: Plasma com EDTA Colônia a ser testada Procedimento: Colocam-se 2 gotas de salina em uma lâmina Emulsiona-se uma colônia isolada a ser testada Adiciona-se 1 gota de plasma e mistura-se com palito de plástico ou madeira

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Observa-se se há aglutinação em 10 segundos Interpretação: O teste é positivo quando ocorre a formação de precipitado granuloso ou de grumos brancos. Essa prova é considerada apenas presuntiva e todas as culturas que apresentarem resultado negativo ou positivo tardio devem ser examinados através da prova em tubo, pois algumas cepas produzem coagulase livre que não reagem na prova em lâmina. 4.10.3 Teste de CAMP Reagentes: Deve ser realizada na mesma placa do teste da Bacitracina Cepa de S. aureus produtor de beta lisina Cepa de estreptococos alfa-hemolíticos a ser testada Procedimentos: - Inocula-se uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. - Inoculam-se as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo. As estrias não devem se tocar, ficando a 1 mm de distância, e deste modo várias amostras podem sertestadas em uma mesma placa de ágar sangue. A maneira de inocular é fundamental para a observação do efeito esperado. - Incuba-se a placa a 35-37°C durante um período de 18-24 horas. Interpretação: O teste é positivo para Streptococcus agalactiae, quando há evidencia de alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica, na área de intersecção entre as duas estrias.

4.11 Enterobactérias A família Enterobacteriaceae constitui a maior e mais heterogênea coleção de bacilos Gram negativos de importância médica, sendo o grupo de bactérias mais isolado das amostras biológicas. Tipicamente, estas bactérias produzem colônias secas ou mucóides relativamente grandes de cor cinza opaco em ágar sangue. Entretanto, a diferenciação baseia-se

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principalmente na presença ou ausência de diferentes enzimas codificadas no material genético bacteriano. Com poucas exceções, todos os membros da família Enterobacteriaceae possuem as seguintes características: 1. Fermentação da glicose 2. Citocromo oxidase negativa 3. Redução de nitrato a nitrito As principais provas para a identificação das enterobactérias de importância clínica são: ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ Fermentação da glicose Fermentação da lactose Motilidade Utilização de citrato Descarboxilação da lisina Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) Produção de gás (CO2) Oxidase Produção de indol Produção de urease Produção de fenilalanina desaminase ou opçãotriptofanase Produção de gelatinase ou opção DNAse

Os esquemas de identificação baseiam-se na determinação dos gêneros e espécies mais isolados na clínica, e nas provas mais características de cada gênero e espécie, baseado em alguns critérios como: facilidade de execução, facilidade de interpretação, custo, rapidez para leitura, etc.

4.12 Bacilos gram negativos não fermentadores Os bacilos Gram negativos não-fermentadores (BNFs) são um grupo de microorganismos aeróbios, ou seja, não utilizam carboidratos como fonte de energia ou os degrada por outras vias metabólicas que não a fermentação. Embora a sua incidência seja

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pequena, geralmente apresentam resistência á vários antibióticos e são capazes de causar infecções graves. Suspeita-se que um bacilo Gram negativo desconhecido pertence ao grupo de nãofermentadores quando se observa uma ou mais das características seguintes: ⋅ ⋅ ⋅ Ausência de evidências de fermentação da glicose Reação positiva de citocromo oxidase Ausência de crescimento em ágar MacConkey

4.13 Meios de cultura O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. Ágar sangue (AS) – meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos Ágar chocolate (AC) – meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos. Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfahemolíticas Ágar Mac Conkey (MC) – meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo. ‫ ـ‬Lactose positiva – coloração avermelhada ‫ ـ‬Lactose negativa – coloração inalterada ‫ ـ‬Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus Ágar Salmonela-Shigella (SS) – meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra)

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Ágar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração alaranjada) e produção de H2S (coloração negra) Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) – meio seletivo pela adição de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactérias, Gram positivos, fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas. Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae

4.14 Teste de suscetibilidade antimicrobiana O princípio do teste de susceptibilidade microbiana é medir a capacidade de um antibiótico inibir o crescimento bacteriano in vitro. Utilizam-se os discos comercialmente disponíveis com diâmetro apropriado. Após a incubação das bactérias no meio devidamente preparado, faz-se a interpretação dos resultados de acordo com os diâmetros onde não houve crescimento dos microrganismos. Os valores das medidas dos diâmetros são comparados ao de uma tabela e través da qual, determina-se a capacidade da bactéria ser “susceptível”, “intermediário” ou “resistente”. O teste de disco-difusão, ou antibiograma, é baseado na presença ou ausência de um halo de inibição e a medida do seu diâmetro é correlacionada às concentrações inibitórias mínimas (CIMs). Os testes de sensibilidade são indicados quando se acredita que o organismo causador da infecção pertence a uma espécie capaz de demonstrar resistência aos agentes antimicrobianos normalmente usados. 4.14.1 Prova de sensibilidade por Disco-Difusão (Kirby-Bauer) Leitura das Placas e Interpretação dos Resultados Após 16-18 horas de incubação, examina-se cada placa. A placa deve ser satisfatoriamente semeada para que os halos de inibição resultantes se formem círculos uniformes. Os diâmetros dos halos de inibição total são mensurados em milímetros com um paquímetro ou uma régua, incluindo-se o diâmetro do disco. O tamanho dos halos de inibição é interpretado com a utilização de uma tabela, onde, classificam-se os organismos como sensíveis, intermediários, ou resistentes aos agentes testados.

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5 CONCLUSÃO

O setor de Microbiologia, como qualquer outro setor do Laboratório de Análise Clínicas é um setor onde precisa trabalhar com muita atenção e precaução utilizando adequadamente os equipamentos de proteção individual (EPI’s) devido o manuseio com amostras de sangue. Os procedimentos dos testes devem ser realizados cuidadosamente analisando cada passo e observando possíveis contaminações cruzadas como falta de limpeza, esterilização meio de cultura não eficiente e outros, os quais podem vir a levar alteração no resultado do exame, assim faz-se necessário a padronização da execução dos métodos para um resultado mais seguro e confiável. O papel do farmacêutico no setor é acompanhar a realização correta dos exames, a padronização da execução dos métodos, interpretação dos resultados para liberação do laudo e garantia do controle de qualidade.

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REFERÊNCIAS

MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA NACIONAL DE ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Manual de procedimentos básicos em microbiologia clínica para o controle da infecção hospitalar. Brasília, 1991. MOURA, Robeto de Almeida. WADA, Carlos S. PURCHIO, Adhemar. ALMEIDA, Therezinha Verrastro de. Técnicas de Laboratório.3 ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2006. MURRAY, Patrick R. et al. Microbiologia médica. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. 762p. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Procedimentos laboratóriais em bacteriologia clínica. 2.ed. São Paulo: Santos Livraria Editora, 2002. 122p. PARDINI, Hermes. Manual de Exames e Serviços. Belo Horizonte, 2006/2007 Procedimentos Laboratoriais. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_3_2004.pdf>. Acesso em 30 de Junho de 2011. ROSSI, Flávia; ANDREAZZI, Denise B. Resistência bacteriana: interpretando o antibiograma. Rio de Janeiro: Atheneu, 2005. 118p

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