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UNIVERSIDADE PRESIDENTE ANTNIO CARLOS COORDENAO DE ESTGIO PROFESSOR ORIENTADOR: Tlio Lage ESTAGIRIO(A): Gesiane Gonalves Ferreira

MICROBIOLOGIA CLNICA

RELATRIO DE ESTGIO CURRICULAR - I

EMPRESA: UNIPAC SETOR: de Microbiologia PERODO DE REALIZAO: 18/06/2011 a 30/06/2011 TOTAL DE DIAS: 5 dias TOTAL DE HORAS: 25 horas NOME DO(A) SUPERVISOR(A): Tlio Lage FUNO: Professor / Supervisor de estgio FORMAO PROFISSIONAL: Bacharel e licenciado em Biologia

Ipatinga - MG 2011

SUMRIO

1 INTRODUO.......................................................................................................................2 2 CARACTERIZAO DO LOCAL DE ESTGIO................................................................4 3 SNTESE DA CARGA HORRIA SEMANAL....................................................................5 4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.......................................................................................6 4.1 Coleta, transporte e conservao de amostra........................................................................6 4.2 Esfregao...............................................................................................................................7 4.2.1 Fixao do Esfregao.........................................................................................................8 4.3 Exames diretos sem colorao .............................................................................................9 4.3.1 Salina .................................................................................................................................9 4.3.2 Hidrxido de potssio........................................................................................................9 4.4 Colorao de Gram.............................................................................................................10 4.5 Procedimentos para semeadura em meios de cultura..........................................................11 4.5.1 Semeadura qualitativa......................................................................................................11 4.5.2 Semeadura quantitativa....................................................................................................11 4.5.3 Procedimentos gerais.......................................................................................................12 4.6 Incubao............................................................................................................................13 4.7 Caractersticas macroscpicas das colnias........................................................................14 4.8 Identificao de Staphylococcus ........................................................................................16 4.9 Identificaes de Streptococcus e Enterococcus ...............................................................16 4.10 Provas de identificao de cocos Gram positivos ............................................................17 4.10.1 Prova da catalase ...........................................................................................................17 4.10.2 Coagulase ......................................................................................................................17 4.10.3 Teste de CAMP .............................................................................................................18 4.11 Enterobactrias .................................................................................................................18 4.12 Bacilos Gram negativos no fermentadores......................................................................19 4.13 Meios de cultura................................................................................................................20 4.14 Teste de suscetibilidade antimicrobiana...........................................................................21 4.14.1 Prova de sensibilidade por Disco-Difuso (Kirby-Bauer)............................................21 5 CONCLUSO.......................................................................................................................22 REFERNCIAS........................................................................................................................23

1 INTRODUO

O Laboratrio de Microbiologia possui o objetivo de apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso e indicar atravs do monitoramento de populaes microbianas qual o perfil dos microrganismos que esto interagindo com o homem. Com essas informaes, a equipe de sade capaz de definir quais microrganismos podem ser responsveis pelo quadro clnico do paciente e assim, propor um tratamento mais adequado. As atividades em um laboratrio de microbiologia incluem estabelecer informaes sobre a melhor amostra biolgica, reconhecer a flora normal e os contaminantes, determinar o tratamento que beneficiar o paciente, identificar microrganismos com propsitos epidemiolgicos, obter resultados rpidos em casos de emergncia, racionalizar no uso de antimicrobianos, relatar os resultados e ainda, manter uma educao mdica contnua em relao aos aspectos das infeces (ORGANIZAO MUNDIAL DA SADE, 2002; MURRAY et al.,2002). Diferentes microrganismos como bactrias, fungos, e vrus causam infeces ao organismo humano. O grupo patognico em destaque so as bactrias que constituem a flora humana e que normalmente no trazem risco aos indivduos saudveis, devido sua baixa virulncia, mas que causam infeces em indivduos em estado clnico comprometido, por isso so denominadas como bactrias oportunistas (ORGANIZAO MUNDIAL DA SADE, 2002). O segundo grupo de importncia mdica nas infeces so os fungos, sendo a Cndida albicans e o Aspergillus os patgenos mais freqentes. Dentre as viroses, o vrus da hepatite B e C, enteroviroses e viroses associadas com pneumonia so comumente registrados (MURRAY et al.,2002). Os patgenos implicados nas infeces so transmitidos ao indivduo tanto via endgena, ou seja, pela prpria flora do paciente, quanto pela via exgena. Esta ltima veiculada pelas mos, secreo salivar, fluidos corpreos, ar e materiais contaminados, como por exemplo, equipamentos e instrumentos utilizados em procedimentos mdicos invasivos, que facilitam a penetrao destas barreiras de modo a elevar o risco de infeco (MURRAY et al.,2002). Os principais fatores que influenciam a aquisio de uma infeco so o estado imunolgico, idade (recm-nascidos e idosos so mais vulnerveis), uso abusivo de

antibiticos, procedimentos mdicos (invasivos), imunossupresso e falhas nos procedimentos de controle de infeco (ROSSI e ANDREAZZI, 2005). O estgio de Microbiologia tem o objetivo de ampliar e aprimorar os conhecimentos sobre a rea de atuao clnica microbiolgica, preparar o estudante para a rotina de um laboratrio de microbiologia tomando por conhecimento os princpios de elaborao e da colheita, conservao e transporte do material de interesse clnico; estabelecer e executar rotinas microbiolgicas, dentro dos padres tcnico-cientficos vigentes, que permitam o isolamento e identificao dos principais agentes infecciosos de importncia clnica; determinar a sensibilidade s drogas antimicrobianas; efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilizao e divulgar e pr em prtica normas de Biossegurana. Este relatrio tem como objetivo descrever as atividades desenvolvidas no estgio de Anlises Clnicas no setor de Microbiologia no Laboratrio de Microbiologia da Faculdade Presidente Antnio Carlos, assim como as principais atribuies do profissional farmacutico neste setor.

2 CARACTERIZAO DO LOCAL DE ESTGIO

O estgio de parasitologia clnica foi realizado no laboratrio 417 no quarto andar da Faculdade Presidente Antnio Carlos, Campus Ipatinga, localizado na Rua Salermo, 299 Bairro Bethnia. As atividades foram instrudas e supervisionadas pelo professor Tlio Lage. O laboratrio onde foram feitas as atividades do estgio amplo, disposto com bancadas nas quais esto dispostos os microscpios, tambm: cadeiras, televisor, lousa branca, armrios com equipamentos e materiais para a realizao de anlises diversas, pia, armrios, produtos qumicos, materiais de coleta de urina e equipamentos de laboratrio como capela de fluxo laminar e centrfuga.

3 SNTESE DA CARGA HORRIA SEMANAL

Semana 18.06.11 20.06.11 21.06.11- 22.06.11 30.06.11

Nmero de dias 01 03 01

Nmero de horas 05 15 05

4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

Durante o perodo de estgio foram ministradas pequenas aulas tericas antes de iniciar as prticas, com ilustraes dos procedimentos e esquemas das tcnicas que seriam realizadas. Estas atividades e as informaes concedidas durante o estgio em microbiologia esto descritas a seguir. 4.1 Coleta, transporte e conservao de amostra Todo resultado liberado pelo laboratrio de microbiologia consequncia da qualidade da amostra recebida. O material coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado e escolhido o melhor stio da leso, evitando contaminao com as reas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiolgico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um tratamento no apropriado. Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um falso agente etiolgico, resultando numa orientao teraputica inadequada. O profissional responsvel pela coleta ser tambm responsvel por identificar de forma legvel o material a ser encaminhado ao laboratrio de microbiologia. A amostra deve conter: 4.2 Esfregao Nome e registro do paciente Leito ou ambulatrio e especialidade Material colhido Data, hora e quem realizou a coleta Assegurar a sobrevivncia e isolamento do microrganismo, pois o laboratrio Evitar o contato prolongado dos microorganismos com anestsicos utilizados Evitar erros de interpretao nas culturas quantitativas, principalmente urina e

Transportar as amostras imediatamente ao laboratrio para: de microbiologia trabalha basicamente em funo da viabilidade dos microrganismos. durante a coleta, pois eles podero exercer atividade bactericida. lavado broncoalveolar.

Os esfregaos devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualizao, mas, tambm, bastante esparso para revelar as caractersticas do agrupamento. Os melhores resultados sero obtidos se as mesmas permanecerem no lcool at o momento do uso. A tcnica para preparo do esfregao deve ser realizada da seguinte maneira: Identificar a lmina. Rolar toda a superfcie do swab sobre a lmina para no destruir as clulas. Fixar rapidamente na chama. Quando material escasso, demarcar a rea do esfregao. Proceder o mtodo de colorao mais apropriado.

Amostra coletada com swab Rodar o swab suavemente pela lmina limpa, evitando a destruio dos elementos celulares e dos grupamentos Quando somente um swab for coletado, coloc-lo em um tubo estril contendo uma pequena quantidade de salina estril (0,4 ml) e agitar (vortex) Comprimir o swab contra as paredes do tubo e utiliz-lo para fazer o esfregao. O restante do material pode ser inoculado nos meios de cultura. Observao: materiais clnicos coletados com swab so menos recomendados para cultura. Coletar, sempre que possvel, dois swabs: um ser utilizado para fazer o esfregao e o outro para cultura. Aspirados, exsudatos, etc. Materiais recebidos em seringas sero transferidos para um tubo estril e agitados (vortex), quando necessrio Selecionar a poro mais purulenta ou mucosa com pipeta ou ala bacteriolgica Amostras muito espessas ou purulentas podem ser diludas com uma gota de salina estril e espalhadas sobre uma grande rea da lmina formando um esfregao delgado

Escarro

Com auxlio de ala bacteriolgica ou um palito de madeira, pescar uma poro purulenta do escarro que seja representativa Rolar esta poro na parede do frasco para separar do material salivar Em seguida, colocar o material na extremidade de uma lmina limpa confeccionando um esfregao delgado Quando a quantidade de saliva for grande e pequenas pores purulentas forem visveis, transferir a amostra para uma placa de Petri para facilitar a retirada do material representativo Urina jato mdio - Homogeneizar bem o material e utilizar uma gota da amostra, sem centrifugao Cultura em caldo - Transferir uma a duas gotas para uma lmina limpa utilizando ala bacteriolgica ou pipeta; - Espalhar suavemente o material a fim de obter um esfregao delgado. Meio slido - Utilizar uma gota de salina estril em uma lmina limpa; - Transferir uma pequena poro da colnia com ala bacteriolgica; - Misturar suavemente para obter um esfregao levemente turvo e homogneo. Observao: para evitar a formao de aerossis, nunca misturar o material vigorosamente. 4.2.1 Fixao do Esfregao Todo o esfregao, antes de ser submetido colorao, deve estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando 50C. A fixao excessiva e o superaquecimento iro distorcer a morfologia celular e a fixao insuficiente permitir a sada do material durante o processo de colorao. Deixar a lmina esfriar antes de iniciar a colorao. A fixao pelo metanol ou etanol tambm pode ser utilizada. Alm de prevenir a lise das hemcias, evita que os esfregaos, principalmente os de urina, desprendam-se no momento da colorao. Deixar o esfregao secar numa superfcie plana; aps, colocar uma a

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duas gotas de lcool (1min), drenando o excesso, sem lavar. No aquecer a lmina antes da colorao.

4.3 Exames Diretos sem Colorao 4.3.1 Salina O exame direto com salina permite observar a morfologia bacteriana e verificar a existncia de motilidade. utilizado tambm para pesquisa fresco de Trichomonas em secrees e fungos (leveduriformes ou filamentosos) em diversos materiais. Materiais - Salina (Soro fisiolgico a 0,85%) - Lmina - Lamnula Procedimento - Goteja-se uma gota de salina no centro da lmina de microscopia e nela suspende-se uma colnia ou uma alada do material a ser investigado. - Cobre-se com a lamnula e observa-se ao microscpio em objetiva de 40X ou 100X. 4.3.2 Hidrxido de potssio utilizado para pesquisar fungos (leveduriformes e principalmente filamentosos) em material biolgico na presena de muco, restos celulares, escamas de pele, pelos e unhas. A adio de hidrxido de potssio facilita a microscopia j que esse dissolve a queratina e o muco destacando as estruturas fngicas, quando presentes. Materiais - Hidrxido de potssio em soluo aquosa a 10% ou 20% - Lmina - Lamnula Procedimento: - Coloca-se uma pequena quantidade do material no centro da lmina - Adiciona-se uma ou duas gotas de KOH

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- Cobre-se com a lamnula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente para acelerar o clareamento - Examina-se com objetiva de 10X ou 40X. Obs: As lminas podero ser colocadas em cmara mida e, aps 24 horas, realizar segunda leitura ao microscpio.

4.4 Colorao de Gram A colorao de Gram usada para classificar as bactrias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratrio de microbiologia clnica este um teste rpido para o diagnstico de agentes infecciosos, sendo tambm utilizado para avaliar a qualidade da amostra clnica analisada. As interpretaes dos esfregaos corados pelo Gram envolvem consideraes relacionadas com as caractersticas da colorao, tamanho, forma e agrupamento das clulas. Estas caractersticas podem ser influenciadas por vrios fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubao e a presena de substncias inibidoras. o mtodo de anlise utilizado para bacterioscopia da maioria dos materiais biolgicos ou culturas de microrganismos em meios slidos ou lquidos; para as amostras analisadas de culturas jovens (<24h) de meio de cultura sem inibidores e amostras clnicas recm-coletadas, para as quais fornecem os melhores resultados, e ainda, para a verificao da morfologia bacteriana a partir de esfregaos de cultura em caldo. Procedimento: - Cobre-se a rea com a soluo de cristal-violeta por cerca de um minuto. - Decanta-se o cristal-violeta e lava-se suavemente com a prpria soluo de iodo ou gua da torneira. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das clulas Gram-positivas). - Cobre-se a rea do esfregao com a soluo de iodo Lugol durante cerca de um minuto. - Descora-se a lmina com a mistura lcool-acetona (1:1), at que o solvente escorra incolor. - Alterna-se com gua corrente. O tempo usualmente utilizado nesta etapa de cerca de 10 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta

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das clulas Gram-positivas, assim como, a pouca descolorao pode resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactrias Gram-negativas). - Cobre-se o esfregao com a soluo de safranina (ou Fucsina bsica 0.1% a 0.2%), por cerca de 30 segundos. - Lava-se com gua corrente. - Deixa-se secar ao ar, em temperatura branda (50C). As bactrias Gram-positivas retm o cristal-violeta e se apresentam com colorao violeta enquanto as Gram-negativas so descoradas pelo lcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina) e se apresentam rseas.

4.5 Procedimentos para semeadura em meios de cultura 4.5.1 Semeadura qualitativa A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feito com o prprio swab ou amostra do material removida com ala flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentrao do inculo, que permita o isolamento de todas as colnias diferentes. Recomenda-se que a semeadura e a leitura das placas sejam realizadas pelo mesmo profissional para aprimorar a tcnica de semeadura e isolamento de colnias.

Fonte: ORGANIZAO MUNDIAL DA SADE, 2002.

4.5.2 Semeadura quantitativa O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do nmero de UFC (unidades formadoras de colnia) obtidas aps incubao. Utilizam-se dois artifcios para o efeito de diluio do material: - Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100 L. O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 ml, relativo ao volume inoculado;

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1.000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por ala calibrada ou pipeta com ponteira estril. - Tcnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluio seriada do material em escala decimal, isto , 1:10, 1:100, 1:1.000 O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 ml, relativo diluio utilizada; 10, 100, 1.000 ..., respectivamente. 4.5.3 Procedimentos gerais - Descarrega-se o material num canto da placa; - Flamba-se a ala; - Esfria-se a ala em um canto do gar; - Semea-se partindo da ponta da primeira semeadura. - A cada mudana de direo flamba-se a ala e esfria-se. - Homogeneiza-se o material com agitao manual em diferentes direes ou em vortex (mixer). - Obtm-se o volume definido pela tcnica com o auxlio de uma pipeta com ponteira estril ou ala calibrada. No caso da ala, observa-se a integridade da pelcula formada at deposit-la na parte superior da placa. Ainda com a ala, sem flambar at o final da semeadura, distribuir o material em linha reta at a outra extremidade. Perpendicularmente, distribui-se o material por toda a superfcie de maneira uniforme. Repete-se o mesmo procedimento por 3 vezes, ou at que a superfcie da placa esteja seca, alterando a direo da estria (vide figura abaixo). - Evita-se o uso de placas midas e, aps semeada, no incubar caso haja umidade na superfcie do gar. - Evita-se o rompimento do gar, estriando o material suavemente.

Fonte: ORGANIZAO MUNDIAL DA SADE, 2002.

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4.6 Incubao A incubao deve seguir alguns parmetros determinados: Atmosfera - Para bactrias no exigentes em secrees, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera ambiente. - Para bactrias exigentes tais como: pneumococos, hemfilos e Neisserias ou fastidiosos incubar em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 3-5% de CO2). - Para Campylobacter necessrio tenso de 5 a 10% de CO2 e restrio de O2 sendo conveniente o uso de geradores especficos. - Para bactrias anaerbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita. Temperatura - 36oC +/- 1oC a temperatura para a grande maioria das bactrias da rotina, incluindo os anaerbios e micobactrias. - Fungos podem ser cultivados a 30oC ou 25 e 35oC. - Temperatura 42oC pode ser necessrio para isolar espcies de Campylobacter, Acinetobacter aumannii, e algumas espcies de Pseudomonas. Umidade - Bactrias fastidiosas e exigentes (neisserias patognicas e hemfilos) crescem melhor se forem incubadas num recipiente com tenso de 5% de CO2 com um chumao de algodo embebido em gua estril. Tempo - Em geral a primeira leitura realizada com 18 a 24 horas de incubao ou em casos de urgncia para iniciar a identificao e antibioGrama, a partir de 6 horas possvel visualizar crescimento de algumas enterobactrias. - Para anaerbios recomendvel a primeira leitura com 48 a 72 horas de incubao. - Para bactrias exigentes ou de crescimento lento o perodo de incubao pode ser bastante prolongado: Micobactrias de 3 a 45 dias; Nocardia, 4 a 7 dias; Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas at 45 dias).

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4.7 Caractersticas macroscpicas das colnias Alguns aspectos so fundamentais na leitura inicial das placas para se estabelecer um diagnstico presuntivo e direcionar o exame: Tamanho O tamanho das colnias dever ser considerado na placa como um todo, uma mesma cepa pode formar colnias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa: - Puntiforme (<1 mm de dimetro) - colnias muito pequenas, caractersticas de bactrias mais exigentes. - Pequena (at 2 mm de dimetro) Shigella e Yersinia costumam crescer em MaC Conkey e Salmonella-Shigella como colnias pequenas e lactose negativa. Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp, Enterococcus spp, pneumococos, Streptococcus spp. Cndida spp e alguns esfafilococos coagulase negativo tambm costumam formar colnias pequenas. - Mdia (at 3 mm de dimetro) Enterobactrias, no fermentadores e Estafilococos. - Grandes (mais de 4 mm de dimetro) Bacillus spp, algumas enterobactrias como Klebsiella e Enterobacter, o mesmo ocorre com no fermentadores como Pseudomonas. Vale lembrar a formao de vu, caracterstico do gnero Proteus, Comamonas e algumas cepas de Pseudomonas. Cor A colorao depender do meio de cultura utilizado. Meios no diferenciais pode-se identificar a colorao caractersticas de alguns microrganismos: - S. aureus amarelo - Micrococcus amarelo - Serratia avermelhado - Roseomonas - rseo - Pseudomonas diferentes tons de verde e castanho - Enterococcus casseliflavus amarelo Meios diferenciais a colorao da colnia sofre interferncia das reaes que ocorrem com substratos dos meios de cultura: - Utilizao da lactose no Mac Conkey vermelho - Utilizao da lactose no CLED amarelo - Utilizao do manitol em gar manitol salgado amarelo

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- Produo de H2S no Hecktoen Enteric e Salmonella-Shigella negro Hemlise Baseada na lise de hemcias contidas no gar Sangue (5%) - Lise total denominada beta-hemlise, ocorre a formao de halo de transparncia ao redor e/ou sob a colnia: S. pyogenes, S. agalactiae, Listeria, S. aureus, S. haemolyticcus, Enterococcus. - Lise parcial denominada alfa-hemlise, h formao de halo com colorao esverdeada: S. viridans, S. pneumoniae, Enterococcus. - Ausncia de lise definida como gama-hemlise, meio de cultura inalterado: Enterococcus, Estafilococos coagulase negativo. Forma da colnia - Redonda E. coli, Klebsiella, Serratia, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos - Irregular Pseudomonas, Proteus, Providencia, Morganella, Bacillus - Produo de vu Proteus, Comamonas, Pseudomonas - Filamentosas fungos filamentosos - Formando pontas, como estrelas Cndida - Com depresso no centro Pneumococo - Cerebriforme Pseudomonas stutzeri - Elevada Klebsiella, Bacillus - Chata Enterobacter, Pseudomonas Consistncia - Frivel, quebradia - Moraxella - Mucide Klebsiella, Pseudomonas, Bacillus - Seca E. coli, Citrobacter, S. aureus - Butirosa (manteiga) Candida Cheiro - Eikenella corrodens cheiro de cloro - Pseudomonas cheiro adocicado

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- Anaerbios cheiro ftido Densidade - Opaca: E. coli, Candida, S. aureus - Brilhante: Stenotrophomonas, Pneumococo

4.8 Identificao de Staphylococcus Para a identificao de bactrias do gnero Staphylococcus, principalmente o Staphylococcus aureus, uma das espcies de maior importncia mdica, utiliza-se a prova da coagulase. De maneira geral, os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos. Este teste, pode, ainda, ser realizado de duas formas: em lmina e em tubo.

4.9 Identificaes de Streptococcus e Enterococcus Para se diferenciar as espcies dentro do gnero dos estreptococos so utilizadas trs etapas de identificao: 1. Propriedades sorolgicas (grupos de Lancefield). 2. Padres hemolticos 3. Propriedades bioqumicas (fisiolgicas) A identificao sorolgica feita apenas para os estreptococos -hemolticos, porm, essa prova no acessvel a todos os laboratrios. importante notar que as identificaes devem ser feitas e gar sangue e elas se dividem em: -hemoltico -hemoltico -hemoltico

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4.10 Provas de identificao de cocos Gram positivos 4.10.1 Prova da catalase Reagentes: Perxido de hidrognio 3% armazenado em frasco mbar. Cultura de 10 a 48 horas do microorganismo a ser testado Procedimento: Com a ala bacteriolgica ou com um palito coleta-se o centro de uma colnia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Coloca-se sobre este esfregao uma gota de gua oxigenada a 3% e observar a formao de bolhas. Interpretao: O teste positivo se houver formao de bolhas rapidamente. Interferentes: Algumas bactrias contm outras enzimas, que no catalase, que podem decompor o perxido de hidrognio, mostrando o aparecimento de bolhas pequenas aps 20 a 30 segundos. Nesse caso, o teste considerado negativo. A catalase est presente nas clulas vermelhas do sangue, por isso deve-se tomar cuidado para no carregar pores do gar sangue juntamente com as colnias para evitar a obteno de resultados falso-positivos. 4.10.2 Coagulase A maioria das cepas de S. aureus possui a coagulase ligada fator de aglutinao clumping factor- na superfcie da parede celular, que reage com o fibrinognio do plasma causando coagulao do mesmo. Reagentes: Plasma com EDTA Colnia a ser testada Procedimento: Colocam-se 2 gotas de salina em uma lmina Emulsiona-se uma colnia isolada a ser testada Adiciona-se 1 gota de plasma e mistura-se com palito de plstico ou madeira

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Observa-se se h aglutinao em 10 segundos Interpretao: O teste positivo quando ocorre a formao de precipitado granuloso ou de grumos brancos. Essa prova considerada apenas presuntiva e todas as culturas que apresentarem resultado negativo ou positivo tardio devem ser examinados atravs da prova em tubo, pois algumas cepas produzem coagulase livre que no reagem na prova em lmina. 4.10.3 Teste de CAMP Reagentes: Deve ser realizada na mesma placa do teste da Bacitracina Cepa de S. aureus produtor de beta lisina Cepa de estreptococos alfa-hemolticos a ser testada Procedimentos: - Inocula-se uma estria nica de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina no centro de uma placa de gar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. - Inoculam-se as amostras a serem testadas em estrias formando um ngulo reto com a linha de inoculao da amostra teste de estafilococo. As estrias no devem se tocar, ficando a 1 mm de distncia, e deste modo vrias amostras podem sertestadas em uma mesma placa de gar sangue. A maneira de inocular fundamental para a observao do efeito esperado. - Incuba-se a placa a 35-37C durante um perodo de 18-24 horas. Interpretao: O teste positivo para Streptococcus agalactiae, quando h evidencia de alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha caracterstica, na rea de interseco entre as duas estrias.

4.11 Enterobactrias A famlia Enterobacteriaceae constitui a maior e mais heterognea coleo de bacilos Gram negativos de importncia mdica, sendo o grupo de bactrias mais isolado das amostras biolgicas. Tipicamente, estas bactrias produzem colnias secas ou mucides relativamente grandes de cor cinza opaco em gar sangue. Entretanto, a diferenciao baseia-se

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principalmente na presena ou ausncia de diferentes enzimas codificadas no material gentico bacteriano. Com poucas excees, todos os membros da famlia Enterobacteriaceae possuem as seguintes caractersticas: 1. Fermentao da glicose 2. Citocromo oxidase negativa 3. Reduo de nitrato a nitrito As principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica so: Fermentao da glicose Fermentao da lactose Motilidade Utilizao de citrato Descarboxilao da lisina Produo de sulfeto de hidrognio (H2S) Produo de gs (CO2) Oxidase Produo de indol Produo de urease Produo de fenilalanina desaminase ou opotriptofanase Produo de gelatinase ou opo DNAse

Os esquemas de identificao baseiam-se na determinao dos gneros e espcies mais isolados na clnica, e nas provas mais caractersticas de cada gnero e espcie, baseado em alguns critrios como: facilidade de execuo, facilidade de interpretao, custo, rapidez para leitura, etc.

4.12 Bacilos gram negativos no fermentadores Os bacilos Gram negativos no-fermentadores (BNFs) so um grupo de microorganismos aerbios, ou seja, no utilizam carboidratos como fonte de energia ou os degrada por outras vias metablicas que no a fermentao. Embora a sua incidncia seja

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pequena, geralmente apresentam resistncia vrios antibiticos e so capazes de causar infeces graves. Suspeita-se que um bacilo Gram negativo desconhecido pertence ao grupo de nofermentadores quando se observa uma ou mais das caractersticas seguintes: Ausncia de evidncias de fermentao da glicose Reao positiva de citocromo oxidase Ausncia de crescimento em gar MacConkey

4.13 Meios de cultura O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. gar sangue (AS) meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de hemfilos e outros fastidiosos gar chocolate (AC) meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e facultativas. Quando incubado em CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se observar halos esverdeados com colnias alfahemolticas gar Mac Conkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilizao de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo. Lactose positiva colorao avermelhada Lactose negativa colorao inalterada Como exceo, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus gar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra)

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gar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao alaranjada) e produo de H2S (colorao negra) gar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adio de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactrias, Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas. Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae

4.14 Teste de suscetibilidade antimicrobiana O princpio do teste de susceptibilidade microbiana medir a capacidade de um antibitico inibir o crescimento bacteriano in vitro. Utilizam-se os discos comercialmente disponveis com dimetro apropriado. Aps a incubao das bactrias no meio devidamente preparado, faz-se a interpretao dos resultados de acordo com os dimetros onde no houve crescimento dos microrganismos. Os valores das medidas dos dimetros so comparados ao de uma tabela e travs da qual, determina-se a capacidade da bactria ser susceptvel, intermedirio ou resistente. O teste de disco-difuso, ou antibiograma, baseado na presena ou ausncia de um halo de inibio e a medida do seu dimetro correlacionada s concentraes inibitrias mnimas (CIMs). Os testes de sensibilidade so indicados quando se acredita que o organismo causador da infeco pertence a uma espcie capaz de demonstrar resistncia aos agentes antimicrobianos normalmente usados. 4.14.1 Prova de sensibilidade por Disco-Difuso (Kirby-Bauer) Leitura das Placas e Interpretao dos Resultados Aps 16-18 horas de incubao, examina-se cada placa. A placa deve ser satisfatoriamente semeada para que os halos de inibio resultantes se formem crculos uniformes. Os dimetros dos halos de inibio total so mensurados em milmetros com um paqumetro ou uma rgua, incluindo-se o dimetro do disco. O tamanho dos halos de inibio interpretado com a utilizao de uma tabela, onde, classificam-se os organismos como sensveis, intermedirios, ou resistentes aos agentes testados.

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5 CONCLUSO

O setor de Microbiologia, como qualquer outro setor do Laboratrio de Anlise Clnicas um setor onde precisa trabalhar com muita ateno e precauo utilizando adequadamente os equipamentos de proteo individual (EPIs) devido o manuseio com amostras de sangue. Os procedimentos dos testes devem ser realizados cuidadosamente analisando cada passo e observando possveis contaminaes cruzadas como falta de limpeza, esterilizao meio de cultura no eficiente e outros, os quais podem vir a levar alterao no resultado do exame, assim faz-se necessrio a padronizao da execuo dos mtodos para um resultado mais seguro e confivel. O papel do farmacutico no setor acompanhar a realizao correta dos exames, a padronizao da execuo dos mtodos, interpretao dos resultados para liberao do laudo e garantia do controle de qualidade.

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REFERNCIAS

MINISTRIO DA SADE. SECRETARIA NACIONAL DE ASSISTNCIA SADE. Manual de procedimentos bsicos em microbiologia clnica para o controle da infeco hospitalar. Braslia, 1991. MOURA, Robeto de Almeida. WADA, Carlos S. PURCHIO, Adhemar. ALMEIDA, Therezinha Verrastro de. Tcnicas de Laboratrio.3 ed. So Paulo: Editora Atheneu, 2006. MURRAY, Patrick R. et al. Microbiologia mdica. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. 762p. ORGANIZAO MUNDIAL DA SADE. Procedimentos laboratriais em bacteriologia clnica. 2.ed. So Paulo: Santos Livraria Editora, 2002. 122p. PARDINI, Hermes. Manual de Exames e Servios. Belo Horizonte, 2006/2007 Procedimentos Laboratoriais. Disponvel em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_3_2004.pdf>. Acesso em 30 de Junho de 2011. ROSSI, Flvia; ANDREAZZI, Denise B. Resistncia bacteriana: interpretando o antibiograma. Rio de Janeiro: Atheneu, 2005. 118p