FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA

NÚCLEO DE SAÚDE

CURSO DE MEDICINA

DISCIPLINA DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

Métodos imunocromatográficos (teste rápido) X ELISA ou

IMUNOFLUORESCENCIA

Caroline Moreira Nicochelli

Daniela Iwakiri Matias

Fabiana Oliveira de Souza

Moisés Samuel G. de Oliveira

Walesca Ferraz Agustini

Porto Velho – RO

2014
Métodos imunocromatográficos (teste rápido) X ELISA ou IMUNOFLUORESCENCIA

Por

Caroline Moreira Nicocheli

Daniela Iwakiri Matias

Fabiana Oliveira de Souza

Moisés Samuel G. de Oliveira

Walesca Ferraz Agustini

Trabalho apresentado em
cumprimento à exigência e avaliação
da disciplina de Métodos Diagnóstico
ministrado pela Profa. Eulália Aquino
da Fundação Universidade Federal de
Rondônia no período de 2014/2.

Porto Velho - RO

2014
INTRODUÇÃO

Os testes rápidos, desenvolvidos ao final da década de 80, são muito importantes

quando o profissional de saúde precisa realizar medidas imediatas. Além disso, são testes de
triagem bastante econômicos por não necessitarem de estrutura laboratorial e pelo fato de sua
leitura e interpretação serem feitas a olho nu.
Afim de uma complementação e confirmação diagnósticas de diversas enfermidades,
testes como o teste de Imunofluorescência e o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay)
vem ganhando força como métodos imunológicos, capazes de qualificar e quantificar em
diferentes graus a concentração de antígenos e anticorpos de amostras, tornando-se técnicas
padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas por apresentarem alta sensibilidade e
especificidade.
O diagnóstico de doenças infecciosas e que tem uma história natural agressiva deve ser
feito no maior número de doentes e o mais rápido com maior precisão possível. Dessa forma,
o desenvolvimento de novas tecnologias para diagnóstico é essencial para a diminuição a
morbidade e a mortalidade dessas doenças. Entretanto, não basta haver um método se não
houver planejamento e conhecimento de como analisar, proceder e orientar um paciente com
teste positivo. Por isso, em dezembro de 2013 o Ministério da Saúde do Brasil publicou um
Manual Técnico para Diagnóstico da Infecção pelo HIV com o objetivo de orientar e
esclarecer os profissionais de saúde.
Mesmo com os avanços, os resultados falsos-positivos e falsos-negativos ainda são
possiveis, por erro do operador, erro da conduta adequada ou até mesmo a forma peculiar que
o vírus se manifesta em cada indivíduo. Além disso, ainda existe a reatividade cruzada de
anticorpos que pode ser uma causa dos erros nos métodos imunológicos de diagnóstico.

TESTE RÁPIDO - IMUNOCROMATOGRAFIA

Ao final da década de 1980, uma nova estratégia diagnóstica surgiu. Chegaram ao

mercado, os testes rápidos. Com o avanço das tecnologias de desenvolvimento e produção,
esses testes revelaram-se eficientes na investigação de doenças infectocontagiosas. Desde
2005, a utilização dos testes rápidos permite atender à crescente demanda para o diagnóstico
de agravos relevantes à saúde publica, visto que sua utilização aumenta a agilidade da
resposta aos indivíduos e permite seu rápido encaminhamento para assistência médica e início
de tratamento. Testes rápidos são, primariamente, recomendados para testagens presenciais.
Podem ser feitos com amostra de sangue total obtida por punção venosa ou da polpa digital,
ou com amostras de fluido oral. Dependendo do fabricante, podem também ser realizados
com soro e (ou) plasma.
A execução dos testes rápidos, habitualmente, é muito simples e a capacitação de
pessoal pode ser realizada presencialmente, ou por meio de ensino a distância. São testes cuja
execução, leitura e interpretação dos resultados são feitas em, no máximo, 30 minutos. Além
disso, são de fácil execução e não necessitam de estrutura laboratorial.
A imunocromatografia é uma técnica que começou a ser desenvolvida nos anos 60,
sendo primeiro criada para o estudo das proteínas séricas. Nesses ensaios é utilizada uma
matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de acetato transparente. Para detectar
antígeno, emprega-se um anticorpo de captura, ligado à matriz e um anticorpo marcado
específico ao antígeno pesquisado. Para detectar anticorpo, utiliza-se um antígeno específico
ligado à matriz e um anticorpo anti-imunoglobulina marcado.
Atualmente o método é usado para a detecção de muitas doenças infecciosas como
dengue, malária, amebíase, peste bubônica, brucelose, giardíase, leishmaniose visceral,
hepatite B, infecção por HIV, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae, entre outras.
Diferentemente dos métodos convencionais, a imunocromatografia não exige a
presença de especialistas e de equipamentos para a realização do diagnóstico, o que reduz o
custo do processo e torna possível a realização de exames epidemiológicos em regiões
carentes. A técnica deve permitir identificar doenças com mais rapidez, e assim aumentar as
chances de recuperação dos pacientes. 
O procedimento básico para a realização dos testes inclui o uso de equipamentos de
proteção individual, identificacão do teste e colocação das iniciais do nome do paciente,
assepsia do dedo escolhido para a coleta e coleta do sangue com uma pipeta ou com a alça
redonda da haste, que coleta apenas uma gota. Em seguida segue-se a instrução do kit de
colocar o sangue diretamente na área indicada no teste ou diluir a amostra na solução tampão
antes de realizar o teste. Na imunocromatografia não é necessário realizar grande coleta de
sangue, tampouco produzir o soro: ele vale-se diretamente do sangue colocado em contato
com a membrana de nitrocelulose. Quando a amostra for a saliva, é preciso instruir o paciente
a friccionar por 4 vezes a escova presente no kit tanto na gengiva inferior quando na superior.
Vale lembrar ainda que o todo kit deve ser armazenado em temperarura entre 2°C e 30°C
graus.
Existem dois tipos de imunocromatografia, a imunocromatografia de fluxo lateral e a
imunocromatografia de duplo percurso. A fase sólida de ambas é composta pela fita de
nitrocelulose impregnada de anticorpos ou antígenos específicos e de microesferas que darão
a coloração. Por cima tem-se uma membrana de acetato transparente que permite a
visualização da reação.
Na imunocromatografia de migração lateral existe a área 1, onde é colocado a amostra
do paciente e uma gota de solucão tampão diluente. No caso do teste para hepatite B, por
exemplo, a membrana é impregnada com dois anticorpos monoclonais anti HBs Ag ligados a
microesferas de poliestireno de cor vermelha e por albumina de soro bovino ligada a
microesferas de poliestireno de cor azul. Se a amostra obtida contiver antígenos de superfície
do vírus da hepatite B eles se ligarão aos anticorpos das esferas vermelhas e migrarão ao
longo da membrana ligando-se aos anticorpos anti HBs imobilizados na área de teste,
formando complexos visíveis de cor vermelha. O complexo de albumina ligado a esferas
azuis migra ao mesmo tempo e liga-se ao anticorpo antibiotina imobilizado na área de
controle, tornando-se visível em azul.
O bem popular “teste de farmácia” também é um método de imunocromatografia de
fluxo lateral, onde o HCG presente na amostra liga-se ao conjugado formado por anticorpo
monoclonal anti-HCG/corante formando um complexo antígeno-anticorpo. Este flui pela área
absorvente da tira teste indo se ligar aos anticorpos anti-HCG na área da reação positiva (T)
determinando o surgimento de uma banda colorida se a concentração do hormônio na amostra
for superior a 25 mUI/mL. Na ausência de HCG não haverá o aparecimento desta banda. A
mistura da reação continua a fluir atingindo a área de controle (C). O conjugado não ligado ao
antígeno une-se aos reagentes desta área produzindo uma banda colorida, demonstrando que
os reagentes estão funcionando corretamente.
Na imunocromatografia de dupla migração a amostra é colocada na área 1 juntamente
com o tampão. Logo após coloca-se 4 gotas da solução tampão na área 2. Estas 4 gotas
favorecem a migração do conjugado impregnado na fita de nitrocelulose, que no caso do teste
para HIV, por exemplo, é composto por proteína A e ouro coloidal. O conjugado e os
anticorpos presentes na amostra vão se encontrar e se ligar na área que antecede a linha teste.
Na linha teste ocorre uma nova ligação com os anticorpos fixados e assim o surgimento de
linha vermelha. A linha controle se cora quando os conjugados não ligados aos anticorpos
continuam a migrar pela fita, demonstrando o correto funcionamento dos corantes.
Para ambos os métodos o teste é dito reagente ou positivo quando existe a coloração
da linha T e C, não reagente ou negativo quando apenas a linha C fica colorida e inválido
quando a linha C não se torna corada.
TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
As reações imunológicas que envolvem a ligação antígeno-anticorpo podem ser
visualizadas ou quantificadas por meio de diferentes marcadores para o antígeno ou para o
anticorpo. Entre os marcadores mais comumente empregados, podem-se citar os
fluorocromos, as enzimas e os compostos radioativos e eletro opacos.
Os fluorocromos são corantes que absorvem radiação (luz ultravioleta), são por ela
excitados e emitem luz visível. Para que funcionem como marcadores, necessitam possuir
grupos químicos capazes de formar ligações covalentes com moléculas protéicas, emitindo
alta fluorescência no espectro visível com coloração emitida pelos tecidos.
Um dos fluorocromos mais utilizados é o isotiocianato de fluoresceína (FITC), de cor
verde, que tem um pico de absorção de 490l e de emissão de 520l. A rodamina, outro agente
utilizado na IFD, de cor vermelha, possui picos distintos de absorção e de emissão (520l e
610l). Utiliza-se um microscópio de epiluminescência.
Os estudos de imunofluorescência desempenham importante papel na investigação de
enfermidades diversas e são determinantes no diagnóstico laboratorial de algumas doenças. A
técnica da Imunofluorecência tem como príncipio Anticorpos ou Antígenos conjugados
( ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por
radiação UV, emite luz no espectro visível.
Assim como a ligação Ag-Ac é específica, um Anticorspo conjugado pode ser usado
para detectar um determinado antígeno e vice-versa. A reação é feita em lâminas de
microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microscópio
com luz UV (microscópio de fluorescência). As principais modalidades são:
Imunofluorescência direta e indireta. O microscópio de fluorescência com epiluminação é o
mais empregado e tem como funcionamento básico uma emissão de luz UV atinge o material
examinado e a fluorescência emitida chega ao observador.
A Imunofluorescência Direta consiste basicamente na adição de anticorpos (em geral
monoclonais), conjugados com fluorocromo, a uma lâmina contendo fragmento de tecido ou
esfregaço (com antígenos). Em seguida, lava-se a solução afim de se retirar os conjugados não
fixados. O anticorpo conjugado que reconhecer o antígeno específico será observado ao ser
analisado no microscópico.
Utilização da técnica: detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas
fezes, em cortes de tecidos etc. Também bastante utilizada na fenotipagem de células
tumorais. A Imunofluorescência Indireta tem por base, seu funcionamento muito semelhante a
Imunofluorescência Direta, porém, o Anticorpo conjugado com fluorocromo é um Anti-
Anticorpo específico que se liga ao Anticorpo específico ao Antígeno procurado.
A imunofluorescência indireta é muito usada para o diagnóstico sorológico de várias
doenças infecciosas como Doença de Chagas, a AIDS, as hepatites etc. É uma técnica onde se
consegue alta sensibilidade e especificidade. Apesar de poder detectar IgM específico, é
muito útil para o diagnóstico de doenças crônicas, onde a detecção de anticorpos IgG ou IgA
confirma a suspeita clínica, como na Doença de Chagas. Tem como maior desvantagem o uso
do microscópio de imunofluorescência, cuja luz é UV, além de ser um teste qualitativo ou
semi-quantitativo e nunca quantitativo (quem detecta a reação é o olho humano). Entre as
desvantagens do seu uso destaca-se o alto custo do microscópio de fluorescência; trata-se de
uma técnica realizada manualmente, aumentando a chance de erro e a subjetividade na leitura
do resultando, tratando-se de uma técnica qualitativa.

TESTE DE ELISA
Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de antígenos
e anticorpos, apresentam grande sensibilidade e especificidade e tornaram-se técnicas
padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas. Entre esses métodos, um dos mais usados é
o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay). Trata-se de um método eficiente que
permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).
Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUÍCHE. Nesse método, o
anticorpo de um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no “poço” (well). Depois, o
antígeno (soro, urina ou outra solução contendo o antígeno) é adicionado e se liga ao
anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo ligado à enzima é adicionado. Nesse
caso, a intensidade da reação é proporcional à quantidade de antígeno.
Quanto ao método de revelação, pode ser direto ou indireto. No primeiro, a enzima
reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo, enquanto no indireto, a
enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo. O ELISA constitui a base do teste para
infecção por HIV. Nesse teste, proteínas virais (os antígenos) adsorvem nos “poços” (wells)
da placa de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se
ligam aos antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à enzima ligam-se aos anticorpos
humanos, propiciando a reação enzimática com mudança de cor.
Procedimento para ELISA SANDUICHE: Coloca-se, na placa de ELISA, solução
tampão contendo o primeiro anticorpo com concentração conhecida e suficiente para adsorver
nos “poços” (“wells”) da placa. Em geral, a solução é saturada. Lavam-se os “poços” com
tampão de lavagem, de forma a retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.
 Incubação com as amostras (soluções teste com antígenos em concentração
desconhecida devem ser adicionadas à placa). Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o
anticorpo previamente aderido à placa também permanecerá aderido. Por outro lado, os
antígenos não ligados serão removidos. Incubação com segundo anticorpo, seguida de
lavagem. Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a uma enzima, como a
peroxidase. Segue-se outra lavagem. Adiciona-se um substrato incolor para revelação
que quando ativado pela porção enzimática do ligante, produz um produto final corado. A
mudança de cor pode ser lida diretamente em aparelho apropriado. Em geral, bloqueia-se a
reação para evitar que o produto final fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além
de bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que provoque mudança para uma cor cuja
absorbância é melhor detectada pelo leitor de ELISA.
Interpretação dos resultados: a intensidade da cor é diretamente proporcional a
concentração de antígeno da amostra pesquisada, no ELISA DIRETO e a intensidade da cor é
diretamente proporcional a concentração de anticorpos específicos no ELISA INDIRETO.
Vantagens da técnica: teste de alta sensibilidade, portanto menor risco de falsos-
negativos. Teste de alta especificidade, menor risco de falsos-positivos.
Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo. Realização
relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de
imunodiagnóstico.
Desvantagens do teste: necessidade de mão de obra especializada deve-se tomar
cuidado com reagentes que podem sofre alteração quando expostos a elevadas temperaturas e
luz solar e por se tratar de uma técnica altamente sensível e específica, é muito suscetível a
erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.

TESTES RÁPIDOS, ELISA E DIAGNÓSTICO DE GRAVIDEZ

Todos os testes de gravidez utilizados visam identificar a gonadotrofina coriônica

humana (HCG) produzida logo após a fecundação e implantação do óvulo ao útero. A
determinação deste exame, na urina ou no sangue, é a forma mais utilizada para o diagnóstico
precoce da gestação. A produção de HCG é o sinal que o embrião lança na circulação para
que o organismo materno reconheça a gestação e seja capaz de manter a implantação do
embrião.
Os níveis de HCG na gestação normal podem ser dosados pouco tempo após a
implantação. Em outras palavras, o HCG é o marcador mais importante para a gravidez.
Segundo manuais de laboratórios fabricantes de testes Elisa, em mulheres não grávidas e
homens saudáveis, os níveis estão tipicamente abaixo de 1 – 2 mUI/mL e aumentam pelo
menos 66% a cada 48 horas, alcançando o pico máximo entre 50 e 75 dias de gestação, ou
seja, aproximadamente no segundo mês. No segundo e terceiro trimestre da gestação os níveis
são mais baixos.
A presença de gonadotrofina coriônica na circulação torna o diagnóstico de gestação
muito provável, entretanto o diagnóstico de certeza necessita de algum dos três sinais
positivos de gestação: A presença de batimentos cardíacos fetais (BCF), a identificação, pelo
médico, dos movimentos fetais e a visualização do feto.
A importância do diagnóstico precoce de uma gravidez envolve diversos motivos, tais
como o planejamento familiar e da equipe de saúde, saber se o feto terá viabilidade ou alguma
doença congênita, o diagnóstico de gravidez condenada à interrupção (casos de doenças que
não permitem a correta implantação ou casos de estupro), além de auxiliar em estratégias para
pacientes com histórico de aborto de repetição, necessidade de terapia medicamentosa
precoce, ou suspensão/adaptação de terapias existentes, intercorrências que possam afetar o
feto, diagnóstico diferencial de amenorreias, tumores abdominais e neoplasias trofoblásticas.
Com a evolução dos métodos laboratoriais, é possível a maior especificidade e
sensibilidade quanto aos exames realizados para o auxílio no diagnóstico de gravidez. Os
exames mais conhecidos são os de imunocromatografia de fluxo lateral, encontrado em
farmácias e o de Elisa direto, realizado em laboratórios.
O teste rápido é um método barato, rápido, de fácil execução, não necessita estrutura
laboratorial, nem a demanda de profissionais para leitura e execução. É um teste baseado na
imunocromatografia, geralmente de fluxo lateral, que fornece uma análise qualitativa do
resultado para a presença de HCG na urina da mulher: positivo, negativo ou indeterminado.
A FEBRASGO (Federação Brasileira das Associações de Ginecologia e Obstetrícia)
preconiza que testes imunocromatográficos tenham boa sensibilidade quando atinjam níveis
acima de 100 mUI/mL, ou seja, aproximadamente 14 dias após o atraso menstrual.
(SOGIMIG, P. 709, 2012). Nesta fase, a mulher que desconfia do diagnóstico procura por
meio do teste rápido, confirmar ou afastar a hipótese, até que se dirija a uma unidade de
saúde. O problema está no fato de que, geralmente, a mulher que tem seu ciclo atrasado (em
potencial a que possuem ciclo regular), realiza o teste de farmácia muito antes do nível de
HCG atingir uma concentração confiável, resultando em alguns falso-negativos.
Nesse caso, o método mais confiável e disseminado nos laboratórios, é o teste através
do sangue da mulher, realizado pelo método Elisa direto. Este teste determina
quantitativamente a presença de HCG no soro humano. O princípio do teste HCG Elisa, se
baseia na técnica clássica do Elisa direto e faz uso de um sistema de alta afinidade biotina-
estreptavidina. As etapas do teste Elisa direto foram explicadas, e no final a absorbância dos
calibradores e amostras é determinada usando leitores de tiras e microplacas de Elisa. A
concentração das amostras desconhecidas é interpolada a partir de uma curva dose resposta
gerada por soros controles com concentrações conhecidas de HCG.
Para a FEBRASGO, a identificação do auxílio no diagnóstico da gravidez através de
ensaios sorológicos fornece uma concentração adequada aproximadamente sete dias após a
fecundação, na implantação uterina pelo embrião, ou seja, com concentração aproximada de
25 a 30 mUI/mL. Níveis extraordinariamente mais baixos podem ser detectados por técnicas
de radioimunoensaio, com concentrações menores que um nanograma/mL. (FERREIRA, et
al., p.72, 2009)
Contudo, tanto para a FEBRASGO, quanto para o Ministério da Saúde, em seus
manuais para acompanhamento pré-natal e puerperal, concluem que apenas o teste
laboratorial para gravidez não fecha o diagnóstico. É necessária a repetição do teste, caso
positivo, além da confirmação por outros exames complementares, como a ultrassonografia
(US) transvaginal. (Figura 4 e 5)

Figura 1 – Diagnóstico de Gravidez preconizado pelo Ministério da Saúde

Figura 2 – Diagnóstico de Gravidez preconizado pela FEBRASGO

TESTES RÁPIDOS, ELISA E DIAGNÓSTICO DE HIV

O HIV é uma partícula esférica, que mede de 100 a 120 nm de diâmetro, pertencente
ao gênero Lentivirinae e família Retroviridae, apresentando em seu núcleo duas cópias de
RNA de cadeia simples, encapsuladas por uma camada proteica ou núcleo-capsídeo, capsídeo
e um envelope externo composto por uma bicamada fosfolipídica.

O genoma do HIV inclui três principais genes que codificam as proteínas estruturais e
enzimas virais: gag, env e pol. A nomenclatura das proteínas virais utiliza a abreviação “gp”
para glicoproteína ou “p” para proteína, seguida de um número que indica o peso molecular
em kilodaltons (kd). O gene gag codifica a p55, a partir da qual quatro proteínas estruturais do
capsídeo são formadas: p6, p9, p17 e p24. O capsídeo que circunda o ácido nucleico viral
contém p24, p6 e p9, enquanto a p17 se encontra em uma camada entre o núcleo proteico e o
invólucro, denominada matriz proteica, a qual reveste a superfície interna da membrana viral
(Figura 1).
Figura 3- Estrutura do vírus HIV

Após a transmissão do vírus, há um período de aproximadamente 10 dias, denominado

de fase eclipseG (do inglês, eclipse phase), antes que o RNA viral seja detectável no plasma.
A replicação viral ativa e a livre circulação do vírus na corrente sanguínea causam a formação
de um pico de viremia por volta de 21 a 28 dias após a exposição ao HIV. Essa viremia está
associada a um declínio acentuado no número de linfócitos T CD4+.
Como em qualquer outra infecção viral, a primeira classe de anticorpo produzida
durante uma resposta primária é a imunoglobulina M (IgM). Devido à persistência do HIV,
nosso organismo é continuamente exposto aos mesmos antígenos e a produção inicial de IgM
é substituída pela produção de imunoglobulina G (IgG). Por outro lado, existem indivíduos
(controladores de elite), chamados de controladores de elite, que mantêm a viremia em um
nível que pode ser indetectável em testes moleculares. Nesses casos, o diagnóstico só pode ser
realizado mediante a utilização dos testes confirmatórios: Western Blot e Imunoblot.
O diagnóstico do HIV começa com exames de triagem que poder ser eles: testes
rápidos (imunocromatográficos) e imunoensaios como ELISA de 4ª geração (detectam IgG e
IgM anti-HIV e antígeno p24). A infecção pelo HIV pode ser diagnosticada por meio da
detecção direta de componentes do vírus (antígeno p24, RNA ou DNA pró-viral). A detecção
do antígeno p24 do HIV-1 ou de RNA ou DNA desempenha um papel importante quando a
detecção de anticorpos não é possível. São especialmente úteis para o diagnóstico em crianças
com idade inferior a 18 meses e na infecção aguda em adultos. A detecção molecular de
ácido nucleico é mais sensível do que a detecção de p24.
 Assim, o Ministério da Saúde propôs fluxogramas para se fazer o diagnóstico de HIV.
Utilizar-se-á nesse trabalho apenas dois fluxogramas como exemplos, os demais poderão ser
acessado no Manual Técnico de Diagnóstico da Infecção pelo HIV.
Há fluxogramas utilizando-se dois testes rápidos utilizando sangue como testes de
triagem, entretanto o segundo teste rápido utilizado deve ser de fabricante diferente do
primeiro. Além disso, a sensibilidade do primeiro teste deve ser igual ou superior a do
segundo, com isso objetiva-se diferencias indivíduos infectados (2 testes positivos) de
indivíduos falsos positivo (apenas teste positivo)- Figura 2. Existe também a possibilidade de
se usar dois testes rápido analisando fluídos diferentes.
Foi formulado também fluxogramas utilizando imunensaios (IE): ELISA com testes
moleculares e com testes confirmatórios como Imunoblot e Western Blot (Figura 3). Esse
último fluxograma apresenta como mais oneroso que os demais pois há mais exames e mais
caros envolvidos para o diagnóstico. Já o fluxograma que utiliza apenas IE e testes
moleculares evita o uso de testes complementares do tipo WB, IB e IBR e elimina resultados
negativos ou indeterminados desses testes. A principal limitação do teste molecular é a
possibilidade de ocorrerem resultados falso-positivos, quando utilizados para fins
diagnósticos, tendo em vista que a especificidade varia de acordo com o conjunto diagnóstico
utilizado. Em sua maioria, resultados falso-positivos tendem a apresentar resultados muito
próximos ao limite de detecção do ensaio.

Figura 4- Fluxograma utilizando dois testes rápidos como triagem

Figura 5- Fluxograma utilizando IE e testes moleculares para diagnóstico

ELISA OU TESTE RÁPIDO?

Observa-se que um teste não exclui o outro, os dois são usados como testes de triagem
e devem ser feitos de acordo com a necessidade, especificidade de cada individuo e região.
Entretanto, o teste rápido permite maior acesso diagnóstico a populações mais afastadas dos
grandes centros e que estão vulneráveis. A tabela 1 mostra uma comparação entre os dois
testes:
ELISA Teste Rápido
Vantagens -Mais barato; -Mais rápido;
-Se negativo paciente não precisa -Fácil execução;
realizar outro exames; -Não necessita de infraestrutura
- Mais sensível que específico. laboratorial;
-Paciente testado deve estar
presente;

Desvantagens -Método oneroso;
-Realizado em centros
especializados;
-O paciente pode fazer, mas não
busca o resultado do exame.
-Uso desnecessário.
Tabela 1- Vantagens e desvantagens do teste rápido e ELISA.
-Facilita diagnóstico de pacientes
que moram em área de difícil
acesso.
-Pouco uso de normas e não
existe uma regulamentação
segura;
-Alto custo;
-Um único teste não permite o
diagnóstico;
-Falta de preparo do profissional
que executa;

TESTES RÁPIDOS PARA DIAGNÓSTICO DA DENGUE

A dengue é uma arbovirose causada por um Flavivirus, pertencente à família

Flaviviridae, e transmitida pelo mosquito Aedes aegypti, apresentando quatro sorotipos
conhecidos (Den-1, Den-2, Den-3 e Den-4). É uma doença infecciosa aguda, de gravidade
variável, com período de incubação de 3 a 15 dias, com média de 5 a 6 dias (GUBLER,
1998). Os sintomas clínicos são caracterizados por febre alta (39°C a 40°C), de início abrupto,
seguido de cefaleia, mialgia, prostração, artralgia, dor retroorbital, astenia, anorexia, náuseas,
vômitos, exantema e prurido cutâneo. As formas hemorrágicas da doença são as mais graves e
podem ocorrer: gengivorragia, petéquias e equimoses, gastroenterorragia, choque e morte. O
achado laboratorial importante é a trombocitopenia. A febre hemorrágica da dengue acorre em
2 a 4% dos indivíduos reinfectados (REY, 2002).
Por ser uma doença endêmica com surtos epidêmicos, cresce o receio da população e,
com isso, a vontade de um diagnóstico rápido, já que o exame padrão demora até cinco dias
para ficar pronto. O teste rápido da dengue, que detecta a doença em minutos e já pode ser
feito após o primeiro dia do início dos sintomas, é feito com restrições na rede pública e
alguns laboratórios particulares (G1 RJ, 2011).
O teste rápido da dengue é um ensaio imunocromatográfico que pode detectar
diferentes antígenos da dengue, dependendo do kit em questão (LACEN, 2014). Os testes
podem ser realizados com proteína não estrutural 1, mais conhecida como NS1, e/ou com
IgM, IgG ou IgA para o vírus da Dengue. Em casos de epidemia de dengue, alguns grupos
podem ser priorizados, como idosos, gestantes, crianças com doenças crônicas, pacientes com
deficiências imunológicas (como câncer) e pacientes que chegam ao hospital com quadro
clínico grave de dengue. Isso pode ocorrer quando há à limitação na quantidade de kits
disponíveis, assim como aconteceu no surto epidêmico no Rio de Janeiro em 2011 (G1 RJ,
2011).
A NS1 é uma glicoproteína, que possui elevada quantidade de aminoácidos e
nucleotídeos homólogos entre flavivírus, não faz parte da partícula viral, mas é liberada das
células infectadas pelo dengue. Estudos preliminares têm mostrado que ela está envolvida na
replicação do RNA viral, e foi encontrada em amostras da fase aguda do sangue de pacientes
com infecções primárias ou secundárias (OLIVEIRA et al, 2013). Em sua forma solúvel pode
ser detectada nas amostras de fase aguda da doença por testes imunocromatográficos e
enzimaimunoensaios (ELISA). O NS1Ag é um ótimo biomarcador sorológico para o
diagnóstico de dengue e sua detecção confirma a infecção pelos DENV (CSVES, 2014).
Apesar de ser um teste de fácil e rápida realização, apresentando alta sensibilidade e
especificidade diagnóstica, testes negativos ainda não descartam a infecção por dengue
(Dengue NS1 – K130 (811 kB) – Bioclin).
A pesquisa do NS1Ag deverá ser realizada em amostras de sangue total, soro ou
plasma de pacientes com até 5 dias de sintomas de dengue, devendo-se dar preferência para
amostras com até 3 dias do início dos sintomas e em todos os casos graves que necessitem do
diagnóstico precoce da doença. Além de ser um teste diagnóstico utilizado na fase inicial da
dengue, antes mesmo do aparecimento dos anticorpos da classe IgM/IgG, a detecção do
antígeno NS1 tem sido empregado como teste de triagem para a técnica de isolamento viral,
outro método de diagnóstico utilizado na dengue (HIPERLINK - Dengue NS1 – K130 (811
kB) – Bioclin).
O teste imunocromatográfico que detecta antígeno NS1 para o vírus da dengue
apresenta no kit linhas “T” e “C” como linha teste e linha controle na superfície do
dispositivo. Ambas as linhas na janela de resultados não são visíveis antes da aplicação da
amostra. A linha controle irá sempre ser visualizada se o procedimento do teste tiver sido
realizado corretamente e se os reagentes estiverem funcionando. A linha de teste irá ser
visível na janela de teste se na amostra analisada existir o vírus da dengue. Os anticorpos
monoclonais de Dengue NS1 selecionados são utilizados na linha teste como captura e
detecção de material.
 Para realização do teste, a amostra deve estar em temperatura entre 15 e 30ºC antes de
iniciar, retira-se a tira reativa da embalagem protetora e a identifica de forma adequada. Após,
transfere-se 100 μL de sangue total, soro ou plasma dentro da janela de amostra. Deve-se
esperar então a formação das linhas após o repouso de 15 a 20 minutos. O teste não deve ser
interpretado após 30 minutos.
Se o teste for positivo, haverá formação duas linhas vermelhas, uma na região teste (T)
e na região do controle (C), nos primeiros 15 a 20 minutos. Se negativo, uma linha vermelha
na região controle (C) e ausência completa de linha vermelha na região teste (T). Caso o teste
seja inadequado, haverá ausência completa de linha na região controle (C) com ou sem linha
vermelha na região de teste (T) e a amostra deverá ser testada novamente (Figura 6). A linha
na região controle pode aparecer antes dos 15 minutos de incubação do teste, e isso não
significa que resultados negativos podem ser interpretados antes do tempo.
A punção digital não é recomendável, pois o sangue pode ser insuficiente ou coagular.
Caso o teste seja negativo, porém houver persistência dos sintomas, a hipótese de dengue não
poderá ser descartada até a realização de outros testes. Ademais, o resultado positivo isolado
não serve como diagnóstico para doença, devendo esse ser realizado em conjunto com os
dados clínicos do paciente e testes complementares.

Figura 6 – Diferentes resultados do teste rápido com NS1 para dengue.

 Outros testes rápidos estão relacionados com a resposta imune do paciente, como o
diagnóstico por IgM e IgG. A produção de IgM por volta do 5º ao 8º dia do aparecimento dos
sintomas, persiste, geralmente, por 30 a 60 dias, embora, em alguns casos, possa estar
presentes por alguns meses. A detecção de IgM, portanto, indica uma infecção recente ou fase
aguda da doença. Já a produção de IgG ocorre por volta do 14º dia, podendo persistir por toda
a vida, caracteriza uma infecção pregressa. Como a infecção por um subtipo não confere
imunidade aos demais subtipos, podem ocorrer reinfecção ou infecção secundária, com
aumento de IgG específica após 1 a 2 dias do aparecimento dos sintomas e surgimento de IgM
específica mais tardiamente.
O teste imunocromatográfico utilizando IgM e IgG qualifica e difere anticorpos anti-
IgG e anti-IgM contra os 4 sorotipos do vírus da dengue em soro e plasma humano
(HIPERLINK - Imuno-Rápido Dengue IgG/IgM - WAMA Diagnóstica). Quando
imunoglobulinas específicas da dengue, IgG e/ou IgM, estão presentes na amostra, elas ligam-
se aos antígenos recombinantes (DEN-1, DEN-2, DEN-3 ou DEN-4) do envelope viral
conjugados com ouro coloidal. Esta reação forma um complexo antígeno-anticorpo que migra
por capilaridade pela membrana da placa-teste e são capturados por anti-IgG e/ou anti-IgM
humanas imobilizadas em duas áreas distintas, determinando o surgimento de uma banda rosa
característica nas áreas correspondentes. Se a amostra não contiver anticorpos anti-dengue,
nenhuma banda colorida aparecerá nas respectivas áreas. Um reagente controle imobilizado
na membrana da placa-teste determinará o surgimento de uma terceira banda rosa, cuja
presença demonstrará que os reagentes estão funcionando corretamente (área controle “C”).
Caso o resultado seja negativo, somente uma banda rosa-clara aparecerá na área do
controle (C). Isso significa que não foram detectados anticorpos IgG e IgM anti-dengue. É
recomendável que se faça um novo teste após 3 a 5 dias se a infecção por dengue ainda é
suspeita. Se positivo para IgM (infecção primária da dengue), aparecerão duas bandas rosa
clara, uma na área (M) e outra na área do controle (C). Se positivo para IgG (infecção
secundária ou passada da dengue) aparecerão duas bandas rosa clara, uma na área (G) e outra
na área do controle(C). Se positivo para IgG e IgM (infecção primária tardia ou infecção
secundária precoce da dengue) aparecerão três bandas rosa clara, uma na área (M), outra na
área (G) e outra na área do controle (C). É válido ressaltar que qualquer intensidade de cor
rosa nas áreas testes deve ser considerada como positivo. Se o teste for inválido, não surgirá
nenhuma banda visível nas áreas (M), (G) e do controle (C), ou senão surgir banda na área do
controle (C). Os resultados então devem ser ignorados após o tempo determinado para leitura
o teste deve ser repetido utilizando uma nova placa-teste.
 Estudos mais pioneiros exploram ainda a aplicabilidade de um teste rápido por IgA
(SILL et al.; TAN et al., 2011), comparando com os testes com IgM e IgG. Os resultados dos
testes comparativos indicam quase uma equivalência entre os testes e sugerem ser viável a
aplicabilidade para diagnóstico da dengue aguda e tardia pelo teste rápido (RT) ASSURE®
Dengue IgA.

CONCLUSÃO
Para o diagnóstico de gravidez, a maioria dos testes emprega um anticorpo
monoclonal, que é específico para a subunidade do β-HCG. Este procedimento é empregado
para garantir que os testes não resultem em falsos positivos confundindo o HCG com FSH ou
LH. (Os dois últimos são sempre presente em diferentes níveis no corpo, enquanto que a
presença de HCG quase sempre indica a gravidez).
É importante frisar que, tanto para o ministério da saúde, quanto para a FEBRASGO,
o diagnóstico para gravidez não se dá através da positividade dos testes, seja por meio de soro
ou ensaio imunocromatográfico pela urina. Exames que identifiquem a movimentação fetal, a
presença de batimentos cardíacos fetais e a visualização do feto são necessários, uma vez que
pode ocorrer a liberação de HCG em gravidez ectópicas, ou em gestações anembrionárias.
Entretanto, o exame quantitativo de HCG é útil, não só no diagnóstico de gravidez,
como no acompanhamento de células germinativas trofoblásticas e tumorações, cuidados após
o aborto e gravidez ectópica.
As desvantagens gerais de testes quantificadores de HCG é que os mesmos não
diagnostica gestações múltiplas, não afere idade gestacional, não identifica gestação ectópica
e sua localização e não identifica gestação anembrionada.
Os testes rápidos no diagnóstico da dengue, apesar de proporcionarem um rápido e
eficaz tratamento clínico dos pacientes e um oportuno controle etiológico da doença pelos
profissionais de prevenção nas áreas atingidas, não são suficientes para o diagnóstico, podem
gerar resultados falsos negativos e devem ser complementados com a clínica e outros métodos
diagnósticos.

Por fim, o teste rápido faz uma verdadeira revolução diagnóstica, facilitando o acesso
do paciente a um teste de triagem bastante confiável, bem como prevenindo agravos na saúde,
na medida em que o diagnóstico se torna cada vez mais acessível.
Essa revolução permite que mais pessoas tenham acesso ao diagnóstico de HIV, que é
uma doença de alta prevalência e que quanto mais rápido o diagnóstico, melhor o prognóstico
do paciente, isso reflete o aumento de um dos princípios filosóficos do SUS que é a
acessibilidade. Os testes rápidos estão disponíveis em várias unidades de saúde e podem ser
solicitados quando as pessoas fizeram relações sexuais sem uso de preservativo e com pessoas
suspeitas.
Entretanto, deve-se lembrar de que o diagnóstico deve ser realizado de acordo com as
diretrizes do Ministério da Saúde, para que minimize ao máximo os falsos negativos e
positivos devido ao operador dos testes. Para maior sucesso dos diagnósticos de pacientes
HIV deve-se conhecer e sempre que possível acessar os do Manual para o Diagnóstico da
Infecção pelo HIV.
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