BIOLOGIA MOLECULAR

NOVOS RUMOS

 Na tentativa de superar alguns dos problemas da microscopia,

métodos baseados em análises sorológicas foram
desenvolvidos e são considerados o padrão ouro para diversas
doenças infecciosas.

 Apesar de largamente utilizados na rotina laboratorial, esses

métodos não permitem, em alguns casos, uma clara
diferenciação entre as infecções prévias e as recém-adquiridas,
dificultando o estabelecimento de critérios de cura.
 NOVOS RUMOS

 Outro ponto crítico é a perda da especificidade quando se

usa, como antígeno, extratos totais do microorganismo –
reações cruzadas (T. cruzi e Leishmania).

 Da mesma forma que a sorologia veio tentar superar as

dificuldades encontradas na microscopia, as técnicas de
Biologia Molecular e DNA recombinante estão contribuindo
para o aperfeiçoamento dos métodos de pesquisa de
marcadores biológicos específicos para o diagnóstico das
doenças infecciosas.
 CITOMETRIA DE FLUXO

 É uma técnica que permite medidas rápidas em partículas ou

células enquanto elas passam uma a uma através de um sensor,
sendo as medidas realizadas em uma partícula de cada vez e não
como valores médios da população total.
 O citômetro de fluxo analisa eletronicamente os sinais gerados
pelas células em suspensão, quando elas são interceptadas por
um feixe de luz com comprimento de onda específico (laser).
 Conforme as células passam através do feixe de luz, promovem
um espalhamento da luz em todas as direções em um padrão
que depende do seu tamanho, forma e estrutura; e as moléculas
marcadas com fluorocromos são excitadas e se tornam
fluorescentes.
SEPARAÇÃO DE CÉLULAS ATIVADAS POR
FLUORESCÊNCIA

 A citometria de fluxo permite medir vários parâmetros

celulares simultâneamente e separar subpopulações de células
em misturas complexas.

 emprega-se 2 parâmetros de espalhamento de luz e 3 de

imunofluorescência em cada célula.
SEPARAÇÃO DE CÉLULAS ATIVADAS POR
FLUORESCÊNCIA

 As células da amostra são marcadas com conjugados

fluorescentes específicos para detectar moléculas de superfície
e então são introduzidas em uma câmara de fluxo vibratório
do separador.
 O fluxo celular é iluminado pelo laser, e cada célula é medida
pelo seu tamanho (detector de espalhamento frontal de luz),
granulosidade ou forma (detector de espalhamento de luz a
90º) e tipo de fluorescência.
 Após a medida, as células continuam no jato até serem
incorporadas por gotas.
 Os sinais analíticos de cada célula são comparados a padrões,
de acordo com critérios específicos, e o aparelho determina se
a célula deve ser separada ou não.
 SEPARAÇÃO DE CÉLULAS ATIVADAS POR
FLUORESCÊNCIA

Pode fornecer contagem de linfócitos CD4+, CD8+ e CD3+ em números

absolutos por μl de sangue; e a relação CD4+/CD8+, úteis para monitorar o
estado imune dos pacientes HIV+
 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR

 Nos últimos 20 anos observou-se uma série de avanços

técnicos na área de Biologia Molecular.

 Descoberta, purificação e aplicação das endonucleases de

restrição, enzimas que reconhecem sequências específicas
de nucleotídeos, clivando as moléculas de DNA nestes
pontos.

 Com estas enzimas, desenvolveu-se a capacidade de criar

moléculas de DNA recombinante (clonagem, genotecas).

 Técnicas mais recentes, como a hibridização, amplificação e

o sequenciamento de nucleotídeos têm propiciado novas
ferramentas para o conhecimento dos diversos processos
biológicos.
 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
CONCEITOS BÁSICOS

 A identificação e clonagem de um segmento de DNA

baseiam-se na construção de genotecas de DNA.

 As enzimas reconhecem sequências específicas de 4 ou 6

nucleotídeos, clivando sempre nestes pontos. Ex: a Eco RI
cliva qualquer molécula de DNA toda vez que a sequência
GAATTC for encontrada.

 Quando duas moléculas de DNA de organismos diferentes são

clivadas pela mesma enzima, elas passam a apresentar
extremidades compatíveis.

 Esta compatibilidade de extremidades permite a construção de

moléculas híbridas contendo fragmentos de DNA dos dois
organismos.
DNA RECOMBINANTE
Clonagem Molecular

- Obtenção DNA recombinante

Clonagem Molecular
PCR (POLIMERASE CHAIN REATION)
 Consiste na amplificação gênica sequencial de fragmentos de
DNA predeterminados e específicos de um microorganismo.

 Uma vez amplificada, esta sequência de nucleotídeos poderá

ser detectada por uma eletroforese em gel.

 A técnica de amplificação é relativamente simples e segue as

mesmas regras do processo fisiológico.

 Na natureza, a DNA-polimerase é a enzima responsável pela

replicação da molécula de DNA, na presença dos 4
nucleotídeos (A, G, C e T) para formar uma célula filha
idêntica à célula mãe.
 PCR

• Extração do ácido nucléico

• Amplificação

• Detecção do produto amplificado

 PCR
Componentes da reação

Seqüência alvo de DNA

ou cDNA

MgCl2 Enzima
 Taq DNA polimerase
dCTP
dATP
dGTP

dTTP
Primer
 PCR
Desnaturação por aquecimento (95ºC)

cDNA ou DNA
 PCR
Ligação do primer ao cDNA ou DNA
(50-60ºC)
 PCR
A enzima catalisa a extensão
do primer (72-74ºC)
 PCR
Fim do primeiro ciclo  Amplicom
 PCR
Final da reação

Amplicon
 PCR
Amplificação Exponencial do Alvo

1 ciclo = 2 Amplicons No. de No. Amplicon

2 ciclo = 4 Amplicons Ciclos Cópias do alvo

3 ciclo = 8 Amplicons 1 2

2 4
4 ciclo = 16 Amplicons
3 8
5 ciclo = 32 Amplicon
4 16

5 32
6 ciclo = 64 Amplicons
6 64

20 1.048.576
7 ciclo = 128 Amplicons
30 1.073.741.824

A detecção ou quantificação desta sequência pode ser feita pelos vários métodos
existentes, especialmente por eletroforese e revelação com luz ultravioleta.
 Eletroforese em gel de agarose

Separa as moléculas de DNA quanto ao seu tamanho e

compactação
Técnica rápida, sensível e precisa.
DNA é visualizado no gel devido a substâncias intercalantes =
Brometo de etídio (DNA emitirá fluorescência na luz UV)
 PCR
Identificação - Eletroforese em gel de
agarose

Negativo

Produto da PCR,
corado com
Brometo de etídeo
e visualizado
sob luz
ultra-violeta

Positivo
FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%
UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

1400
1300

600
500
400
300
200

100
Marcador
de pares de
base (pb)
 FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%
UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

1400
1300

600 600 600

500
400 400 400 400
300
200

100 100 100 100 100

Marcador de
pares de base TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE
(pb) DNA AMPLIFICADOS
 Aplicações do PCR
Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes
utilidades/ aplicações:

1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela

geração de produtos amplificados que apresentam
alterações em seu tamanho.

2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases),

conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser
determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do
seqüenciamento.
 Aplicações do PCR
3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional
(particularmente para doenças herdadas).
4. Na tipagem para transplantes de órgãos e
susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas
(detecção de polimorfismo para HLA).
5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem
genética, como o câncer, através do estudo dos genes
relacionados a essas doenças.
6. Na medicina forense (DNA fingerprint).
7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes
patogênicos diversos
 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
CONSIDERAÇÕES FINAIS

 Na atualidade, a utilização destes métodos no diagnóstico das

doenças infecciosas têm contribuído bastante como uma
nova ferramenta na pesquisa diagnóstica.

 No entanto, devemos lembrar que o método ideal, que

poderia vir a substituir os métodos convencionais de
diagnóstico, deverá ser simples, rápido, específico, sensível e
barato.

 Apesar de específicos e bastante sensíveis, os métodos que

envolvem técnicas de Biologia Molecular utilizam várias
etapas que inviabilizam a sua inclusão na rotina laboratorial e,
por relação direta, ainda são muito caros para o uso em larga
escala.
 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
CONSIDERAÇÕES FINAIS

 Além disso, a amplificação de material gênico pode tornar o

método tão sensível, que muitas vezes gera discussões sobre
o impacto clínico na detecção de uma dada sequencia
DNA/RNA em termos diagnósticos, prognóstico e
terapêutica.

 Mas certamente, estas novas metodologias estão fornecendo

detalhes acurados de organismos de diferentes regiões
geográficas, contribuindo para os estudos epidemiológicos e
de diferenciação de espécies.