Trabalho

de
Imunologia
Clínica
Integrantes do Grupo:
- Beatriz Andrea Allegrini n.: 6
- Gabriel Teixeira Cagnin n.: 23
- João Victor Gomes de C. n.: 29
- Luana Golveia T. n.: 36
- Loise Maria Tiozzo C. n.: 37
 - MARCADORES TUMORAIS

Os marcadores tumorais são substâncias que podem ser encontradas

no corpo, normalmente no sangue ou na urina, quando o câncer está
presente. Junto com outros exames, os marcadores tumorais podem ser
utilizados para ajudar a diagnosticar o tipo de câncer, e, em alguns casos,
para monitorar o tratamento.
O CA 125 é marcador mais conhecido e utilizado na condução clínica de
pacientes com tumores epiteliais de ovário. É uma sialomucina de elevado
peso molecular, também conhecido como MUC 16, que foi inicialmente
identificada por meio de anticorpos produzidos por animais imunizados com
células de cistadenocarcinoma seroso papilífero do ovário humano. Este
marcador tem sido estudado para o rastreamento de mulheres
assintomáticas, no diagnóstico diferencial de mulheres com massas
pélvicas, no monitoramento de resposta ao tratamento adjuvante e na
detecção precoce de recorrência do tumor após tratamento.
Os parâmetros de sensibilidade e especificidade do CA 125 na detecção
do câncer de ovário variam na dependência de diversos fatores. A
sensibilidade varia entre 24 e 97% e depende principalmente do estádio e
do tipo histológico do tumor. A especificidade varia entre 71 e 100%,
podendo ser comprometida por uma série de eventos fisiológicos (ex.
menstruação), por diversas condições benignas (homens e mulheres com
câncer de pulmão, pâncreas, mama, fígado e cólon, e em pessoas que já
tiveram câncer)hCA 125 é o marcador tumoral padrão usado para
acompanhar as mulheres durante ou após o tratamento do câncer epitelial
de ovário. Os níveis sanguíneos normais são normalmente inferiores a 35
U/ml. Mais de 90% das mulheres com câncer de ovário avançado
apresentam altos níveis de CA 125.
Desse modo, observamos que proteínas produzidas por tecidos tumorais
podem ser consideradas uma forma de "assinatura molecular" da lesão
primária. O desenvolvimento tumoral é um processo complexo que requer a
interação coordenada de numerosas proteínas, e tipos celulares. Como
resultado de extensos estudos sobre patogênese molecular dos tumores
malignos, diversas novas vias e redes regulatórias têm sido identificadas. O
delineamento destas vias tem revelado diversos eventos únicos marcados
por mudanças morfológicas e histológicas na célula, e a expressão de genes
e proteínas que acompanham a transformação oncogênica. Portanto a
assinatura celular muda durante o desenvolvimento do câncer. Pela leitura
destas modificações podemos melhorar a detecção precoce e o diagnóstico
de indivíduos com câncer.
Novas tecnologias para estudo de proteínas têm sido utilizadas para a
identificação de novos marcadores para o câncer de ovário, desse modo,
grande número de marcadores têm sido propostos como úteis para
rastreamento e diagnóstico do câncer de ovário e estão em estudo
atualmente.

Referência: Dos reis, Francisco José Cândido. Rastreamento e diagnóstico

das neoplasias de ovário – papel dos marcadores tumorais. Rev Bras
Ginecol Obstet. 2005; 27(4): 222-7.
 - Radioimunoensaio
O radioimunoensaio (RIE) é uma técnica de quantificação de
substâncias biológicas. No RIE, há quatro componentes básicos que são
imprescindíveis: a substância a ser medida; a substância purificada
convenientemente marcada com radioisótopo, da mesma espécie química
que a substância a ser quantificada (traçador); o anticorpo específico com
grande afinidade pela substância a ser medida; os processos de separação
do complexo antígeno-anticorpo do traçador livre.
O princípio do RIE é a competição entre a substância não-marcada e
a substância a ser analisada, pelo sítio de interação com o anticorpo. As
concentrações do traçador e do primeiro anticorpo permanecem constantes
em todos os tubos de uma mesma análise e só a quantidade da substância
a ser medida é variável (padrão ou amostra). Ao chegar ao estado de
equilíbrio, haverá complexos formados pelo anticorpo com a substância
não-marcada, complexos entre o anticorpo e o a substancia a ser analisada
(traçador), sendo possível separá-los da substância não marcada e traçador
livres, e determinar a radioatividade dos complexos.
O radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios,
drogas, marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em
doenças parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a
quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o
antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra.
No artigo em questão, o RIE foi utilizado para quantificar a
angiotensina-II (ANG-II) em ratos Witzel. Todos os processos que envolvem
a formação e ativação da ANG-II dependem da ligação do peptídeo a
receptores de membrana específicos (AT1 ou AT2), seguida de ativação de
vias de sinalização intracelular. Deste modo é de extrema importância o
desenvolvimento de métodos altamente sensíveis e eficientes para
quantificação dos componentes do SRAA, por ser este essencial para a
manutenção da homeostase dos fluidos corporais.
A presença do resíduo de tirosina na molécula de praticamente todas
as proteínas constitui a base do processo de marcação hormonal com a
utilização do iodo radioativo. Dessa forma é feita a marcação da ANG-II,
permitindo a incorporação do radionuclídeo na molécula protéica. Antes de
realizar o radioimunoensaio (RIE), verifica-se a capacidade de ligação do
primeiro anticorpo específico à ANG-II marcada com radioisótopo e, após, a
titulação desses anticorpos a fim de se determinar a quantidade de ANG-II.
O estudo mostrou uma descrição passo a passo de como realizar o RIE para
ANG-II e como padronizar e validar o RIE para outros peptídeos de
importância na pesquisa básica e clínica, mostrando a aplicabilidade dos
radioisótopos na pesquisa científica e em métodos de diagnóstico.

Referência: Mantovani, Milene. et al. PADRONIZAÇÃO DO

RADIOIMUNOENSAIO (RIE) PARA DOSAGEM DE ANGIOTENSINA II (ANG-II)
E SUA VALIDAÇÃO METODOLÓGICA. Departamento de Fisiologia, Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Avenida
Bandeirantes, 3900, 14049-900, Brasil.
 - FATOR ANTINÚCLEO NA
DERMATOLOGIA
Resumo: Trata-se de artigo de revisão e atualização sobre a pesquisa dos
anticorpos antinucleares, em especial do fator antinúcleo, em que são
abordados os aspectos históricos, epidemiológicos, fisiopatogenia, métodos
de identificação, suas especificidades e interpretação, correlacionando-os
com sua aplicabilidade na prática clínica do dermatologista e do clínico
geral. Palavras-chave: Anticorpos antinucleares; Autoimunidade; Doenças
do colágeno; Imunofluorescência

A pesquisa do fator antinúcleo (FAN) é elemento indispensável em

caso de suspeita clínica de doenças auto-imunes, em especial do grupo das
colagenoses - lúpus eritematoso (LE), artrite reumatóide (AR),
esclerodermia (ES), dermatomiosite (DM), síndrome de Sjögren (SS),
síndrome mista e de sobreposição.
Os métodos de identificação dos auto-anticorpos incluem o Elisa, o
radioimunoensaio, a imunodifusão, a contra-imunoeletroforese, a
imunoprecipitação , o imunoblot, e por fim, a imunofluorescência indireta -
o método mais rápido, fácil e barato .
A Imunofluorescência é definida como uma técnica que possibilita a
visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares, por meio
da utilização de anticorpos específicos, marcados com fluorocromo, capazes
de absorverem a luz ultra-violeta (UV), emitindo-a num determinado
comprimento de onda, permitindo sua observação ao microscópio de
fluorescência (com luz UV). Dentre os fluorocromos mais comumente
utilizados estão: Fluresceína (FITC) e Rodamina (TRICT). E após os
fluoróforos serem excitados por um determinado comprimento de onda,
emitem fótons de luz fluorescentes a um comprimento de onda superior.
Dessa forma, existem dois tipos distintos de imunofluorescência. São
elas: Imunofluorescência direta e Imunofluorescência Indireta;

Imunofluorescência Direta
Utiliza-se esta técnica, também conhecida como técnica de camada
simples, para detecção de antígenos em amostras clínicas utilizando-se
anticorpos marcados com fluorocromos.
As etapas deste procedimento compreendem:
- Fixação do esfregaço da lâmina;
- Tratamento com anticorpo marcado;
- Incubação;
- Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados;
- Visualização no microscópio fluorescente.
As indicações desta técnica são: detecção de vírus, parasitas,
antígenos de tumor de amostras ou monocamadas de células do paciente. É
utilizado também na identificação da distribuição de um antígeno no interior
de um tecido ou compartimento de uma célula.

Imunofluorescência Indireta
 Utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também conhecida como
técnica de dupla camada, na detecção de anticorpos no soro do paciente
por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica
primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se
um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados
antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno.
Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais
evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes associam-se somente
aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos
anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo
capaz de identificar qual a classe a qual o anticorpo pertence.
Habitualmente, a imunofluorescência indireta é utilizada na detecção
de auto-anticorpos, e também, na detecção de anticorpos anti-nucleares
encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.
Assim, os substratos utilizados para detecção do AAN pela
imunofluorescência indireta - FAN , descritos no artigo, podem ser
provenientes de células de fígado de rato ou de células humanas de tumor
da laringe (células HEp-2). As células HEp-2 são mais favoráveis devido a
seu grande núcleo e à fácil exposição de seus componentes. As células de
fígado de rato podem não expressar todos os componentes protéicos
identificáveis para os humanos.
Dessa forma, o FAN positivo deve ser avaliado e correlacionado com
a suspeita clínica, com seu padrão de depósito e diluição. Os diferentes
padrões de depósitos possíveis correlacionam-se com os prováveis
elementos celulares que estão se comportando como antígenos. Assim, na
dependência do padrão do depósito do FAN já se pode inferir contra qual
elemento intracelular está ocorrendo a reação auto-antígeno/auto-anticorpo
e assim saber o significado real do FAN. A partir daí deve-se pesquisar a
especificidade do AAN marcador da doença suspeita em questão
Em resumo, um FAN positivo pode significar auto-anticorpos
presentes no núcleo, nucléolo e também no citoplasma das células, e deve
ser interpretado conforme a última diluição positiva observada, quanto à
localização da fluorescência (núcleo, nucléolo, citoplasma ou aparelho
mitótico) e à morfologia do depósito, se homogêneo, salpicado, difuso, etc

REFERÊNCIA:
Artur Antônio Duarte: Fator antinúcleo na dermatologia*. Acesso em
29/10/2018 através do link:
http://www.scielo.br/pdf/%0D/abd/v80n4/v80n4a10.pdf
 - Avaliação sorológica de HIV por técnicas
de ELISA de quarta geração

O teste de HIV melhorou gradualmente, desde a introdução, em meados da

década de 1980, em termos de sensibilidade e especificidade. Visando
comparar duas metodologias de teste imunoenzimático (ELISA) de 4ª
geração para identificação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi
realizado um estudo das técnicas utilizadas em um centro hemoterápico
para sua determinação. Os métodos utilizados foram estudo retrospectivo
descritivo das técnicas de ELISA de 4ª geração, onde foram analisados
todos os resultados gerados a partir das amostras de sangue obtidas de
doadores com idade de 16 a 68 anos conforme a legislação vigente, que
compareceram a um banco de sangue regional no período de novembro de
2010 a outubro de 2011.São necessárias várias pesquisas para aprimorar
cada vez mais os testes de triagem e dar a devida ênfase a fatores que se
evidenciaram na distorção dos resultados.
A Síndrome da imunodeficiência humana (SIDA), causada pela infecção pelo
vírus da imunodeficiência humana (Human Immunodeficiency Virus, HIV),
foi identificada no início da década de 1980. A SIDA é um dos maiores
problemas de saúde pública do Brasil e do mundo.
Anticorpos contra o vírus HIV aparecem principalmente no soro ou plasma
de indivíduos infectados, em média, 3 a 12 semanas após a infecção. O
período compreendido entre o início da infecção e a detecção dos anticorpos
é denominado de janela imunológica.
O diagnóstico sorológico da infecção por HIV é realizado a partir de métodos
que detectam a presença de anticorpos e ou antígenos específicos para
HIV1. O teste imunoenzimático (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,
ELISA), específico para anti-HIV realizado por ensaio de imunoabsorbância
por ligações enzimáticas tem alta especificidade e sensibilidade.Assim é
classificado como um teste de triagem, pois tem como função detectar
todos os indivíduos infectados com HIV, produzindo poucos resultados falso-
negativos. Seu princípio consiste na detecção de anticorpos dirigidos contra
antígenos virais (usualmente anti-p24, gp41 e/ou gp120). Testes de ELISA
com resultados positivos devem ser confirmados por testes como o Western
Blot (WB).
O teste de “ELISA” se baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis
através de reações enzimáticas. Existem vários modelos de testes de ELISA.
Em sua forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido
a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre
este os soros em teste na busca de anticorpos contra o antígeno. Se
houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação
antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um
segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca
detectar os anticorpos a qual é ligada à peroxidase. Este anticorpo anti-IgG,
ligado à enzima denomina-se conjugado. Os orifícios onde ocorreu a reação
antígeno-anticorpo apresentam uma coloração (variável dependendo do
substrato).
Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que a
presença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição
com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o
antígeno. Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado,
porém a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos.
ELISA de 4º geraçã é superior às gerações antigas não só pelo fato de
conseguir detectar anticorpos contra o HIV mais precocemente, mas
também por conseguir pesquisar o antígeno P24, uma proteína existente no
vírus HIV.O ELISA 4ª geração é, portanto, um teste duplo que procura por
anticorpos e por proteínas do próprio vírus. Deste modo, a janela
imunológica é bem mais curta e o teste consegue detectar infecções com
menos de 4 semanas (em alguns casos em até 2 semanas). A taxa de
detecção do ELISA 4a geração é de 95% com a janela imunológica de 4
semanas. Com janela de 6 semanas, a taxa de acerto é de praticamente
100%.
O estudo realizado foi do tipo retrospectivo descritivo, no qual foram
analisados os resultados das 8475 amostras de sangue de todos os
doadores de um banco de sangue da Região dos Vales no estado do Rio
Grande do Sul coletadas de novembro de 2010 a outubro de 2011. Foram
incluídos no estudo dados de doadores com idade entre 16 e 68 anos e
excluídas todas aquelas amostras testadas com ELISA de 3ª geração. Foram
avaliados os resultados dos testes de HIV realizados com ELISA de 4ª
geração de duas marcas distintas. As empresas fabricantes dos kits foram
preservadas, quanto a identificação utilizando-se apenas a descrição “A” e
“B”.
A empresa “A” utiliza o teste de ELISA baseado no princípio de sanduíche de
antígenos: gp160, peptídeo ANT70 de HIV-1 grupo-O, peptídeo env do HIV-
2 e anticorpos anti-p24 do HIV-1 associados à presença de uma esfera de
conjugado em cada poço de microelisa. A empresa “B” utiliza também o
teste de ELISA baseado no princípio de sanduíche de antígenos e
anticorpos, porém sem a presença de esfera.
Os resultados mostraram que de um total de amostras analisadas no
período do estudo, 6 obtiveram resultados positivos ou incomclusivos para
HIV, as quais foram encaminhadas para realização do WB. Destas seis,
apenas uma amostra foi confirmada como reagente. Estas amostras foram
analisadas e classificadas de acordo com pontos de corte, chamados cut off
(CO), que variam conforme os controles negativos e positivos.
Nas últimas duas décadas houve crescimento considerável da preocupação
com a garantia da segurança transfusional, desencadeada principalmente
pelo surgimento da epidemia de AIDS. Com o aumento da sensibilidade pelo
ELISA de 4ª geração, através de pesquisa da proteína viral p24, foi evidente
o aumento no tempo de detecção de carga viral diminuída. Esta lacuna é
compreensível, porque a área da superfície da fase sólida para a detecção é
constante e limitada, independentemente se é utilizado para um único teste
ou testes combinados.
No entanto, isso não significa que ELISA para detecção de antígeno p24 não
possua deficiências. A proteína viral p24 é um marcador transitório que
pode cair para um nível indetectável após a infecção aguda inicial e só
ressurge na fase avançada da AIDS em pacientes. Assim, os testes
utilizando este marcador são mais valiosos para situações de triagem de
sangue de indivíduos, que não possuem níveis detectáveis de anticorpos,
detectando infecções no início, através do antígeno viral de pessoas que
foram expostas, auxiliando também no monitoramento da terapia
antirretroviral.
A infectividade está relacionada com a concentração de RNA do HIV no
soro, sendo que quando a presença de RNA não é mensurada em exames
laboratoriais, o risco de transmissão é praticamente zero. Crianças que
utilizam a terapia antirretroviral desde seu nascimento podem ter
anticorpos em níveis indetectáveis, em uma carga viral constantemente
muito baixa, tornando-se negativo nos testes de triagem. Segundo um
relato de caso o tratamento antirretroviral, mesmo em uma criança
gravemente sintomática e imunossuprimida, pode resultar em supressão da
replicação viral, tal que anticorpos específicos de HIV-1 não são detectáveis.
Em consequência pode ser erroneamente identificada como sendo HIV
negativo, e isso tem implicações sobre a segurança dos produtos de sangue
e doação de órgãos.
Existe um período curto de 2 a 5 dias, em que ELISA de 3ª geração é
positiva e o teste de Western Blot é negativo. Quando usado o teste de
triagem de 4ª geração, este período aumenta, pois a carga viral circulante
esta aumentada e ainda não houve produção de anticorpos, sendo que após
um período de 3 a 7 dias o ELISA ainda é positivo e o WB indeterminado.
Para a reatividade específica para o HIV é necessário pelo menos duas
proteínas p24, gp41, e gp120/gp160 para a interpretação como um
resultado positivo no WB. Pois de vez em quando há perfis de reatividade
que não são compatíveis, portanto, produz resultados indeterminados, que
muitas vezes refletem o status sorológico real do individuo, como infecção
aguda do HIV-1 ou HIV-2, porém há alguns fatores que interferem nos
resultados, pois as proteínas são encontradas somente no HIV.
Segundo o Ministério da Saúde, quando um indivíduo tem um resultado
positivo no teste de ELISA, negativo ou indeterminado no teste de WB, ele
pode estar na fase de soro conversão. A coleta da amostra 30 dias após a
primeira, confirma o resultado.
Fatores biológicos que causam resultados falso-positivos na pesquisa de
anticorpos anti-HIV, com testes ELISA e WB, dentre outros. Sendo elas
artrite reumatóide; doenças autoimunes; neoplasias malignas; múltiplas
transfusões de sangue; dentre outras. Observou-se que amostras de soro
conversão do HIV tipo 1 foram detectadas mais cedo, com os ensaios onde
há a pesquisa de antígenos e anticorpos em comparação com testes de
pesquisa de somente anticorpos. Essa melhoria pode ser de grande
importância na transfusão de sangue, pois demonstraram que o período de
janela a partir da data de infecção para a detecção é reduzida se comparada
com testes que pesquisam somente anticorpos.
Sendo assim, diversos fatores influenciam na positividade de amostras em
triagens, tais como, tipo de teste utilizado, janela imunológica, o uso de
antirretrovirais, além de fatores biológicos pessoais dos indivíduos
infectados. A eficácia dos testes de triagem de HIV deve ser determinada e
a metodologia aprimorada a fim de que se possa determinar com segurança
a existência ou não de contaminação dos materiais derivados que serão
utilizados posteriormente.

Referência: Schuster, Aline. Et al. Avaliação sorológica de HIV por técnicas de ELISA de
quarta geração. Revista de epidemiologia e controle de infecção. Hospital Santa
Cruz,Volume 3,número 4, 2013 – outubro/dezembro.