BIOLOGIA

MOLECULAR

Juliana Oliveira Rangel

Diagnóstico molecular
de doenças infecciosas
Objetivos de aprendizagem
Ao final deste texto, você deve apresentar os seguintes aprendizados:

„„ Identificar técnicas de biologia molecular utilizadas em diagnósticos.

„„ Descrever o método de diagnóstico específico para cada patologia.
„„ Listar as contribuições da biologia molecular no diagnóstico de
doenças.

Introdução
O diagnóstico molecular de doenças é um campo emergente das análises
clínicas laboratoriais. A identificação e a caracterização das bases genéticas
das doenças torna-se, com frequência, fundamental para o diagnóstico.
A detecção de mutações patogênicas em uma amostra de DNA pode
levar ao diagnóstico, ao possível prognóstico e a uma terapia prospectiva.
Avançadas técnicas da biologia molecular permitem o diagnóstico de
doenças infecciosas, como, por exemplo, o papiloma vírus humano (HPV),
as hepatites virais e a Helycobacter pylori, bactéria associada à ocorrência
de úlceras gástricas. A análise molecular ainda detecta alterações gené-
ticas do próprio organismo e auxilia no prognóstico de doenças como a
síndrome de Down, a doença de Alzheimer e a síndrome de Klinefelter.
Técnicas de biologia molecular também têm sido cada vez mais utili-
zadas para guiar tratamentos personalizados, uma vez que elas permitem
a avaliação, desde a suscetibilidade ao desenvolvimento de determinada
doença, até a identificação de mecanismos individuais de resistência a
determinadas drogas.
Neste capítulo, você vai aprender sobre as principais técnicas de
biologia molecular utilizadas em diagnósticos e conhecer as principais
contribuições que elas trouxeram para a melhoria dos diagnósticos na
prática clínica. Além disso, você irá compreender os benefícios das técni-
2 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

cas moleculares para a área das doenças infecciosas, como, por exemplo,
o aceleramento no diagnóstico.

Principais técnicas de biologia molecular

utilizadas para diagnósticos
A biologia molecular diagnóstica tem evoluído de forma rápida, nos últimos
anos, gerando um grande impacto em diversos laboratórios clínicos e em
centros médicos. Essa evolução iniciou a partir da descoberta do DNA, em
1953, por Watson e Crick, que deu início à era da biologia molecular, a qual
veio a se tornar um instrumento útil para o diagnóstico de diversas doenças
(MOLINA; TOBO, 2004; MELLO; FONSECA-COSTA, 2005). Mas para
que essas metodologias que empregam a biologia molecular são importantes?
Atualmente, as técnicas moleculares, baseadas nos ácidos nucleicos, são
ferramentas valiosas para o estudo e o diagnóstico de uma ampla variedade
de processos infecciosos, neoplásicos e genéticos, de doenças como o câncer,
de doenças genéticas e infecciosas, no geral. Além disso, elas podem auxiliar
nos transplantes de órgãos.

Diversas instituições de saúde aplicam técnicas de biologia molecular e acompanham

sua constante evolução para melhoria no diagnóstico das doenças humanas. A respeito
das grandes áreas da saúde em que os testes moleculares podem ser empregados,
estão a microbiologia (que identifica uma ampla gama de doenças infecciosas) e áreas
de oncologia, de hematologia, de imunologia e de bioquímica clínica.

Desde a grande revolução propiciada pelo desvendamento do DNA, as

metodologias na área da biologia molecular vêm evoluindo de maneira rá-
pida. Em 1975, enzimas de restrição possibilitaram a manipulação do DNA
in vitro, com seu isolamento e amplificação de regiões específicas para sua
clonagem. No mesmo ano, a técnica de Southern blot permitiu o estudo de
doenças genéticas a partir da localização específica de genes. Dois anos mais
tarde, a determinação das sequências de nucleotídeos no DNA pela técnica de
sequenciamento abriu a possibilidade de identificação de doenças genéticas
 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 3

pela alteração de sequências no DNA. Em 1983, Kary Mullis desenvolveu a

famosa técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês poly-
merase chain reaction). A PCR é uma das principais metodologias utilizadas
no diagnóstico de doenças. Por meio de um par de sequências complementares
de nucleotídeos (primers iniciadores) que cercam uma região de interesse,
junto com uma enzima polimerase, múltiplas cópias do DNA podem ser
obtidas. Assim, essa metodologia possibilita a amplificação de diversas vezes
segmentos de DNA a partir de pouco material genético (MOLINA; TOBO,
2004; MELLO; FONSECA-COSTA, 2005).

Em que tipo de materiais são aplicadas as técnicas de diagnósticos da biologia mo-

lecular? São exemplos de materiais biológicos com os quais esses estudos podem
ser realizados:
„„ sangue periférico;
„„ fluidos corporais;
„„ urina;
„„ materiais obtidos por punção;
„„ tecidos frescos;
„„ tecidos embebidos em parafina.
Fonte: Molina e Tobo (2004).

Os testes diagnósticos associados à biologia molecular utilizam inúmeras

fontes de materiais biológicos para investigação clínica. Essas amostras podem
ser coletadas a partir de biópsias, de autópsias, de esfregaços ou simplesmente
de punção de sangue ou de outro fluido corporal. Por exemplo, a técnica de
hibridização in situ (HIS) faz uso de células ou cortes histológicos com a
finalidade de identificar sequências específicas de nucleotídeos. Além disso,
essas sequências podem ser tanto de DNA quanto RNA, e assim detectam
tanto moléculas endógenas quanto moléculas provenientes de organismos
exógenos, como vírus, bactérias e parasitas.
Além da HIS, podemos identificar outras técnicas de biologia molecular
utilizadas no diagnóstico clínico que figuram entre as principais: a PCR, a
técnica de Southern blot, o Northen blot, o Western blot, e o microarranjo.
A PCR oferece, atualmente, algumas modalidades mais avançadas como o
PCR em tempo real, a reação da transcriptase reversa (RT-PCR) e o Multiplex
4 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

PCR. A PCR pode ser considerada a principal e mais consagrada metodologia

de diagnóstico molecular, e vem se consolidando, tanto para a identificação
da doença quanto para seu monitoramento, após o início do tratamento.
Entre as variações que a PCR oferece, está a PCR em tempo real (q-PCR,
do inglês Polymerase chain reaction quantitative real time), que permite
a quantificação do produto de PCR em tempo real, como o próprio nome
indica. Essa metodologia mede a quantidade de fluorescência emitida a cada
ciclo, a partir de uma sonda intercalada no produto de DNA dupla hélice.
Essa quantidade de fluorescência é proporcional ao número de cópias do alvo
de amplificação. Quando um determinado número de cópias é alcançado, a
quantidade de fluorescência aumenta de maneira exponencial. Outra variação
da técnica é a RT-PCR, que possibilita a amplificação de amostras que con-
tenham RNA. A sequência alvo de RNA é inicialmente convertida em uma
sequência de nucleotídeos de cadeia dupla (DNA complementar ou cDNA),
usando uma enzima transcriptase reversa “emprestada” de um retrovírus. A
sequência de cDNA pode, então, ser amplificada utilizando os ciclos de PCR.
Já o Multiplex PCR é uma metodologia que permite o uso de dois ou mais
conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentos de uma mesma
amostra. Por último, o Nested PCR, que é uma variação da PCR convencio-
nal, na qual são utilizados dois pares de primers (em vez de um), mas para
amplificação do mesmo segmento. Veja no Quadro 1 as variações da PCR.

Quadro 1. Resumo comparativo das variações da PCR

PCR em
RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR
tempo real

„„ Uso de sondas „„ Permite „„ Uso de mais „„ Reamplificação

fluorescentes amplificação de um par de uma região
„„ Mais rapidez do RNA de primers interna ao alvo
„„ Maior „„ Uso da iniciadores „„ Maior
sensibilidade enzima „„ Maior especificidade
„„ Capacidade transcriptase sensibilidade
quantitativa reversa

Fonte: Adaptado de Cavalcanti, Lorena e Gomes (2008).

 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 5

Técnicas diagnósticas associadas às patologias

O diagnóstico molecular das doenças infectocontagiosas vem adquirindo papel
primordial na prática da saúde biomédica frente à necessidade de confirmar
uma hipótese relacionada a um determinado patógeno.
Entre as vastas possibilidades de testes diagnósticos dentro da área da
biologia molecular está a PCR, que constitui uma das técnicas moleculares
mais utilizadas em laboratórios clínicos na pesquisa de doenças infecciosas e
do câncer. A PCR pode ser utilizada para detectar uma mutação, por exemplo,
ou para identificar patógenos presentes em amostras, como o fungo Candida
sp ou as bactérias Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrohoea.
Modalidades mais avançadas da PCR, como a q-PCR, aliada à automatização
total da extração de DNA/RNA, já permitem a realização de testes moleculares
como a identificação dos subtipos de HPV relacionados com o câncer do colo do
útero. A RT-PCR, que identifica RNA por meio da transcriptase reversa, permitiu
o diagnóstico do HIV e das hepatites virais (HCV). Além dessas doenças, o
diagnóstico de infecções parasitárias como a toxoplasmose e a leishmaniose, e
infecções bacterianas com difícil diagnóstico etiológico (uretrites e cervicites),
apresentou grande avanço, graças à inclusão das técnicas moleculares.

Existem três técnicas de detecção de HPV com aplicabilidade clínica: captura híbrida
(CH), PCR e ISH. A CH é a mais difundida em nosso meio. Para realizá-la, o médico
deve obter material do colo do útero ou da vagina, no caso da mulher, ou da uretra,
no caso do homem. Além da presença do HPV, esses exames também identificam
o grupo a que pertence o tipo de HPV presente, se é de alto ou de baixo risco e, no
caso da CH, ela quantifica indiretamente a carga de vírus presente (Quadro 2). Essas
informações podem indicar se o indivíduo portador tem maior ou menor risco de ter
uma lesão pré-maligna.

Quadro 2. Subtipos de HPV e risco associado

Classificação epidemiológica Tipos de HPV

Alto risco 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59

Provável alto risco 26, 53, 66, 68, 73, 82

Baixo risco 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81
Fonte: Adaptado de Horta e Raposo (2018).
6 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

Os principais testes disponíveis para infecções virais são:

„„ carga viral para HIV;
„„ carga viral dos vírus da hepatite B e C;
„„ painel viral respiratório (vírus influenza, parainfluenza, adenovírus, rinovírus
coronavírus);
„„ PCR qualitativo e quantitativo para citomegalovírus;
„„ PCR para o vírus da herpes: herpes simples, herpes-zóster;
„„ PCR para influenza H1N1;
„„ PCR para enterovírus;
„„ PCR para parvovírus.

Principais testes para infecções bacterianas:

„„ PCR para Clostridium difficile;
„„ PCR para Helycobacter pylori;
„„ PCR para Mycobacterium tuberculosis;
„„ PCR para Chlamydia trachomatis e Chlamydia pneumoniae;
„„ PCR para Mycolplasma pneumoniae;
„„ PCR para meningococo (Neisseria meningitidis);
„„ PCR para pneumococo (Streptococcus pneumoniae);
„„ PCR para Haemophilus influenzae;
„„ PCR para detecção de genes de resistência a antimicrobianos.
Fonte: Pignatari ([201-?]).

Além da infinidade de doenças que a PCR pode diagnosticar, consiste em

um método fácil, barato e confiável. Outras aplicações desse teste incluem a
clonagem de DNA para sequenciamento genético ou manipulação de genes,
construção de filogenias baseadas em DNA, análise funcional de genes,
diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias. Além da biologia mo-
lecular, a PCR é útil nas áreas forense criminal e arqueologia molecular, pois
atua no reconhecimento de criminosos a antigos cadáveres e, ainda, permite
a identificação de graus de parentesco.

O desenvolvimento recente da q-PCR conferiu grande vantagem à PCR tradicional.

Como o próprio nome indica, essa técnica permite a quantificação do produto de
 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 7

PCR em tempo real, seguindo cada um dos ciclos de amplificação. Esse tipo de PCR
oferece uma vantagem tanto na quantidade quanto na velocidade. Além disso, é menos
propenso à contaminação, já que todo o processo de amplificação e quantificação do
DNA-alvo original para cada amostra é feita em um único tubo selado.
A q-PCR é de grande valor no diagnóstico da dengue, de infecções respiratórias, de
algumas doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) e de meningites. Tanto a presença
ou a ausência de células leucêmicas podem ser avaliadas em amostras de sangue (ou
aspiradas de medula óssea) quanto uma avaliação após o transplante pode ser realizada
para verificar a estabilidade ou o aumento dessas células.
Os resultados da q-PCR podem ser obtidos em 2 horas e, dependendo do instrumento
utilizado, até 96 amostras podem ser testadas em uma única corrida.

A HIS é outra técnica associada à biologia molecular que se baseia na

identificação de sequências específicas de nucleotídeos oriundos de DNA
ou de RNA, os quais podem ser endógenos, virais ou bacterianos. Para a
análise, podem ser utilizadas células ou tecidos emblocados em parafina, e
são utilizadas sondas (sequências de DNA conhecidas, geralmente obtidas de
forma comercial). Essa técnica está sendo empregada, com frequência, com
base em sequências curtas de nucleotídeos marcados com moléculas sinali-
zadoras, e que os sítios de ligação podem ser localizados posteriormente por
reações histoquímicas ou imuno-histoquímicas. A aplicação da HIS na área
de doenças infecciosas tem sido mais utilizada na identificação de infecções
virais, com a tipagem do HPV ou a detecção do vírus de Epstein-Barr. Essa
mesma técnica, por meio de sondas específicas, também pode ser útil para a
detecção de aneuploidias e de alterações gênicas com importância prognóstica
em alguns tumores, como a leucemia linfoide crônica e o sarcoma de Ewing.
Um ramo dessa técnica é a hibridização in situ fluorescente (FISH , do inglês
Fluorescence In Situ Hybridization), que constitui um dos mais modernos mé-
todos de patologia molecular para detectar alterações genéticas em associação
com a morfologia celular, tais como amplificações, fusões e translocações,
as quais podem ser importantes para o diagnóstico, prognóstico e orientação
terapêutica de um grande número de tumores. Essa técnica emprega sondas
marcadas com moléculas fluorescentes (fluorocromos), o que a diferencia
de uma HIS convencional. O interessante é que pode ser utilizado mais de
um fluorocromo na mesma amostra, permitindo múltiplas identificações de
alterações genéticas (MCNICOL; FRAQUHARSON, 1997). A técnica de FISH
apresenta uma grande variedade de aplicações dentro de diferentes áreas de
investigação, incluindo mapeamento genético, biologia evolutiva, ecologia
8 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

microbiana e diagnóstico de doenças. No diagnóstico, ela pode ser empregada

para detecção de microrganismos em ambientes complexos como microbiota
intestinal, cavidade oral, infecções do trato respiratório, hemoculturas, sim-
bioses e em estações de tratamento de água (NEVES; GUEDES, 2012).
Outras técnicas da biologia molecular que também podem ser utilizadas
para diagnóstico, embora com menor frequência, são as de Southern blot,
Northern blot e Western blot. A primeira delas serve para verificar se uma
determinada sequência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA
analisada, e combina uma eletroforese em gel do DNA à transferência deste
para uma membrana de hibridização com o auxílio de uma sonda marcada.
Após a hibridização, a membrana é lavada para remover a sonda não ligada
ao DNA e obtém-se uma imagem por autorradiografia ou autofluorescência.
Já o Northern blot verifica se um determinado gene de um genoma é ou não
transcrito em RNA e o quantifica. Há uma íntima relação de similaridade em
relação ao Southern blot, porém, no segundo, em vez de DNA, a substância
analisada por eletroforese com uma sonda hibridizadora é o RNA. Além
disso, no Northern blot é usado formaldeído no gel de agarose, que funciona
como um desnaturante. Apesar de essas técnicas poderem ser empregadas
no diagnóstico de doenças infecciosas, elas são mais utilizadas em estudos
genéticos para avaliação da expressão gênica (MOLINA; TOBO, 2004).
O Western blot (por vezes chamado imunoblot de proteínas) é um método
adicional que detecta proteínas em uma amostra. Essa amostra geralmente
provém de um homogenato, produto da trituração de um tecido biológico para
obtenção de células. Essa técnica também usa eletroforese em gel para separar
as proteínas pela sua estrutura tridimensional ou proteínas desnaturadas pelo
comprimento da sua cadeia polipeptídica, sendo posteriormente transferidas
para membranas de nitrocelulose ou difluoreto de polivinilideno (PVDF).
Uma vez na membrana, são usados anticorpos específicos para a proteína alvo
como sonda. A técnica de Western blot propiciou uma redução significativa
nas reações cruzadas que podiam ser encontradas em outras técnicas molecu-
lares de diagnóstico. Esse método pode ser usado como teste de diagnóstico
confirmatório de infecções virais pelo vírus T linfotrópico humano (HTLV),
ou bacterianas, como a doença de Lyme. A denominação dessa técnica é um
trocadilho do nome Southern blot, que detecta DNA, enquanto o Northern
blot detecta RNA (MOLINA; TOBO, 2004).
 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 9

Leia mais sobre doenças diagnosticadas por Western blot a seguir.

HTLV
A infecção pelo HTLV ocorre há milhares de anos. No entanto, o conhecimento sobre
a sua patogênese é recente. Esse vírus é endêmico em várias regiões do mundo. No
Brasil, encontra-se presente em todos os estados, com prevalências variadas, sendo
estimado cerca de 2,5 milhões de infectados. Fatores genéticos e imunológicos do
hospedeiro são os principais responsáveis pelas manifestações clínicas associadas,
que podem ser divididas em três categorias: neoplásicas, inflamatórias e infecciosas.
Destacam-se a mielopatia associada ao HTLV (HAM/TSP) e a leucemia/linfoma de
células T do adulto (ATLL) como as primeiras doenças associadas a esse retrovírus.

Doença de Lyme
A doença de Lyme é uma infecção transmitida por carrapatos, causada pela es-
piroqueta Borrelia burgdorferi. A Borrelia sp. junto com as leptospiras e o treponema
pertencem ao filo eubacterial das espiroquetas. A doença de Lyme é mais prevalente
nos verões do hemisfério norte e seus sintomas clínicos se assemelham muito à sífilis,
por causa de sua ocorrência em três estágios e ao seu desenvolvimento multissistêmico.
Fonte: Romanelli, Caramelli e Proietti (2010).

Por último, os microarranjos (do inglês microarray) de DNA utilizam

técnica mais similar ao processo de Northern blot, envolvendo o uso de pe-
quenos suportes sólidos nos quais milhares de sondas estão imobilizadas ou
ligadas de forma organizada em posições conhecidas. Essas sondas podem ser
produtos de PCR ou oligonucletídeos e os alvos podem ser produtos de PCR,
DNA genômico, RNA total, RNA amplificado, DNA complementar, DNA
plasmidial ou, simplesmente, amostras clínicas. A vantagem dos microarranjos
é que eles permitem a análise de uma grande quantidade de genes de forma
simultânea. Os microarranjos de DNA podem ser aplicados na identificação
de diversos microrganismos: vírus influenza e adenovírus, Entamoeba his-
tolytica, E. dispar, Giardia lamblia e Cryptosporidium parvum. Além disso,
essa tecnologia promete auxiliar de maneira significativa a detecção de genes
de resistência antimicrobiana e resistência mutacional (CAVALCANTI; LO-
RENA; GOMES, 2008).
10 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

Contribuições da biologia molecular no

diagnóstico de doenças
Os recentes avanços científicos e tecnológicos direcionados à identificação de
diversas doenças promoveram um excepcional desenvolvimento no diagnóstico.
Graças às técnicas de biologia molecular, esse progresso tem sido alcançado.
As metodologias moleculares têm a vantagem de serem altamente sensíveis,
específicas e confiáveis. Além disso, a concentração do agente não precisa ser
alta, ou seja, a partir de quantidades extremamente baixas de DNA ou RNA, é
possível quantificá-los, com a geração de resultados reprodutíveis. Ademais, é
permitida uma versatilidade das amostras (sangue periférico, liquor, medula
óssea, tecidos parafinados ou frescos).
Em relação às doenças infecciosas, uma das grandes vantagens das técnicas
moleculares de diagnóstico em comparação às demais utilizadas é a rapidez e a
precisão dos resultados, que hoje podem ser obtidos em poucas horas e até em
minutos. Comparado ao método tradicional de cultura de microrganismos, por
exemplo, os testes moleculares permitiram um diagnóstico mais consistente
em menor tempo, agilizando o plano de tratamento inicial e trazendo maiores
probabilidades de recuperação em tempo reduzido. Os testes moleculares
também são muito mais acurados do que a antiga metodologia da microscopia
óptica para detecção de parasitas, a qual pode ser muito subjetiva, uma vez
que depende da capacitação adequada do microscopista. Porém, entre tantas
vantagens, alguns dos problemas associados a esses testes diagnósticos estão a
possibilidade de contaminação da amostra, presença de inibidores de reações,
interferência na viabilidade da amostra (pela ação de RNAses, por exemplo), o
alto custo e a padronização. Somado a esses fatores, essas técnicas requerem
laboratórios especializados em biologia molecular com uma equipe técnica
especializada (LANDSVERK; WONG, 2013; MOLINA; TOBO, 2004).
A biologia molecular tem contribuído de forma substancial, nos últimos
anos, na área de diagnóstico de doenças infecciosas. Essa evolução tem sido
evidenciada nas análises de rotina laboratoriais, em que organismos difíceis de
serem cultivados, por exemplo, se tornaram passíveis de análise. Para visualizar
um exemplo prático vamos pensar em uma doença. A tuberculose, no Brasil,
é um grave problema de saúde pública, que acomete milhares de indivíduos
todos os anos, e coloca o país no ranking das maiores taxas dessa doença. A
dificuldade de acesso ao diagnóstico rápido da tuberculose é um dos mais
importantes obstáculos para controlar a doença. O diagnóstico e o tratamento
geralmente se baseiam na baciloscopia, que oferece baixo custo e reduzido
grau de infraestrutura, no entanto a acurácia do exame é baixa. Essa falta de
 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 11

sensibilidade no teste acaba por aumentar a mortalidade e a perpetuação da

doença, pelo atraso no diagnóstico relacionado ao tempo de cultivo necessário
para o crescimento do microrganismo em cultura.
A biologia molecular tem possibilitado a utilização de novas tecnologias,
como o Xpert MTB/RIF, teste molecular rápido realizado no sistema GeneXpert
MTB/RIF, para a detecção do Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch)
e também da resistência à rifampicina (PINTO et al., 2017).

O GeneXpert MTB/RIF é um equipamento composto por módulos com cartuchos

individuais de uso único em que se coloca uma alíquota de amostra para a detecção
de moléculas por PCR. O sistema pode fazer diagnóstico rápido de várias doenças
infecciosas ou oncológicas, mas, no Brasil, está sendo usado para a detecção da
tuberculose. O equipamento, que conta com computador e software próprios, fornece
o resultado em aproximadamente 105 minutos. Pode ser operado no mesmo espaço
físico onde é realizada a baciloscopia e não exige condições especiais de biossegurança.
Dados de acurácia do novo teste demonstraram uma sensibilidade de 89% (IC 95%:
85%; 92%) e especificidade de 99% (IC 95%: 98%; 99%) em substituição à baciloscopia
de primeira amostra para a detecção da tuberculose.
Fonte: Pinto et al. (2017).

Outro exemplo é o diagnóstico da doença de Chagas, que é um sério pro-

blema de saúde pública no País, e que utiliza métodos sorológicos de diag-
nóstico. Essas técnicas, que têm como base o uso de anticorpos específicos
contra o Trypanosoma cruzi, apresentam resultados de baixa confiabilidade
ou mesmo de falso positivos, por causa da reação cruzada com antígenos de
outros microrganismos. O progresso da biologia molecular vem proporcionando
o aperfeiçoamento no diagnóstico dessa doença, por meio da utilização da
q-PCR (MARQUES, 2016).
Com os avanços da biologia molecular, também já existem testes que podem
detectar o DNA do HPV em raspados ou em biópsias de lesões, além de definir
com precisão quais os subtipos virais presentes em determinada paciente. Mais
de 35 tipos de HPV infectam a região genital nos seres humanos e podem
causar desde verrugas genitais ou condilomas até lesões displásicas de baixo
e alto grau, das quais cerca de 20 estão associadas ao câncer de colo uterino.
Os tipos de HPV podem ser separados em vírus de baixo, intermediário ou
12 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

alto risco, de acordo com o tipo de lesão a que estão mais associados. Cada
tipo viral apresenta maior ou menor potencial oncogênico, e é encontrado
com maior frequência em lesões benignas (vírus de baixo risco) ou em lesões
neoplásicas (vírus de alto risco) (AYRES; SILVA, 2010). A genotipagem,
assim como a tipagem das hepatites virais, são realizadas por meio da PCR.
O PCR ainda constitui uma ferramenta alternativa crucial na resolução
de diagnósticos difíceis, como por exemplo, na detecção da Chlamydia tra-
chomatis. O cultivo dessa bactéria e seu diagnóstico sorológico não permite
diferenciar a infecção aguda da infecção prévia, já solucionada. A clamídia
está associada a casos de uretrites masculinas e femininas e cervicites nas
mulheres. Uma potencial complicação dessa bactéria é a doença inflamatória
pélvica, que pode levar à infertilidade.

Genotipagem do HPV
Os subtipos 16 e 18 do vírus HPV estão relacionados com mais de 70% dos casos de
câncer de colo do útero na mulher, sendo que as mulheres portadoras têm maior
risco de progressão da doença, comparadas com as infectadas por outros subtipos.
Sabe-se que cerca de 40 tipos de HPV, presentes no trato genital inferior, apresentam
baixo ou alto risco para o desenvolvimento de lesões neoplásicas nessa região. A
detecção de vários desses genótipos, associada à tipagem genética do HPV 16 e HPV
18 possibilitam uma melhor avaliação de risco e tratamento ao fornecer informações
importantes para a correta estratificação do paciente.
O teste de DNA para HPV é estabelecido na maioria dos países europeus para rastreio
do câncer de colo uterino e, atualmente, é recomendado para o acompanhamento de
lesões, após a terapia ou como adjuvante para aumentar a sensibilidade da citologia
para as mulheres com mais de 30 anos de idade.

Genotipagem do HCV
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 170 milhões de pessoas sejam
portadoras de hepatite C no mundo. O HCV apresenta grande heterogeneidade
genética e existem diversos subtipos: 1a, 2b, 3ª, 4, 5, etc. Os mais comuns são o 1, o
2 e o 3, sendo o subtipo 1 o mais frequente no Brasil. A identificação do genótipo
tem importância epidemiológica e pode predizer a resposta ao tratamento antiviral.
Portadores do genótipo 1, principalmente o 1b, apresentam doença mais grave e pior
resposta ao tratamento. Sendo assim, a genotipagem do HCV auxilia no prognóstico
e na conduta terapêutica do paciente com infecção crônica.
 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 13

Outra contribuição significativa da biologia molecular é que ela tem possi-

bilitado a maior compreensão do funcionamento normal de nossos genes e do
processo de desenvolvimento de doenças, quando os genes sofrem alterações. Por
meio de testes moleculares, é possível identificar a predisposição genética para
doenças como a trombofilia, síndrome do X frágil (que leva a retardo mental) e
a microdeleção do Y (associada à infertilidade) (MOLINA; TOBO, 2004). Outro
exemplo interessante é o das distrofias musculares progressivas, grupo de doenças
caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura
esquelética, e que tem sido alvo de intensos estudos. Aumentar o nosso conheci-
mento nessa área pode ser extremamente importante para tratamentos futuros e
têm se associado à nova vanguarda da farmacogenômica (ZATZ, 2002).
A farmacogenômica, também designada farmacogenética, é um ramo da
farmacologia que estuda o efeito de variações genéticas sobre a resposta, a
eficácia e o metabolismo de drogas. O diagnóstico molecular pode ajudar a
guiar uma terapia apropriada por meio da identificação de alvos terapêuticos
específicos de vários fármacos. A farmacogenômica tem se mostrado útil no
tratamento de doenças oncológicas, hematológicas, cardiológicas, neurológicas
e infecciosas. Provavelmente, exercerá um grande impacto sobre a prática
da medicina clínica, ao determinar qual medicamento é mais eficaz e assim
evitar efeitos colaterais graves.
No caso da tuberculose, por exemplo, o antibiótico isoniazida pode causar
sérios danos ao fígado e comprometer o tratamento em pacientes que têm
variante lenta do gene NAT2 e metabolizam o medicamento de forma mais
lenta. Portanto, o teste pode contribuir para melhorar a adesão ao tratamento
e diminuir o risco da tuberculose resistente. Outros alvos atuais do estudo
farmacogenético são pacientes em tratamento quimioterápico e pacientes com
HIV, em uso de terapia antirretroviral (WÜNSCH FILHO; GATTÁS, 2001).

Diversas doenças genéticas monogênicas também podem ser alvo de técnicas da

biologia molecular que, inicialmente, identificam o gene afetado para depois determinar
a mutação responsável pela doença. Seguem alguns genes já identificados e a doença
e as funções associadas:
„„ gene CFTR (produção de muco e suco gástrico) — fibrose cística;
„„ gene fibrilina (formação de membranas elásticas —: síndrome de Marfan;
„„ gene destrona (permeabilidade celular das membranas da células musculares) —
distrofia muscular de Duchenne.
14 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

A tendência é que, cada vez mais, exames convencionais sejam substituídos

pela ferramenta de diagnóstico molecular. Dadas as suas inúmeras vantagens
em relação à rapidez, sensibilidade e especificidade; essa evolução deve ocorrer
de maneira crescente em todos os ambientes clínicos. A biologia molecular
revolucionou a ciência e a prática da medicina; porém a sua implementação em
todos os contextos da rotina laboratorial, principalmente em relação a custo
e a recursos humanos ainda constitui um desafio. No entanto, os diversos
benefícios que essas técnicas proporcionam acabam por tornar o custo, ainda
elevado, um viés de menor importância frente aos resultados relacionados à
saúde humana.
Além disso, a demanda pela infraestrutura para instalação dessas técnicas
tem sido cada vez menos exigente nos dias de hoje. A determinação de susce-
tibilidade genética para alguns tipos de câncer ou doenças cardiovasculares
já tem se tornado realidade, além das doenças hereditárias. O aprimoramento
constante de técnicas moleculares em doenças infecciosas tem permitido a
redução da morbidade e da mortalidade e o melhor controle epidemiológico
dessas doenças, sejam elas parasitárias, fúngicas, virais ou bacterianas (PIG-
NATARI, [201-?]).

AYRES, A. R. G.; SILVA, G. A. e. Prevalência de infecção do colo do útero pelo HPV no

Brasil: revisão sistemática. Revista de Saúde Pública, v. 44, n. 5, p. 963-974, 2010. Dispo-
nível em: Disponível em: <https://www.scielosp.org/pdf/rsp/2010.v44n5/963-974/pt>.
Acesso em: 22 nov. 2018.
CAVALCANTI, M. de P.; LORENA, V. M. B.; GOMES, Y. M. Avanços biotecnológicos para o
diagnóstico das doenças infecciosas e parasitárias. Revista de Patologia Tropical, v. 37,
n. 1, p. 1-14, jan./abr. 2008. Disponível em: <https://www.revistas.ufg.br/iptsp/article/
viewFile%20/4026/3601>. Acesso em: 22 nov. 2018.
HORTA, A. L. A.; RAPOSO, S. A. Importância diagnóstica e prognóstica de detecção do HPV
16 e 18 nas lesões de colo uterino: a evolução das propostas e estratégias de rastreio do
câncer de colo uterino. 2018. Disponível em: <https://alvaroapoio.com.br/medicina-
diagnostica/importancia-diagnostica-e-prognostica-de-deteccao-do-hpv-16-e-18-
nas-lesoes-de>. Acesso em: 22 nov. 2018.
LANDSVERK, M. L.; WONG, L.-J. C. Clinical molecular diagnostic techniques. In: WONG,
L.-J. C. (Ed.). Next generation sequencing. New York: Springer, 2013. p. 19-36. Disponível
em: <https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4614-7001-4_2>. Acesso em:
22 nov. 2018.
 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 15

MARQUES, A. L. P. Uso da biologia molecular no diagnóstico da doença de Chagas: uma

abordagem teórico-experimental com foco em qPCR. 2016. Dissertação (Mestrado)-
Faculdade de Medicina, Universidade de Brasília, Brasília, DF, 2016. Disponível em:
<http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/21361/1/2016_AnaLuisaPereiraMarques.
pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
MCNICOL, A. M.; FRAQUHARSON, M. A. In situ hybridization and its diagnostic appli-
cations in pathology. Journal of Pathology, v. 182, n. 3, p. 250-261, 1997. Disponível em:
<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9349226>. Acesso em: 22 nov. 2018.
MELLO, F. C. Q.; FONSECA-COSTA, J. A utilidade da biologia molecular no diagnóstico
da tuberculose. Jornal Brasileiro de Pneumologia, editorial, v. 31, n. 3, p. 188-190, 2005.
MOLINA, A. L.; TOBO, P. R. Uso das técnicas de biologia molecular para diagnóstico. Eins-
tein, v. 2, n. 2, p. 139, 2004. Disponível em: <https://pt.scribd.com/document/346362641/
Texto-Uso-Das-Tecnicas-de-Biologia-Molecular-Para-Diagnostico>. Acesso em: 22
nov. 2018.
NEVES, S. M. N.; GUEDES, R. M. C. Hibridização in situ fluorescente: princípios básicos
e perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em medicina veterinária.
Arquivos do Instituto Biológico, v. 79, n. 4, p. 627-632, out./dez. 2012. Disponível em: <http://
www.scielo.br/pdf/aib/v79n4/a23v79n4.pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
PIGNATARI, A. C. Diagnóstico molecular em doenças infecciosas. [201-?]. Disponível
em: <https://www.h9j.com.br/centro-de-estudos/Documents/MaterialDidatico/
Diagn%C3%B3stico%20molecular%20em%20doen%C3%A7as%20infecciosas.pdf>.
Acesso em: 22 nov. 2018.
PINTO, M. F. T. et al. Impacto orçamentário da incorporação do GeneXpert MTB/RIF para
o diagnóstico da tuberculose pulmonar na perspectiva do Sistema Único de Saúde,
Brasil, 2013-2017. Cadernos de Saúde Pública, v. 33, n. 9, p. e00214515, 2017.
ROMANELLI, L. C. F.; CARAMELLI, P.; PROIETTI, A. B. F. C. O vírus linfotrópico de células T
humanos tipo 1 (HTLV-1): quando suspeitar da infecção? Revista da Associação Médica
Brasileira, v. 56, n. 3, p. 340-347, 2010. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/ramb/
v56n3/v56n3a21.pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
WÜNSCH FILHO, V.; GATTÁS, G. J. F. Biomarcadores moleculares em câncer: implicações
para a pesquisa epidemiológica e a saúde pública. Cadernos de Saúde Pública, v. 17, n. 3,
p. 467-480, maio/jun. 2001. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/csp/v17n3/4631.
pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
ZATZ, M. A biologia molecular contribuindo para a compreensão e a prevenção das
doenças hereditárias. Ciência e Saúde Coletiva, v. 7, n. 1, p. 85-99, 2002.

Leituras recomendadas
CAMARGO, C. F.; SILVA, P. R. Q. Aplicação das técnicas de PCR e suas técnicas derivadas
em diagnóstico molecular. [201-?]. Disponível em: <http://www.cpgls.pucgoias.edu.
16 Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

br/6mostra/artigos/SAUDE/CLEYTON%20FLORENCIO%20DE%20CAMARGO%20E%20
PAULO%20ROBERTO%20QUEIROZ.pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
HAAS, D. J.; TORRES, A. C. D. Aplicações das técnicas de PCR no diagnóstico de doenças
infecciosas. Revista Científica de Medicina Veterinária, ano 14, n. 26, p. 1-15, jan. 2016.
Disponível em: <http://faef.revista.inf.br/imagens_arquivos/arquivos_destaque/5D3
Iu05EHeEnqPl_2017-1-12-8-29-47.pdf>. Acesso em: 22 nov. 2018.
LEISTNER-SEGAL, S. et al. Aplicação da biologia molecular no diagnóstico de doenças
genéticas. Revista HCPA, n. 3, p. 329-342, 2001.
Conteúdo: