CITOESQUELETO DE

ACTINA E COMPLEXO DE
ARQUITETURA CELULAR
EM ARQUEAS DE ASGARD
Ana Glaucia , Rian Caldas Garcia , Weverthon Lemos de Almeida
 APRESENTANDO O ARTIGO
Arqueias de Asgard;
Fundamentos do artigo;
Analises do artigo(gráficos e dados coletados);
Proteínas relacionadas a actina e ligantes de actina;
Arquitetura celular das arqueias de Asgard;
Métodos e conclusão.
O QUE SÃO ARQUEIAS DE ASGARD
Arqueas de Asgard: As arqueas de Asgard são um
grupo de microrganismos que foram descobertos
recentemente e são considerados parentes próximos
dos eucariotos, incluindo seres humanos. O nome
"Asgard" vem da mitologia nórdica, referindo-se a uma
ponte entre os reinos dos deuses e dos humanos.
O QUE SÃO ARQUEIAS DE ASGARD
Relação com eucariotos: As arqueas de Asgard são
notáveis porque apresentam uma relação evolutiva
profunda com os eucariotos, sugerindo que podem
fornecer informações sobre a origem e a evolução
das células eucarióticas.
O QUE SÃO ARQUEIAS DE ASGARD
Características genômicas: Os genomas das arqueas
de Asgard contêm centenas de proteínas típicas de
eucariotos (ESPs), o que sugere uma convergência
evolutiva entre esses grupos. Essas ESPs estão
associadas a funções celulares complexas, como
formação do citoesqueleto e modelagem de membranas.
O QUE SÃO ARQUEIAS DE ASGARD
Citoesqueleto de actina: Estudos recentes indicaram a
presença de um citoesqueleto de actina em arqueas de
Asgard, o que antes se pensava ser uma característica
exclusiva das células eucarióticas. A presença do
citoesqueleto de actina sugere uma complexidade
estrutural e funcional semelhante às células eucarióticas.
O QUE SÃO ARQUEIAS DE ASGARD
Estudos em andamento: A pesquisa sobre as arqueas de
Asgard está em andamento, e os cientistas continuam
investigando suas características, fisiologia e papel na
história evolutiva. Estudos adicionais são necessários para
entender melhor a importância desses microrganismos e
como eles contribuíram para a evolução dos eucariotos.
 FUNDAMENTOS DO ARTIGO

Cultura enriquecida de Candidatus Lokiarchaeum ossiferum: O artigo

descreve uma cultura altamente enriquecida dessa arquea de Asgard,
que cresce em ambiente anaeróbico a 20ºC, utilizando fontes de carbono
orgânico. A cultura atinge uma densidade celular maior que 5 × 10⁷
células por ml e apresenta um genoma significativamente maior do que
outras linhagens de Asgard.
 FUNDAMENTOS DO ARTIGO

Presença de um citoesqueleto de actina: A cultura de Candidatus

Lokiarchaeum ossiferum apresenta um citoesqueleto de longo alcance
composto de filamentos de actina-F. A estrutura em fita dupla torcida dos
filamentos é composta de actina-F. Esses filamentos são marcados por
Lokiactin, uma proteína específica encontrada no grupo das arqueas de
Asgard.
 FUNDAMENTOS DO ARTIGO

Arquitetura celular complexa: As células de Ca. L. ossiferum observadas

apresentam formato cocóide e uma rede de saliências ramificadas com
constrições frequentes. O envelope celular consiste em uma membrana
de uma camada, e complexas estruturas estão presentes em sua
superfície.
 FUNDAMENTOS DO ARTIGO

Espaços periplasmáticos (ESPs): Cerca de 5% das proteínas codificadas

pelos genes das arqueas de Asgard são ESPs. Essas proteínas estão
associadas a funções de células de alta complexidade, como formação
do citoesqueleto e transporte e modelagem de membranas.
 FUNDAMENTOS DO ARTIGO

Relação evolutiva entre arqueas de Asgard e eucariotos: Estudos

moleculares e filogenéticos sugerem uma relação evolutiva profunda
entre arqueas de Asgard e eucariotos. As arqueas de Asgard carregam
um extenso repertório de ESPs, muitos dos quais também estão
presentes nos eucariotos. Isso indica a possibilidade de uma relação
direta entre células eucarióticas e arqueas de Asgard na evolução celular.
CULTURA DE LOCKIARQUEA A
PARTIR DO SEDIMENTO
Tópico 1: Identificação de amostras adequadas para
enriquecimento
Organismos Lokiarqueanos e outras arqueas de Asgard são
encontrados em ambientes anóxicos, especialmente marinhos.
Sedimentos de água rasa de um canal estuarino próximo à
costa da Eslovênia foram identificados como tendo a maior
abundância relativa de arqueas.
A busca pelo gene 16S rRNA de arqueas asgardianas foi
realizada em amostras de sedimentos para selecionar amostras
apropriadas para enriquecimento.
CULTURA DE LOCKIARQUEA A
PARTIR DO SEDIMENTO
Tópico 2: Enriquecimento de culturas
Utilização das amostras identificadas como inóculo para
enriquecimento de culturas.
Monitoramento periódico e crescimento observado após
140 dias a 20°C.
Crescimento não detectado após 2 transferências nas
mesmas condições.
CULTURA DE LOCKIARQUEA A
PARTIR DO SEDIMENTO
Tópico 3: Condições de crescimento
Redução da entrada de fontes de carbono orgânico para um
único compartimento e aumento das concentrações de
antibióticos.
Aumento da abundância das Lokiarqueas para taxas entre 25%
e 80% após várias transferências.
Maior enriquecimento alcançado reduzindo a disponibilidade
de caseína hidrolisada e utilizando outras moléculas.
CULTURA DE LOCKIARQUEA A
PARTIR DO SEDIMENTO
Tópico 4: Análise de sequenciamento de amplicons
Cultura com maior enriquecimento (Loki B-35) consistia em 3
espécies dominantes e 2 menores.
Presença de Lokiarquea, bactéria redutora de sulfato, bactéria
hidrogenotrófica e metanogênica.
Presença de 'Ca. P. syntrophicum, proveniente de um ambiente
de mar profundo.
CULTURA DE LOCKIARQUEA A
PARTIR DO SEDIMENTO
Tópico 5: Crescimento celular
Loki B-35 apresentou crescimento sem a fase LAG e densidade
celular de 2,5x10^7 células/ml.
Tempo de geração estimado entre 7 e 14 dias.
Comparação com Lokiarquea de mar profundo, que possui
densidade celular menor e tempo de geração mais longo.
No estudo de enriquecimento de
cultura Loki B-35, o método de
cultivo consistiu em usar uma
fração principal de sedimento como
inóculo em um ambiente estéril e
filtrado com água e compostos
orgânicos. Foram realizadas
transferências para outros frascos
com substâncias como caseína e
antibióticos para promover maior
crescimento. A composição da
cultura com maiores taxas de
enriquecimento foi avaliada por
sequenciamento do gene 16S
rRNA. Curvas de crescimento
mostraram que a cultura Loki-B35
atingiu uma densidade celular
máxima de 2,5 x 10⁷ células por ml,
com um tempo de geração entre 7 a
14 dias, conforme quantificado por
PCR.
 ANÁLISES GENÔMICAS E
FILOGENIA DO GENOMA LOKI-B35
Tópico 1: Características do genoma Loki-B35
O genoma do Loki-B35 foi montado em um contig único com 6.035.313
pares de bases (pb) e codifica 5.119 proteínas preditas.
Contém três cópias de rRNA ribossômico 16S e 23S, indicando
variabilidade potencialmente relacionada ao tempo de geração ou
adaptação a condições ambientais variáveis.
Em comparação com 'Ca. P. syntrophicum', o genoma de Loki-B35 é
significativamente maior, com 2.256 proteínas únicas.
 ANÁLISES GENÔMICAS E
FILOGENIA DO GENOMA LOKI-B35
Tópico 2: Funções e características do genoma Loki-B35
A anotação funcional revela que os genes de Loki-B35 estão enriquecidos
em várias categorias, refletindo seu tamanho maior.
O genoma de Loki-B35 é particularmente enriquecido com genes
associados ao tráfico de membranas e transporte de proteínas.
A fração de proteínas representando ESPs (proteínas secretadas
específicas) é semelhante a 'Ca. P. syntrophicum'.
 ANÁLISES GENÔMICAS E
FILOGENIA DO GENOMA LOKI-B35
Tópico 3: Relação filogenética e classificação do Loki-B35
Na filogenia universal, as arqueas Asgard formam um grupo monofilético
com os eucariotos como sua linhagem irmã direta.
A filogenia de Asgard separa claramente todas as classes do filo, e Loki-B35
pertence a uma das duas sublinhagens principais dentro da classe
Lokiarchaeia.
Com base nessas análises, é proposto um novo gênero e espécie para Loki-
B35: 'Ca. L. ossiferum' cepa Loki-B35.
O genoma fechado do enriquecimento Loki-B35 foi
utilizado como base para essa análise. Em
comparação com 'Ca. P. syntrophicum', observa-se
uma diferença substancial no tamanho do genoma
de 'Ca. L. ossiferum'. Através da identificação de
genes marcadores pelo CheckM53, foram
estimadas medidas de contaminação e completude
do genoma. O número de agrupamentos
compartilhados de proteínas ortólogas entre 'Ca. L.
ossiferum' e 'Ca. P. syntrophicum' é mostrado em
um diagrama, bem como os agrupamentos
específicos do genoma. Uma comparação da
ocorrência de ESPs (Elementos de Sinais Curtos)
entre as duas espécies revela que 'Ca. L. ossiferum'
apresenta enriquecimento de ESPs associadas a
maquinários de tráfego específicos. A colocação
filogenética é representada por árvores de máxima
verossimilhança (ML) baseadas na concatenação
de 23 proteínas ribossomais universalmente
conservadas. A árvore da vida mostra que Eukarya é
um clado irmão de Asgardarchaeota. Tanto 'Ca. L.
ossiferum' quanto 'Ca. P. syntrophicum' pertencem
à mesma classe Lokiarchaeia, de acordo com a
classificação proposta recentemente. O suporte dos
ramos foi calculado com 1.000 amostras de
bootstrap ultra-rápidas, e os valores entre colchetes
indicam os tamanhos dos genomas completos e
MAGs (Metagenome-Assembled Genomes) dentro
de Lokiarchaeia.
 IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS
DE 'CA. L. OSSIFERUM'
Tópico 1: Identificação das células de 'Ca. L. ossiferum'
A hibridização in situ por fluorescência (FISH) com sondas
específicas revelou que as células de 'Ca. L. ossiferum'
aparecem como esferas de tamanho celular variável.
A contagem celular por FISH confirmou a abundância relativa
de até quase 80% em enriquecimentos mais altos.
As células de 'Ca. L. ossiferum' são consideravelmente menores
do que outros organismos no enriquecimento.
 IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS
DE 'CA. L. OSSIFERUM'
Tópico 2: Microscopia eletrônica e tomografia crioeletrônica
As células de 'Ca. L. ossiferum' foram analisadas usando tomografia
crioeletrônica (cryo-ET) para obter imagens em um estado quase
nativo.
Foram identificados três tipos gerais de células com morfologias e
arquiteturas de envoltório celular distintas: corpos celulares com
protrusões elaboradas, células em forma de bastão e células esféricas.
As células de 'Ca. L. ossiferum' possuíam uma única membrana com
envoltórias celulares apresentando densidades complexas e
desordenadas.
 IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS
DE 'CA. L. OSSIFERUM'
Tópico 3: Relações com outras espécies co-cultivadas
'Ca. L. ossiferum' pode ser encontrado tanto como indivíduos isolados
quanto em agregados com espécies co-cultivadas.
Embora a troca de nutrientes com as espécies co-cultivadas possa ser
necessária para o crescimento de 'Ca. L. ossiferum', o contato celular
persistente não parece ser obrigatório ao longo do seu ciclo de vida.
a) Imagem da cultura de enriquecimento corada com DAPI e as sondas de
nucleotídeos, mostrando as células de Lokiarchaea (amostra à esquerda
concentrada 70 vezes), bactérias e Methanomicrobiales. As barras de escala
representam 2 µm.
b) Micrografias crioeletrônicas em 2D de baixa ampliação dos três principais
tipos de células observados após a triagem da cultura de enriquecimento.
As imagens mostram uma célula putativa de 'Ca. L. ossiferum' com um corpo
celular redondo e protrusões celulares complexas (esquerda), uma célula
bacteriana Gram-negativa (meio) e uma célula arqueana (direita). As barras
de escala representam 1 µm.
c) Cortes através de tomogramas crioeletrônicos dos três organismos
mostrados na imagem b, detalhando a arquitetura característica do
envelope celular das três espécies. Os putativos Lokiarchaea apresentam
densidades superficiais pequenas e desordenadas (sda) e proteínas de
superfície complexas (sdb) que se projetam de uma única membrana. Os
componentes identificados incluem a membrana citoplasmática (cm), o
citoplasma (cp), a membrana externa (om), o periplasma (pp) e a camada
superficial (sl). As barras de escala representam 100 nm.
d) Identificação de 'Ca. L. ossiferum' por meio de estruturas de rRNA
específicas de Asgard. A figura mostra uma média de sub-tomogramas de
ribossomos de células putativas de Lokiarchaea, a previsão da estrutura
secundária do rRNA da subunidade grande de 'Ca. L. ossiferum' e uma
sobreposição da média com um mapa de baixa resolução do ribossomo 70S
de T. kodakarensis. A estrutura de 'Ca. L. ossiferum' apresenta
características proeminentes de rRNA identificadas como os segmentos de
expansão específicos de Asgard rRNA ES9 e ES39. Consulte também a
Figura Estendida 6.
 ARQUITETURA CELULAR COMPLEXA
E VARIÁVEL
A análise da arquitetura celular de 'Ca. L. ossiferum' foi realizada por microscopia eletrônica
de varredura e criomicroscopia eletrônica tomográfica.
As células são cocoides, com vesículas aderidas à superfície e protrusões irregulares,
ramificadas e bulbosas.
A criomicroscopia eletrônica revelou uma rede complexa de filamentos finos e curvados
nas protrusões, conectando diferentes partes da célula.
Os ribossomos estão distribuídos uniformemente no corpo celular, pontes celulares e
protrusões.
 ARQUITETURA CELULAR COMPLEXA
E VARIÁVEL
O envelope celular apresenta uma camada de densidades desordenadas e estruturas
projetadas, que conectam partes da rede de protrusões e se localizam em regiões curvas
da membrana.
Possíveis agrupamentos de quimiorreceptores foram observados no lado citoplasmático
da membrana, sugerindo a capacidade de comunicação e motilidade entre células.
O envelope celular é contínuo entre o corpo celular e as protrusões, com junções estáveis,
constrições finas e conexões leves.
Filamentos citoesqueléticos atravessam as junções e conectam diferentes partes da rede
de protrusões, funcionando como estrutura de suporte para a arquitetura celular.
ARQUITETURA CELULAR COMPLEXA E VARIÁVEL
São apresentadas imagens das células de 'Ca. L.
ossiferum', mostrando células coccoides
pequenas com extensas protrusões. As células
são analisadas em diferentes cortes e
segmentações 3D auxiliadas por redes neurais.
Os corpos celulares e as redes de protrusões são
observados contendo ribossomos, filamentos
citoesqueléticos e densidades complexas na
superfície.
São destacadas também junções e constrições
na arquitetura celular, algumas das quais são
estáveis e outras são finas ou levemente
conectadas. Os filamentos citoesqueléticos são
observados atravessando as junções e
conectando diferentes partes da rede de
protrusões, sugerindo que o citoesqueleto atua
como uma estrutura de suporte para manter a
arquitetura elaborada das células de 'Ca. L.
ossiferum'.
Além disso, é mencionado que outras espécies
de Lokiarchaeia e Heimdallarchaeia também
apresentam características semelhantes em seu
envoltório celular, indicando a presença de um
conjunto de genes e proteínas que podem
mediar a comunicação entre células, interações e
mobilidade.
 CITOESQUELETO BASEADO EM
LOKIACTINA.
O filamento de citoesqueleto mais frequentemente observado em 'Ca. L. ossiferum' possui
uma estrutura de filamento de duas hélices semelhante à F-actina eucariótica e à
Crenactina arqueal.
O genoma de 'Ca. L. ossiferum' contém homólogos da actina eucariótica, sendo um deles a
Lokiactin, que representa o grupo mais conservado de homólogos de actina em Asgard.
A expressão da Lokiactin foi detectada em níveis mais altos do que outros homólogos de
actina.
Experimentos com anticorpos específicos confirmaram a presença da Lokiactin em 'Ca. L.
ossiferum' por western blotting e marcação com ouro imunológico.
O citoesqueleto em 'Ca. L. ossiferum' é complexo e baseado na Lokiactin, sendo
provavelmente regulado dinamicamente por proteínas ligantes de actina, como gelesolina
e profilina.
CITOESQUELETO BASEADO EM
LOKIACTINA. O citoesqueleto é uma estrutura
celular responsável pelo suporte
estrutural, movimento e transporte
intracelular. O estudo utiliza técnicas
de microscopia e análise molecular
para investigar a estrutura e a
expressão da Lokiactin em uma
espécie de arqueia chamada 'Ca. L.
ossiferum'. O texto menciona a análise
de imagens de criotomogramas,
reconstrução helicoidal de filamentos,
análise estrutural, análise de
expressão gênica por RT-qPCR e
western blot, além de coloração
imunofluorescente das células. Os
resultados indicam que a Lokiactin
está envolvida na formação de
estruturas de citoesqueleto na arqueia
estudada.
MÉTODOS
Coleta de amostras e cultivo enriquecido
Extração de DNA e monitoramento do
crescimento usando qPCR
Extração de RNA, síntese de cDNA e ARP RT-
qPCR
Sequenciamento de amplicons do gene 16S
rRNA
Reação em cadeia de hibridização de DNA in
situ
Sequenciamento Illumina
Sequenciamento Nanopore e chamada de
bases
Árvore filogenética
Análise do genoma e criação de ortogrupos
entre 'Ca. L. ossiferum' e 'Ca. P. syntrophicum'
Filogenia de proteínas da família Actina
SEM, TEM convencional e localização de
imunogold
Geração de anticorpos específicos de
Lokiactina e western blotting
Imagem de imunofluorescência
Preparação de amostra Cryo-ET
Coleta de dados Cryo-ET
Reconstrução de tomogramas, processamento
de dados e segmentação
Média de subtomograma do ribossomo
Identificação de ‘Ca. L. ossiferum' por
segmentos de expansão de rRNA
Reconstrução in situ de filamentos do
citoesqueleto
COLETA DE AMOSTRAS E CULTIVO
ENRIQUECIDO
Coleta de amostras de sedimento: Amostras foram coletadas de um canal raso salobro próximo à
costa da Eslovênia.
Cultivo enriquecido: Um núcleo de sedimento foi cortado em intervalos de 3 cm e armazenado. A
camada de sedimento com maior quantidade de Lokiarchaea foi selecionada para o cultivo.
Condições de cultivo: Diferentes condições de meio foram testadas, e o crescimento foi
monitorado por ensaios de qPCR.
Resultados do cultivo: Após 140 dias, foi observado crescimento em culturas suplementadas
com água salobra filtrada, hidrolisado de caseína, aminoácidos e leite em pó. Foram realizadas
transferências para meios modificados e obtido um alto enriquecimento.
Composição do meio de crescimento: O meio de crescimento continha vários componentes,
incluindo sais, hidrolisado de caseína e suplementos de elementos traço.
Condições de incubação: As culturas foram incubadas a 20°C, sem agitação, sob atmosfera
controlada.
ÁRVORE FILOGENÉTICA
Coleta de genomas de arqueias Asgard de boa qualidade e marcadores de proteínas
ribossomais.
Construção de duas árvores filogenéticas: uma abrangendo bactérias, eucariotos, arqueias não-
Asgrad e um subconjunto de genomas Asgard, e outra focada em Thermoproteota e todos os
genomas Asgardarchaeota.
Alinhamento e ajuste dos marcadores ribossomais.
Reconstrução filogenética utilizando o IQ-TREE 2 com um modelo específico e 1.000 réplicas de
bootstrap ultrarrápido.
 CONCLUSÃO

Descoberta do citoesqueleto baseado em actina em arqueas

Asgard: O estudo visualizou pela primeira vez um elaborado
citoesqueleto baseado em actina em arqueas Asgard,
confirmando uma hipótese antiga. O Lokiactin, conservado em
todos os genomas de Asgardarchaeota, indica que o
citoesqueleto é uma característica comum dessas arqueas.
 CONCLUSÃO

Implicações da arquitetura celular para a fisiologia e ecologia

das arqueas Asgard: A presença de extensas protrusões
membranosas torna as células frágeis, o que pode explicar por
que elas são mais abundantes em sedimentos do que no
plâncton. A arquitetura celular também pode permitir interações
complexas entre células eucariogênicas e relacionamentos
sintróficos.
 CONCLUSÃO

Utilização da cultura de enriquecimento como modelo para

estudar as arqueas Asgard: A cultura de 'Ca. L. ossiferum'
permite o estudo experimental da biologia celular peculiar das
arqueas Asgard, devido à sua capacidade de crescer em
densidades celulares e purezas que facilitam a acessibilidade
experimental. A arquitetura celular intrincada sugere mecanismos
elaborados para processos celulares importantes, que podem ser
explorados usando essa cultura de enriquecimento.