Método Radiométrico

BACTEC 460

Meio de Cultura 7H12:

utiliza 14C incorporado
ao ácido palmítico.
 Método com sensor de oxigênio

MGIT – Mycobacteria
Growth Indicator Tube:
Meio de Cultura 7H9 –
utiliza rutênio como
sensor do consumo de
oxigênio.
 TESTE DE SENSIBILIDADE
SISTEMA AUTOMATIZADO

BACTEC/MGIT 960 (BD)

MB/BacT (Biomerieux)

VersaTREK Myco (Trek Diagnostic System)

 Novas Metodologias

E-test

Pirazinamidase
 Novas Metodologias

Nitrato redutase

Sensível

Direta – partir de amostra clínica

Indireta – partir de isolado micobacteriano

Resistente à SM
 Novas Metodologias

MABA – Microplate Alamar Blue Assay

 MÉTODOS MOLECULARES
Detecção dos genes de resistência:

v Isoniazida: katG, inhA, kasA e região

intergênica oxyR-ahpC
v  Rifampicina: rpbO
v  Pirazinamida: pncA
v  Etambutol: embB
v  Estreptomicina: 16S rRNA ou rpsL
 MÉTODOS MOLECULARES
Técnicas utilizadas:

v  PCR-SSCP: PCR-Single Strand

Conformational Polymorphism

v  Sequenciamento.

v  DNA microarray.

 Mecanismos de Resistência
Como se detectam essas mutações:

sequenciamento do DNA da micobactéria

FEPPS. IPB/LACEN-RS. LABORATÓRIO DE MICOBACTÉRIAS

 MÉTODOS MOLECULARES

GeneXpert MTB/RIF (Cepheid)

Nested PCR Real Time: identifica o complexo MTBC

e os genes mais comuns da resistência à rifampicina
em 2 horas.
 Passo a passo do X-pert

Amostra de escarro + reagente

Transferir 2mL para o cartucho
Incubação: 15 minutos

Identificação do cartucho Incubação do cartucho: 1 h e 45 min

 ACURÁCIA DO X-PERT PARA DETECÇÃO DE TB
PULMONAR E RESISTÊNCIA À RIFAMPCINA

§  18 estudos analisados: 10.224 espécimes clínicos

§  Sensibilidade média: 90,4% (89 - 91%)

§  Especificidade média: 98,4% (98 – 99%)

§  Sensibilidade média RIF: 94,1% (92 – 96%)

§  Especificidade média RIF: 97% (96 – 98%)

Chang, K. et al. Rapid and effective diagnosis of tuberculosis and rifampicin

resistance with Xpert MTB/RIF assay: a meta-analysis.J. Infect, 2012
 X-pert - TB/HIV e crianças

—  Em áreas de alta prevalência de HIV, o uso de Xpert

MTB/RIF confirmou o diagnóstico de TB em 36 –
75% dos pacientes com TB que apresentaram
Baciloscopia Negativa.

—  X p e r t M T B / R I F m o s t r o u s e n s i b i l i d a d e e
especificidade para o rápido diagnóstico de TB em
crianças, incluindo crianças infectadas com HIV,
principalmente em áreas de alta prevalência de HIV
e TB.

WHO: http://www.who.int/hiv/topics/tb/note_xpert_mtb_rif/en/ -
Information note
 X-pert em amostras extrapulmonares

Usando a cultura como referência:

—  LCR: Sensibilidade 79,55% (62 – 90,2%) Especificidade

98,6% (95,8 – 99,6%) – 16 estudos – 709 amostras

—  Líquido pleural: Sensibilidade 43,7% (24,8 – 64,5%) – 7

estudos – 698 amostras

http://www.stoptb.org/wg/gli/assets/documents/Xpert%20Meeting
%20Report%2024102013%20%20Pre%20publication%20FINAL.pdf
X-PERT - DIANGÓSTICO DA TB

Fonte: Global Tuberculosis Report 2013 WHO

 X-pert NO BRASIL

—  O anúncio de que o Brasil passaria a utilizar o teste rápido X-

pert foi feito pelo Ministério da Saúde em março de 2013,
sendo que o investimento na compra dos kits seria de R$ 12.6
milhões .

—  O teste será disponibilizado para os municípios com mais de

200 casos novos em 2012 e para municípios estratégicos
segundo critérios epidemiológicos: municípios com grande
população prisional, população indígena e alguns municípios
de fronteira.

—  Em janeiro de 2014 foram iniciados os treinamentos nos

Laboratórios, e a partir de abril de 2014, 5 Estados e o
Distrito Federal começam a receber os equipamentos.

Portal Brasil: http://www.brasil.gov.br/saude/2013/03/teste-

rapido-para-diagnosticar-tuberculose-sera-oferecido-no-sus
Municípios Identificados para Impantação do Xpert MTBRif – Brasil 2012

Fonte: SVS/MS/Brasil
 MÉTODOS MOLECULARES
Genotype MTBDR plus 2.0 (Hain Lifescience

Pode ser utilizado a partir de espécimes clínicos com

resultado de baciloscopia positiva ou negativa e a
partir de culturas sólidas ou líquidas
 MÉTODOS MOLECULARES

GenoType MTBDRplus (HAIN)

DNA micobacteriano extraído do espécime clínico,

amplificado pela PCR e detectado pela fita usando
hibridização reversa e reação enzimática colorida.
Identificação do complexo M. tuberculosis e a resistência
À INH e/ou RIF por GenoType MTBDRplus (HAIN)
COMPARAÇÃO DE GENOTYPE MTBDRplus COM TSA
E SEQUENCIAMENTO

§  122 espécimes clínicos: 68 isolados MTB

§  Sensibilidade INH: 60%

§  Especificidade INH:100%

§  Sensibilidade RIF: 82%

§  Especificidade RIF: 94%

Maschmann, R.A. et al..Performance of the GenoType® MTBDRplus assay

directly on sputum specimens from Brazilian patients with tuberculosis
treatment failure or relapse. J. Cl. Microbiol., 2013
COMPARAÇÃO DE GENOTYPE MTBDRplus COM TSA
E SEQUENCIAMENTO

Estudo Sensibilidade Sensibilidade RIF

INH
JIN et al, 2012 75% 93,5%

LACOMA et al, 2008 79% 98,3%

LING et al, 2008 84,3% 98,1%

Fig. 1. Color changes that occur in TK Media by growth of mycobacteria and
other (contaminant) organisms. Colonies on the solid part and cords of
mycobacteria (in strains producing a cord factor) in the liquid part of the
medium can be observed.
Fig. 2. Smear prepared from the liquid part of TK SLC and stained
by Kinyoun. Long cords of AFB are observed indicating that the
strain produces a cord factor.
Fig. 3. Mycolor TK and the diagrams obtained in the instrument. A)
Typical growth curve of a M. tuberculosis strain. B) The bar graph of the
antibiotic susceptibility test of a M. tuberculosis strain resistant to INH
and streptomycin.
Fig. 4. Distribution of the number of isolates according to the duration
of time-to-growth detection. Most of the isolates grew between 10 and
15 days in TK SLC with a mode of 12 days and between 21 and 29 days
in LJ with a mode of 25 days.
Fig. 5. Examples of susceptibility testing and typing results. Yellow indicates
growth and red inhibition. A) M. tuberculosis susceptible to all drugs; B) M.
tuberculosis resistant to all drugs; C) M. tuberculosis susceptible to rifampin,
resistant to INH, streptomycin, and ethambutol; D) MOTT susceptible to
streptomycin, resistant to INH, rifampin, and ethambutol (growth in PNB indicates
that it is a MOTT species).
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

v  BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde.

Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de
Vigilância Laboratorial da Tuberculose e Outras Micobactérias.
Brasília. 2008. 436p.

v  CONDE, M.C. et al. III Diretrizes para Tuberculose da Sociedade

Brasileira de Pneumologia e Tisiologia. J. Bras. Pneumol. 2009;
35(10): 1018-1048.

v  BRASIL. Agência Nacional de Vigilância em Saúde. Secretaria de

Vigilância em Saúde. Infecções por micobactéiras de crescimento
rápido: fluxo de notificações, diagnóstico clínico, microbiológico e
tratamento. Nota técnica conjunta nº 01/2009.
 OBRIGADA !!!!!!!!

Daisy Nakamura Sato

E-mail: daisysato@gmail.com