1.

Tuberculose como problema de Saúde Pública

1.2 Agente Etiológico

A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa que afeta

majoritariamente os pulmões. É causada principalmente pelo Mycobacterium
tuberculosis, podendo ocorrer também infecção por outras micobactérias do
Complexo M. tuberculosis (CMt) (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2014).
O agente causador da doença, M. tuberculosis, é um patógeno
intracelular obrigatório e se apresenta em forma de bacilos levemente
curvados, aeróbios, imóveis e que não formam esporos. São caracterizados
por serem bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), devido à alta presença tanto
de lipídeos como de ácidos micólicos na parede celular (DUCATI et al., 2015).
A camada lipídica confere às micobactérias outras características além
da resistência à descoloração por álcool-ácido, tais como o caráter hidrofóbico,
a resistência à antibióticos e diversos outros agentes químicos (ROSEMBERG
e TARANTINO, 2002; BARRERA, 2007), além de resistência à diversas
propriedades imunológicas (SANTOS, 2010)
A transmissão da doença se dá através do ar quando o indivíduo com a
forma pulmonar ou laríngea da doença espirra, tosse ou fala, ocorrendo a
liberação de bacilos no ambiente que podem infectar outrem. A inalação de
pequenas partículas aerossóis de 1 a 5 μm, que podem conter de 2 a 3 bacilos
vivos, é suficiente para iniciar o processo de contaminação. A infecção
propriamente dita varia conforme o grau de contato com o doente, a quantidade
inalada de bacilos e da resposta imune do indivíduo contaminado (AHMAD,
2011).

1.3 Epidemiologia

Embora a tuberculose seja uma doença amplamente estuda e passível

de medidas sérias de controle e monitoramento de programas de Vigilância em
Saúde no âmbito mundial, ainda hoje é uma das condições infecciosas que
mais causa mortes ao redor do globo (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2014). Apesar da incidência da doença estar em decréscimo, de acordo com o
último relatório da OMS, em 2017 aproximadamente 1,6 milhões de pessoas
morreram em decorrência da TB (WHO, 2018). Estima-se também que no
mesmo ano, 10 milhões de indivíduos desenvolveram a doença (WHO, 2018).
Uma vez que a TB é estritamente associada a condições econômicas e
sociais, para os 30 países com a maior carga da doença, os quais representam
87% dos casos

1.4 Tuberculose resistente aos fármacos

2. Resistência às fluoroquinolonas:

2.2 Características

2.3 Determinantes moleculares de resistência às fluoroquinolonas

2.4 Resistência fenotípica

3. Ferramentas para diagnóstico de resistência: tomada de decisão

3.2 Panorama nos Serviços de Saúde

- como funciona, quais os disponíveis, acesso e importância

3.3 Biologia molecular aplicada ao diagnóstico de resistência

3.4 Teste de sensibilidade aos fármacos

Dentre as doenças infecciosas, a tuberculose (TB) é uma das que tem

causado o maior número de mortes no mundo. Dados da Organização Mundial
da Saúde (OMS) estimam que aproximadamente dois bilhões de pessoas
estejam infectadas pelo microrganismo causador da TB (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2014).
A OMS, a fim de estabelecer estratégias para o enfrentamento da TB
como problema de saúde pública, prevê o estabelecimento de três pilares:
prevenção e cuidado integrado e centrado no paciente; políticas arrojadas e
sistemas de apoio; e intensificação da pesquisa e inovação (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2015b). Dentre as medidas preconizadas pela Organização
Mundial da Saúde para erradicação da tuberculose, estão a realização de
estudos para desenvolvimento de novos testes diagnósticos e métodos de
tratamentos mais eficazes. Uma das principais vias de obtenção de tais metas
é a partir de pesquisas capazes de estimar e caracterizar os casos de
resistência aos fármacos para assim, obter uma abordagem mais assertiva no
tratamento dos doentes (WHO mais recente).
Um dos principais desafios para o controle da TB é a elevação dos
casos resistência aos fármacos utilizados no tratamento da doença. A OMS
estima que 3,5% dos casos novos e 20,5% dos retratamentos apresentam TB
multirresistente, quadro em que o isolado micobacteriano apresenta resistência
a pelo menos isoniazida (INH) e rifampicina (RMP). Esse é um perfil que causa
muita dificuldade no controle da doença, uma vez que esses dois fármacos são
as principais drogas de escolha para tratamento da TB.
Entretanto, mais agravante que o cenário supracitado, é aquele onde o
paciente tem um quadro de Tuberculose Extensivamente Resistente (TB-XDR).
Nessa apresentação da doença, além de resistência a INH e RMP, também
não há resposta ao tratamento com fluoroquinolonas e aos injetáveis de
segunda linha como amicacina e canamicina (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2017).
No Brasil e em outros países com alta carga da doença, o cenário da
multirresistência já é bem conhecido e avaliado (----). Por outro lado, há
carência de dados que retratem a real situação epidemiológica da TB-XDR.
Gallo et al. (2018), apontaram que entre os pacientes com confirmação de TB-
MDR no Estado de São Paulo, 10,2% deles apresentam quadros de TB-XDR
ou TB pré-XDR.
A investigação bacteriológica de cepas de M. tuberculosis resistentes
aos fármacos não é uma tarefa de fácil execução no cenário de saúde pública
brasileiro. A cultura para micobactérias é considerada o teste de referência
para diagnóstico da TB (WORLD HEALTH ORGANIZATION, s/d) e permite a
realização do Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (TSA) e a
caracterização fenotípica das cepas multirresistentes (BRASIL, 2008, 2011).
Embora essa metodologia apresente baixo custo, os resultados podem
demorar até dois meses para serem liberados (BRASIL, 2011).
 Diante desse cenário e dos desafios inerentes ao controle da doença em
países em desenvolvimento, é urgente o desenvolvimento de métodos que
possam garantir o diagnóstico da tuberculose resistente de forma rápida e
pouco custosa. Nesse sentido, a Biologia Molecular

3 OBJETIVOS

Estimar a prevalência de QRDR associados à concentração inibitória

mínima.

4 METODOLOGIA DE PESQUISA

Estudo de revisão sistemática de literatura, observacional, retrospectivo;

4.1 População de estudo

Foram elegíveis os pacientes notificados com TB-MDR, conforme

definição da Organização Mundial da Saúde, resistência à rifampicina e
isoniazida.
A resistência do M. tuberculosis foi confirmada pelo Laboratório de
Referência Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, através de método fenotípico
BACTEC MGIT e de testes moleculares.
Foram selecionados os pacientes através do sistema SITE-TB
alimentado pelo NVE/SEH-HC-Unicamp relativos ao período de janeiro de 2013
a junho de 2019, de acordo com os seguintes critérios de inclusão:
 pacientes com idade maior ou igual a 18 anos, com diagnóstico
laboratorial de TB-MDR pulmonar, extra-pulmonar ou
pulmonar/extrapulmonar;
 disponibilidade dos isolados clínicos do M. tuberculosis para
execução dos testes laboratoriais moleculares.
Foram considerados como critérios de exclusão:
 Isolados que não foram eficientemente recuperados para
realização dos testes laboratoriais moleculares.

4.3 Desenvolvimento metodológico

Uma visão geral do desenvolvimento do estudo é apresentada por meio

do fluxograma (Figura 1) abaixo:
Figura 1: Desenvolvimento do estudo

Seleção dos casos

SITE-TB e LPC

Estudo
Estudo
Experimental fase
Epidemiológico
I (LAMP)

Proporção de Pré-XDR ou Desenho sondas mutações no gene

TB-XDR (BACTEC-MGIT) gyrA

LPA: mutações
Avaliação em cepa de
resistência às
referência e isolados locais
fluorquinolonas

Fonte: Elaborado pela autora, 2019.

4.3.1 Estudo epidemiológico: Avaliação

a. Dados epidemiológicos

Após consulta ao banco de dados do SITE-TB e seleção dos pacientes

de acordo com os critérios supracitados, as informações foram compiladas e
avaliadas através dos softwares Excel 2010 e SigmaPlot 12.0.
As variáveis de interesse foram:
 Prevalência de Pré-XDR ou TB-XDR (BACTEC-MGIT) entre os
casos de tuberculose resistente à rifampicina e isoniazida;
 Caracterização da forma clínica;
 Indicadores de vigilância epidemiológica de oportunidade:
intervalo entre o diagnóstico de tuberculose e a detecção da
multirresistência; intervalo entre o diagnóstico da TB-MDR e da
TB pré-XDR ou XDR;
 Desfecho clínico;

b. Recuperação dos isolados micobacterianos e extração de DNA

Os isolados clínicos oriundos de pacientes atendidos no Ambulatório de

Referência para Tuberculose Multirresistente do Hospital de Clínicas da
UNICAMP, são avaliados em parceria com o Laboratório de Microbiologia
Clínica do mesmo hospital. Após a confirmação de algum tipo de resistência
aos fármacos, os espécimes clínicos e quando possível, as cepas microbianas,
são armazenados em freezer -70ºC.
Após a avaliação dos dados epidemiológicos foi realizado o rastreio das
amostras clínicas ou isolados micobacterianos dos pacientes com perfil de
sensibilidade aos fármacos de interesse.
Para a recuperação das amostras, todas as cepas foram semeadas em
meio de cultura Lowenstein Jensen e mantidas em incubação a xxx ºC de xxx a
xxx dias (BRASIL, 2008). As amostras que não apresentaram crescimento
após 60 dias de incubação foram consideras inadequadas para esse estudo.
O DNA microbiano das cepas foi posteriormente extraído através da
técnica de lise térmica como proposto por Warren et al. (2006):
 Partindo do meio sólido, uma alçada da colônia de Mycobacterium
tuberculosis foi transferida para um tubo criogênico, contendo 300
uL de água ultrapura.
 Centrifugação por 15 minutos a 13.000 rpm/min
 Descarte do sobrenadante
 Adição de 110 uL de água ultrapura e ressuspensão do pellet
presente no tubo
 Aquecimento em banho seco por 30 minutos a 100ºC
 Permanência em ultrassom por 15 minutos (etapa adicionada a
metodologia de Warren).

c. Line Probe Assay: avaliação de mutações de resistência a

fluoroquinolonas.

De acordo com o protocolo de bula do teste, as etapas subsequentes à

extração de DNA incluem amplificação do material por PCR, hibridização,
detecção e interpretação dos resultados.
A etapa de amplificação foi realizada da seguinte forma para cada uma
das amostras:
 Em um tubo do tipo Eppendorf, preparação de 10 uL da mistura
para PCR :
1. 7,5 uL da solução Master Mix Taq Green (GenoType...)
 2. 0,2 uL do primer TB11 (GenoType...)
3. 0,2 uL do primer TB12 (Genotype...)
4. 0,2 uL do primer TB284 (Genotype..)
5. 0,2 uL do primer TB850 (GenoType...)
6. 1,7 uL de água ultrapura
 Adição de 35 uL do componente AM-B (Genotype..)
 Adição de 5 uL do DNA extraído.
 Amostras levadas ao termociclador Eppendorf e submetidas ao
ciclo:
1. 1 ciclo a 95°C por 15 min;
2. 10 ciclos a 95°C por 30 segundos e a 65°C por 2 minutos;
3. 20 ciclos a 95°C por 25 segundos, 50°C por 40 segundos e
70°C por 40 segundos;
4. 1 ciclo a 70°C por 8 minutos.
Após ter o material genético amplificado, foram realizadas as etapas de
hibridização e detecção:
 Preparação dos reagentes do kit Genotype...:
1. Pré-aquecimento em banho-maria com agitação das
soluções HYB e STR entre 37°C a 45ºC;
2. Diluição dos reagentes CON-C e COM-D (Conjugado
Concentrado) e SUB-C e SUB-D (Substrato Concentrado);
3. Pré-aquecimento da solução de lavagem a temperatura
ambiente.
 Hibridização das fitas e detecção de resistência:
1. Utilizando uma rack do tipo TwinCubator®, adição de 20 uL
da Solução de Desnaturação (DEN) a cada um dos poços
(cada poço corresponde a uma amostra);
2. Adição de 20 uL da amostra amplificada nos respectivos
poços, seguidos por incubação de 5 minutos a temperatura
ambiente;
3. De maneira cuidadosa, adição de 1 mL do Tampão de
Hibridização (HYB) e homogeneização;
 4. Introdução e imersão das tiras de teste em cada um dos
poços; Incubação em banho-maria com agitação por 30
minutos a 45°C;
5. Com o auxílio de uma micropipeta, remoção (por
aspiração) do tampão HYB;
6. Adição de 1 mL da Solução de Lavagem Adstringente
(STR) a cada um dos poços e nova incubação por 15
minutos a 45°C;
7. Em temperatura ambiente, remoção da solução STR e
lavagem das fitas com 1 mL da Solução Rinse (RIN).
Remoção do RIN;
8. Adição de 1 mL do Conjugado (CON) diluído a cada poço e
incubação por 30 minutos a temperatura ambiente;
9. Remover a solução de conjugado e lavar cada uma das
tiras duas vezes com a RIN e uma vez com água
deionizada;
10. Adição do Substrato diluído a cada poço e incubação com
agitação fora da luz direta de 3 a 20 minutos;
11. Remover as tirar e parar a reação assim que as bandas
estiverem claramente visíveis.
 Avaliação e interpretação dos resultados:
Os testes baseados em Line Probe Assay possuem mecanismos
de controle de qualidade para garantir o bom desempenho do produto.
Cada uma das tiras possui 6 zonas de controle: uma zona de Controle
de Conjugado (CC), que visa garantir a ocorrência da correta ligação do
conjugado à fita e reação cromogênica; uma zona de Controle de
Amplificação (AC); quatro zonas de Controle de Loci (gyrA, gyrB, rrs e
eis), para verificar a sensibilidade da reação a cada um dos genes
testados. As duas primeiras zonas controles (CC e AC), são de
aparecimento obrigatório em todas as reações.
Figura 2: Esquema tira de teste

Em cada lote de teste realizado, foram utilizadas três amostras

controle: uma cepa de referência H37Rv M. tuberculosis como controle
positivo da reação, uma cepa de M. tuberculosis com resistência
conhecida à fluoroquinolonas e água deionizada como controle negativo.
As tiras foram interpretadas de acordo com os critérios e
orientações contidas em bula do teste. Abaixo, esquema de
interpretação de cada um dos genes de resistência.

Figura 3 guia interpretação gyrA

 Figura 4 Guia interpretação gyrB

A resistência aos aminoglicosídeos é avaliada através da presença de

mutações nos genes rrs e eis, sendo o segundo, associado a resistência em
baixo nível à Kanamicina.

Figura 5 Guia interpretação rrs e eis

Todos os resultados foram tabulados e avaliados utilizando os softwares

Excel 2010 e Epi Info.

4.3.2 Estudo experimental de fase I:

a. Desenho das sondas iniciadoras

A técnica LAMP utiliza de 2 a 3 pares de primers para reconhecimento

de 6 regiões FIP (Forward Inner Primer), BIP (Backward Inner Primer), F3
(Forward Outer Primer), B3 (Backward Outer Primer), LB (Loop Primer B) e LF
(Loop Primer F) (Figura 1). A base para produção é a área conservada do
material genético que se pretende amplificar (NOTOMI et al., 2000).
Para este estudo, foram desenhados primers específicos para regiões
conservadas da porção D94G do gene gyrA. Para isso, foi utilizada a base de
dados GenBank (disponibilizada pelo National Center for Biotechnology
Information - NCBI) para a pesquisa do genoma do isolado de M. tuberculosis,
onde a amostra escolhida foi a de código HN-24, depositada na plataforma sob
o número de acesso AP018033.1.
 Através do software Mega7, duas cópias da sequência genética do gyrA
foram inseridas e, em uma delas, a posição 282 (referente à porção D94G) foi
excluída para que, assim, seja possível caracterizar o ponto de mutação em
uma das sequências.
Posteriormente, foi realizado o alinhamento das sequências
nucleotídicas através da plataforma MUSCLE. As propriedades físicas das
sequências nucleotídicas foram determinadas através do OligoCalc.
O desenho dos primers foi realizado utilizando o software
PrimerExplorer, versão 5 (Eiken Chemical Co., 2017). Com base nas
informações genéticas inseridas, foram obtidos dois conjuntos de sondas com
quatro primers em cada um: dois primers internos (FIP e BIP), dois externos
(F3 e B3).

b. Desenho das sondas iniciadoras

c. Preparo das sondas e reação de LAMP