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Talanta 251 (2023) 123783

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Plataforma eletroquímica de detecção de antígeno baseada em papel usando anticorpo

monoclonal derivado de planta para detecção de SARS-CoV-2

Jutamas Jaewjaroenwattana a, Waranyoo Phoolcharoen b , Ekawat Pasomsub c ,

a,*
Prinjaporn Teengam a,**, Orawon Chailapakul
a
Centro de Excelência em Eletroquímica e Espectroscopia Óptica, Departamento de Química, Faculdade de Ciências, Universidade Chulalongkorn, Pathumwan, Bangkok, 10330,
Tailândia b

Departamento de Farmacognosia e Botânica Farmacêutica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Centro de Excelência em Produtos Farmacêuticos de Produção Vegetal,
Universidade Chulalongkorn, Pathumwan, Bangkok, 10330, Tailândia
c
Divisão de Virologia, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Hospital Ramathibodi, Universidade Mahidol, Bangkok, Tailândia

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: As abordagens atuais das plataformas de diagnóstico para a deteção de infeções por SARS-CoV-2 basearam-se principalmente na
SARS-CoV-2
adaptação da tecnologia existente. Neste trabalho foi estabelecida uma plataforma de detecção eletroquímica simples e de baixo custo
Anticorpo à base de plantas
para detecção do antígeno SAR-CoV-2. O sensor proposto combinou o inovador imunosensor descartável à base de papel e o anticorpo
Imunosensor eletroquímico baseado em papel
monoclonal CR3022 anti-SARS-CoV-2 de base vegetal de baixo custo, expresso em Nicotiana benthamiana. O nanocristal de celulose foi
Voltametria de pulso diferencial
Ponto de atendimento
modificado no eletrodo de grafeno impresso em tela para fornecer os abundantes grupos funcionais COOH na superfície do eletrodo,
levando à alta capacidade de imobilização de anticorpos.
A quantificação da proteína spike do domínio de ligação ao receptor de presença (RBD) do SARS-CoV-2 foi realizada 3-/4- usando
voltametria de pulso diferencial monitorando a mudança de corrente de [Fe(CN)6] solução redox. A
mudança atual de [Fe(CN)6] 3-/4- antes e depois da presença do RBD alvo poder ser claramente distinguido,

fornecendo uma relação linear com a concentração de RBD na faixa de 0,1 pg/mL a 500 ng/mL com o limite mínimo de detecção de 2,0 fg/
mL. A plataforma proposta foi aplicada com sucesso para detectar RBD em amostras de swab nasofaríngeo com resultados satisfatórios.
Além disso, o imunossensor baseado em papel foi estendido para quantificar o nível de RBD em amostras de saliva enriquecidas,
demonstrando a ampla aplicabilidade deste sistema. Este imunossensor eletroquímico baseado em papel tem potencial para ser empregado
como teste no local de atendimento para diagnóstico de COVID-19.

1. Introdução
A pandemia da doença Coronavírus (COVID-19) causada pela Síndrome Respiratória
Aguda Grave Coronavírus 2 (SARS-CoV-2) tornou-se um importante problema de saúde
pública em todo o mundo. A Organização Mundial da Saúde (OMS) informou que 518
milhões de populações foram infectadas, com mais de 6,3 milhões de mortes em junho
de 2022 [1]. Embora as vacinas tenham sido desenvolvidas atualmente para prevenir a
infecção, o número de pacientes recém-infectados ainda dificilmente reduz devido a
mutações do vírus [2,3]. O surto começou, portanto, a permitir testes de diagnóstico para
o rastreio e prevenção da propagação da doença. Os métodos diagnósticos atuais
baseiam-se exclusivamente nas tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos, como
reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) [4–6] e
Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) [7–9]. No entanto, estes métodos têm
méritos, tais como exigem instrumentos caros e etapas de operação sofisticadas, que
são os principais gargalos nos testes que aumentam drasticamente o custo e o tempo de
ensaio desde a amostra até a resposta. Portanto, esforços mais recentes concentraram-
se em ensaios sorológicos para determinar infecção prévia [10–12]. O ensaio
imunoenzimático (ELISA) representa o método padrão ouro para testes sorológicos, que
é caro e deve ser realizado em laboratório [13,14]. Os imunoensaios de fluxo lateral
(LFAs) foram desenvolvidos para servir como uma ferramenta no local de atendimento
(POC), pois são fáceis de usar e fornecem resultados qualitativos (sim/não) ou
semiquantitativos [15,16] .
No entanto, os LFAs são relativamente pouco sensíveis, tornando-os propensos a
resultados falsos positivos e/ou negativos [17]. Assim, melhorias significativas de

* Autor correspondente.
** Autor correspondente.
Endereços de e-mail: p.teengam@hotmail.com (P. Teengam), corawon@chula.ac.th (O. Chailapakul).

https://doi.org/10.1016/j.talanta.2022.123783 Recebido em
9 de junho de 2022; Recebido de forma revisada em 20 de julho de 2022; Aceito em 24 de julho de 2022.
Disponível online em 7 de agosto de 2022.
0039-9140/© 2022 Elsevier BV Todos os direitos reservados.
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Os testes à COVID-19 são necessários para substituir os testes laboratoriais, bem como
para fornecer informações de diagnóstico rápidas e sensíveis aos pacientes e aos
prestadores de cuidados de saúde.
Os imunossensores eletroquímicos têm sido continuamente desenvolvidos e aplicados
em várias aplicações de biossensores [18–20] , pois oferecem as vantagens de alta
sensibilidade, simplicidade e capacidade em análises quantitativas. No entanto,
tradicionalmente a detecção eletroquímica dependia de instrumentos volumosos, limitando
seu potencial para aplicações pontuais. Os dispositivos analíticos eletroquímicos
baseados em papel (ePADs) [21–25] foram introduzidos para enfrentar o desafio de
desenvolver sistemas miniaturizados. Os ePADS têm despertado um interesse significativo
para utilização como um projeto de dispositivo alternativo para imunoensaio porque
apresentam vantagens notáveis, incluindo facilidade de uso, baixo custo, portabilidade e
descartabilidade. No entanto, para obter uma plataforma de diagnóstico altamente
sensível, a principal obstrução é a área limitada como parte do eletrodo em microescala,
levando a um limite de detecção (LOD) ainda mais baixo.
Os nanomateriais de celulose (CNs), especialmente as nanofibras de celulose (CNF)
e os nanocristais de celulose (CNC) são os materiais de nova geração que atualmente
têm ganhado crescente interesse. Os CNs possuem propriedades atraentes, incluindo
abundância de grupos funcionais, alta proporção de aspecto, fortes propriedades
mecânicas e biocompatibilidade. É importante ressaltar que os CNs continham abundantes
grupos funcionais COOH e/ou OH na estrutura, permitindo diversas funcionalizações por
meio de reações químicas.
Essas excelentes características permitem que sejam amplamente aplicados em
aplicações de quimio/biossensores [26,27].
Em relação ao imunoensaio, o anticorpo é o fator chave para limitar a sensibilidade e
seletividade do método. A maioria dos anticorpos disponíveis comercialmente são
produzidos em células de mamíferos que ainda apresentam algumas limitações, como
altos custos de produção e processos complicadores.
Além disso, os anticorpos produzidos em mamíferos podem levar potencialmente os
humanos a infecções [28,29]. Recentemente, as plantas estão sendo exploradas como
um novo hospedeiro alternativo para a produção de anticorpos, especialmente durante
situações inesperadas ou de emergência que não podem ser resolvidas pelos sistemas
existentes. O anticorpo à base de plantas oferece muitas vantagens, como produção
rápida, ecológica e de baixo custo [30]. Em 2020, Rattanapisit e colaboradores propuseram
o uso de um método de expressão temporário para produzir a proteína spike do domínio
de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 e o anticorpo monoclonal (mAb) CR3022
em Nicotiana benthamiana [31 ] . Este RBD e mAb CR3022 produzidos em plantas
ilustraram uma ligação específica ao SARS-CoV-2. Curiosamente, este anticorpo baseado
em plantas tem capacidade para ser aplicado em aplicações de detecção imunológica.
Aqui, relatamos um imunossensor eletroquímico baseado em papel usando eletrodo
modificado por CNC em combinação com um novo anticorpo monoclonal baseado em
planta que foi usado como anticorpo de captura para detectar RBD da proteína spike
SARS-CoV-2 pela primeira vez. A voltametria de pulso diferencial (DPV) foi usada para
quantificar o nível de RBD medindo a resposta atual de [Fe(CN)6]
3-/4- solução redox. Este imunossensor foi aplicado
com sucesso para detecção de SARS-CoV-2 RBD em amostras de swab nasofaríngeo e
pode ser estendido para amostra de saliva, que apresenta bom desempenho analítico, é
fácil de usar e de baixo custo para SARS-CoV-2 diagnóstico.
2. Materiais e métodos
2.1. Produtos químicos e aparelhos
Todos os reagentes utilizados são de grau de reagente analítico. O nanocristal de
celulose com grupo carboxílico (CNC-COOH) foi adquirido no laboratório de celulose
(Fredericton, Canadá). mAb CR3022 (números de acesso do GenBank: DQ168569.1 e
DQ168570.1) e RBD da proteína spike SARS-CoV-2 (número de acesso do GenBank:
YP_009724390.1; F318-C617) foram obtidos da Baiya Phytopharm Co., Ltd. (Bangkok,
Tailândia). Hexacianoferrato de potássio (III) (K3Fe (CN) 6), solução salina tampão fosfato
(PBS) pH 7,4, 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-hidroxissulfosuccinimida
(sulfo-NHS), leite desnatado ( SKI) e albumina sérica humana (HSA) foram adquiridas da
Sigma-Aldrich (Missouri,
2
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EUA). Nitrato de potássio (KNO3), ácido L-(+)-ascórbico e D-(+)-glicose anidra foram
adquiridos de Carlo Erba (Barcelona, Espanha). A saliva artificial foi obtida da (Sigma-
Aldrich). Todas as soluções aquosas foram preparadas com água Milli-Q ultrapurificada
1
(R ÿ 18,2 Mÿ cm- a 25 ÿC) da Merck Millipore (Millipore Bedford, EUA).
As tintas de grafeno e cloreto de prata / prata (Ag / AgCl) foram adquiridas da Serve
Science Co., Ltd. Papel de filtro grau no. 1 foi obtido da Whatman International Ltd, (St
Louis, EUA). O padrão serigráfico foi desenhado no Adobe Illustrator e o bloco serigráfico
foi feito pela Chaiyaboon Co. Ltd, (Bangkok, Tailândia). As áreas hidrofóbica e hidrofílica
nos ePADs foram criadas por uma impressora de cera (Xerox Color Qube modelo 8570,
Japão). Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (FE-SEM) (7610F a 5
kV) foi usada para confirmar o sucesso da modificação do eletrodo. Todas as medições
eletroquímicas foram realizadas utilizando o potenciostato PalmSens 4 (PalmSens Bv,
Holanda). A espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) foi realizada na faixa de
frequência de 100 kHz a 0,01 Hz e potencial AC de 0,25 V. (vs Ag/AgCl). A votametria
cíclica foi realizada de -0,3 a 0,6 V com taxa de varredura de 0,1 V/s. O DPV foi utilizado
durante todo o experimento com as seguintes condições: faixa de potencial de -0,3 a 0,7
V. (vs Ag/AgCl), potencial de passo de 0,01 V, potencial de pulso de 0,05 V e taxa de
varredura de 0,05 V/s.
2.2. Produção de anticorpo monoclonal baseado em plantas (CR3022)
O mAb anti-SARS-CoV-2 CR3022 foi preparado usando sistemas de expressão
transitória em plantas conforme descrito anteriormente [31]. Resumidamente, os
fragmentos do gene codificador do mAb CR3022 localizados nas regiões da cadeia
pesada variável (VH) e da cadeia leve variável (VL) foram otimizados por códon para
expressar em N. benthamiana. O VH e VL foram fundidos com regiões de cadeia pesada
constante (CH) e cadeia leve constante (CL) de IgG1 humana, respectivamente. Os
cassetes de expressão pBY2e-CR3022 HC e pBY2e-CR3022 LC foram criados clonando
as sequências de codificação completas de CR3022 HC e LC em um vetor geminiviral
(pBY2e) usando uma ligação de três fragmentos [29] . Os vetores de expressão obtidos
foram então transformados na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens por
eletroporação. Em seguida, Agrobacterium recombinante contendo pBY2e-CR3022 HC
e pBY2e-CR3022 LC foram sedimentados e ressuspensos em tampão de infiltração até
uma DO600 de 0,4 e misturados em uma proporção de 1:1 antes da infiltração a vácuo e
infiltrados nas folhas de N. benthamiana que foram cultivadas em casa de vegetação com
ciclo de 8 horas de escuro/16 horas de luz a 25 ÿC por 6–8 semanas. Após 3 dias, as
folhas agroinfiltradas foram colhidas e extraídas as proteínas em tampão de extração (pH
7,4) [32]. A parte extraída foi homogeneizada seguida de centrifugação a 15.000 g por 30
min a 4 ÿC para obtenção do extrato bruto. A proteína recombinante no extrato vegetal
clarificado foi purificada usando resina de proteína A. Finalmente, o mAb CR3022 obtido
foi confirmado por SDS-PAGE e Western blot.
2.3. Projeto e fabricação de imunossensor eletroquímico baseado em papel
O imunossensor à base de papel foi preparado utilizando papéis de filtro (Whatman
No.1). O padrão serigrafado foi desenhado pelo Adobe Illustrator CS6. Uma impressora
de cera comercial (ColorQube8580) foi utilizada para criar áreas hidrofóbicas de acordo
com o desenho do padrão. Após a impressão em cera, o papel estampado foi aquecido a
150 ÿC por 1 min para derreter a cera e obter a barreira hidrofóbica. A Fig. 1 mostra o
projeto e operação do imunossensor baseado em papel. Conforme mostrado na Fig. 1A,
este imunossensor baseado em papel consiste em duas partes: a parte de detecção e a
parte absorvente. A parte de detecção contém um sistema de três eletrodos, fabricado
usando um método interno de serigrafia. Tinta de grafeno foi empregada para preparar os
eletrodos de trabalho (3 mm DI) (WE) e contador (CE). A tinta prata/cloreto de prata (Ag/
AgCl) foi servida como eletrodo de pseudo-referência (RE) e almofadas condutoras. A
parte absorvente foi desenhada fixando a almofada absorvente na parte traseira com fita
adesiva dupla face (Fig. 1B). O dispositivo foi montado dobrando a parte absorvente sob
a parte de detecção para
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Figura 1. Desenho em vista superior (A), vista lateral (B), operação (C) e procedimento de detecção (D) do imunossensor eletroquímico baseado em papel.
utilizar a capacidade de absorção da almofada absorvente durante a etapa de
lavagem após a adição da amostra (Fig. 1C). As etapas operacionais do dispositivo
foram ilustradas na Figura 1D.
2.4. Imobilização do mAb CR3022
Para a etapa de imobilização, o mAb CR3022 foi imobilizado covalentemente
na superfície do eletrodo de trabalho. As etapas de imobilização do anticorpo foram
mostradas no Esquema 1. Primeiro, 5 ÿL de solução CNC a 0,25% em água Milli-
Q foram colocados em WE para fornecer o grupo carboxílico (COOH) na superfície
do eletrodo. Em seguida, deixar o CNC secar em estufa a 37 ÿC por 15 min. Em
seguida, 5 ÿL de solução EDC/NHS (10 mM/30 mM) contendo 0,96 mg de EDC e
3,25 mg de sulfo-NHS preparada em PBS pH 7,4 (500 ÿL) foram adicionados à
superfície do eletrodo modificado por CNC para agir. como agente de acoplamento
e incubado em temperatura ambiente por 1 h para ativar o grupo COOH, seguido
de lavagem com PBS pH 7,4. Em seguida, 1 ÿg/mL de anticorpo de captura mAb
CR3022 (5 ÿL) foi colocado na superfície do eletrodo modificado e incubado em
condição úmida por 1 h para gerar a ligação covalente através da conjugação direta
entre um grupo carboxílico (COOH) de CNC. e os grupos amina primários (–NH2)
dos anticorpos de captura. Depois disso, o Ab/CNC/SPGE
Esquema 1. O processo de imobilização covalente do mAb CR3022 na superfície do eletrodo para detecção eletroquímica de SARS-CoV-2 RBD.
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o eletrodo foi lavado duas vezes com PBS pH 7,4 para remover o excesso de
anticorpos não ligados na superfície WE. Em seguida, a superfície do eletrodo foi
bloqueada com 5 ÿL de solução de leite desnatado (SKI) a 2% (p/v) por 1 h para
evitar a ligação inespecífica da proteína. Finalmente, o SKI/Ab/CNC/SPGE foi
lavado duas vezes com PBS pH 7,4 e armazenado a 4 ÿC antes do uso.
2.5. Medição eletroquímica
Para detecção eletroquímica, 5 ÿL de uma concentração designada de RBD
preparada em PBS pH 7,4 foram colocados na superfície do eletrodo e incubados
em condições úmidas por 2 h. Após a incubação, a parte absorvente foi dobrada
sob a parte de detecção (como mostrado na Fig. 1C), seguida de lavagem de todo
o antígeno não ligado com PBS pH 7,4. A solução lavada pode ser absorvida devido
à propriedade de absorção da almofada absorvente. A parte absorvente foi então
desdobrada antes da detecção eletroquímica. Todas as medições eletroquímicas
foram realizadas utilizando [Fe 3-/4- (CN)6] 5 mM.
em 0,1 M KNO3.
2.6. Análise de amostra real
As amostras clínicas de esfregaço nasofaríngeo e de garganta foram obtidas
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seguindo o protocolo aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Medicina do Hospital Ramathibodi (Certificado de aprovação: COA. MURA2021/879).
Consentimento informado por escrito e aprovação ética foram obtidos para todos os
pacientes. Todas as amostras foram coletadas e armazenadas em meio de transporte
viral (VTM) a -80 ÿC antes da medição eletroquímica usando o procedimento acima
mencionado. Por fim, os resultados obtidos foram validados com os obtidos no RT-PCR
padrão.
3 Resultados e discussão
3.1. Caracterização de superfície de eletrodo modificado CNC
Para investigar se a superfície do eletrodo foi modificada com sucesso com CNC,
as morfologias superficiais dos eletrodos não modificados e modificados foram realizadas
por FE-SEM e microscópio confocal de varredura a laser (LSCM). Como mostrado na
Fig. S1A, o eletrodo não modificado exibiu uma superfície rugosa com folhas de grafeno
(painel i).
Além disso, o LSCM apresentou áreas verde-amareladas, indicando superfícies
empilhadas de folhas de grafeno com rugosidade média de 3,071 ÿm.
Após a fundição do CNC, foi observada uma película lisa cobrindo a superfície do
eletrodo (painel ii). O LSCM forneceu as áreas verde-azuladas, indicando as áreas de
baixa rugosidade com rugosidade média de 2,371 ÿm. Além disso, espectroscopia de
infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) foi utilizada para confirmar a
existência do grupo carboxílico na superfície do eletrodo modificado por CNC. Os
espectros FT-IR obtidos de eletrodos não modificados e modificados foram mostrados
na Fig. S1B, todas as bandas típicas de CNC incluindo alongamento C = O a 1730 cm-
1
alongamento C – O a 1025 1 , transferência de elétrons afetada pelo semi-isolador CNC. Quando o Ab foi imobilizado
1 cm ÿ , Foram observados alongamentos C 1– H a 2.945 cm- e alongamentos OH a
3.350 cm- . Embora as bandas características obtidas do CNC / SPGE tenham sido
semelhantes às do SPGE puro, o pico característico do alongamento C = O em 1730
1 1
cm- e do alongamento C – H ,1OH
em alongando-se
2945 cm- aumentou,
em 3350
devido
cmÿ à presença de CNC.
Esses resultados
Figura 2. Caracterização dos eletrodos modificados passo a passo por EIS (A), CV (B) e resposta de corrente de 5 mM [Fe(CN)6]
de 500 ng/mL de RBD que foram realizadas por DPV (C).
4
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confirmou o sucesso da modificação CNC na superfície do eletrodo.
3.2. Caracterização eletroquímica
A fim de seguir as etapas de modificação do eletrodo, a medição da espectroscopia
de impedância eletroquímica (EIS) foi realizada em uma modificação de superfície
3/4
passo a passo usando 5 mM [Fe(CN)6] pol. 0,1 M KNO3. O
o diâmetro do semicírculo da curva de Nyquist representa a resistência à transferência
de elétrons (Rct), indicando a capacidade de transferência de elétrons entre a superfície
do eletrodo e a solução redox. O Rct aumenta quando moléculas isolantes são
adicionadas à superfície do eletrodo. Os gráficos de Nyquist em diferentes estágios do
processo de modificação foram mostrados na Fig . O SPGE simples forneceu o menor
semicírculo com o valor Rct de 1,13 kÿ.
Após modificação do CNC (CNC/SPGE), o valor Rct aumentou para 1,71 kÿ devido à
sua propriedade semi-isolante. Quando Ab foi adicionado à superfície do eletrodo (Ab/
CNC/SPGE), o Rct aumentou para 2,0 kÿ, indicando o sucesso na imobilização
covalente de anticorpos na superfície do eletrodo. O incremento de Rct (3,5 kÿ) foi
ainda observado em SKI/Ab/CNC/SPGE devido ao impedimento estérico do SKI,
resultando em 3/4 para alcançar a superfície do eletrodo [33].
menor acessibilidade de [Fe(CN)6]
Além disso, CV foi utilizado para verificar o sucesso da modificação do eletrodo 3-/
4- in
ficação monitorando a mudança de corrente usando 5 mM [Fe(CN)6]
0,1 M KNO3. Como mostrado na Figura 2B, a maior corrente de pico anódica foi
observada no SPGE (0,108 mA). Uma diminuição na corrente de pico anódica (0,084
mA) foi observada após modificação do CNC (CNC/SPGE) devido a uma oxidação da
em CNC/SPGE, a corrente anódica diminuiu para 0,067 mA indicou que o Ab foi
imobilizado com sucesso na superfície do eletrodo através de reação covalente. Após o
bloqueio com SKI (SKI/Ab/CNC/SPGE), a corrente anódica diminuiu ainda mais para
0,028 mA.
Estes resultados demonstraram claramente a modificação bem sucedida da superfície
do eletrodo.
3ÿ /4ÿ
na ausência e na presença
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A detecção eletroquímica de SKI/Ab/CNC/SPGE antes e depois da adição da
proteína spike SARS-CoV-2 RBD foi então investigada usando DPV. Conforme exibido
na Fig. 2C. Na presença de RBD, uma menor transferência de elétrons pôde ser
observada devido à blindagem da superfície do eletrodo pelo imunocomplexo, resultando
em uma diminuição notável da resposta de corrente [34]. Este resultado confirmou a
formação do complexo antígeno-anticorpo na superfície do eletrodo. Todos os resultados
obtidos sugerem que o imunossensor proposto pode ser aplicado para detecção
SARS-CoV-2.
3.3. Otimização de parâmetros variáveis
3.3.1. Efeito da concentração CNC
O efeito da concentração de CNC foi investigado inicialmente. O CNC foi estudado
na faixa de concentração de 0,1 a 0,3% (v/v) utilizando a seguinte condição: 1 ÿg/mL de
Ab, 5% (p/v) de SKI, 0,5 ÿg/mL de RBD e tempo de incubação de 60 minutos. Como
mostrado na figura S2A, a mudança na resposta de corrente (ÿI) obtida antes e depois
da incubação com RBD aumentou com o aumento da concentração de CNC. Isto se
deve ao aumento do grupo carboxila na maior concentração de CNC, levando a mais
locais para imobilização de Ab. No entanto, o valor ÿI diminuiu na concentração de CNC
acima de 0,25%, o que poderia ser explicado pela formação de CNC automontado como
uma camada de filme na superfície do eletrodo que reduziu o local de ligação da
imobilização de Ab [35] . Portanto, foi selecionado 0,25% (v/v) de concentração de CNC
para os próximos estudos.
3.3.2. Efeito da concentração Ab
O efeito da concentração de Ab foi então otimizado na faixa de 0,25–1,25 ÿg/mL
usando a seguinte condição: 0,25% (v/v) de CNC, 5% (p/v) de SKI, 0,5 ÿg/mL de RBD e
tempo de incubação de 60 min. Como mostrado na figura S2B, o ÿI aumentou com o
aumento da concentração de Ab até atingir um patamar na concentração de 1 ÿg/mL
devido a uma supersaturação da superfície do eletrodo em condições acima desta
limitação. Além disso, a maior quantidade de Ab também aumentou a densidade da
superfície que dificultou a acessibilidade de mais Ab para imobilizar na superfície do
eletrodo [36]. Assim, a concentração de 1 ÿg/mL de Ab foi selecionada para novos
experimentos.
3.3.3. Efeito da concentração de ESQUI
Neste trabalho, o SKI foi utilizado como agente bloqueador de superfície devido à
sua capacidade de prevenir uma ligação inespecífica e fornecer a maior relação sinal/
fundo (S/B) quando comparado à albumina sérica bovina (BSA) [19] . A concentração de
SKI foi otimizada na faixa de 1% a 5% (p/v) usando a seguinte condição: 0,25% (v/v) de
CNC, 1 ÿg/mL de Ab, 0,5 ÿg/mL de RBD e tempo de incubação de 60 minutos. O ÿI obtido
antes e depois da incubação com RBD em função da concentração de SKI é exibido na
Fig. Observou-se que o ÿI aumentou com o aumento da concentração de SKI e atingiu o
máximo em 2% (p/v).
Quando a concentração mais alta de SKI foi aplicada, o sinal de fundo na ausência do
RBD alvo também aumentou, resultando na diminuição do valor ÿI. Portanto, 2% (p/v) da
concentração de SKI foi utilizado para experimentos posteriores.
3.3.4. Efeito do tempo de incubação
A influência do tempo de incubação entre o alvo RBD e o Ab imobilizado na superfície
do eletrodo foi otimizada. Os 0,5 ÿg/mL de RBD foram incubados no eletrodo modificado
por Ab em diferentes momentos, seguido de lavagem com PBS. Como ilustrado na figura
S2D, o ÿI aumentou ligeiramente com o aumento do tempo de incubação e atingiu um
patamar após 2 h.
Este resultado indicou que o aumento no tempo de incubação proporcionou a melhoria
da eficiência de ligação entre Ab e RBD alvo [37].
No entanto, a superfície do eletrodo provavelmente ficou saturada em um tempo de
incubação mais longo, resultando em um transporte de massa limitado de moléculas
redox para acessar a superfície do eletrodo [38]. Portanto, o tempo de incubação de 2
horas foi selecionado como condição ideal.
5
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3.4. Desempenho analítico do imunossensor baseado em papel
O desempenho analítico do imunossensor eletroquímico baseado em papel para
detecção de SARS-CoV-2 foi avaliado. Conforme mostrado em 3-/4- Fig. 3A, o sinal de
corrente de [Fe(CN)6] diminuiu em função das
concentrações de RBD. A Figura 4B mostra que a mudança na resposta atual (ÿI)
calculada a partir do Iblank-IRBD (onde Iblank e IRBD são obtidos antes e depois da
incubação com RBD) aumentou com o aumento da concentração de RBD. A curva de
calibração obtida pela plotagem entre ÿI versus concentrações logarítmicas (Fig. 3B
inserção) forneceu uma relação linear na faixa de 0,1 pg/mL a 500 ng/mL com coeficiente
de correlação de 0,9931. O limite de detecção (LOD, S/N = 3) e o limite de quantificação
(LOQ, S/N = 10) foram calculados em 2 fg/mL e 8 fg/mL, respectivamente. O desempenho
analítico deste imunosensor proposto e de outros sistemas relatados anteriormente para
triagem de SARS-CoV-2 são comparados e resumidos conforme mostrado na Tabela
S1. Os resultados comparados sugeriram que um limite de detecção significativamente
inferior foi obtido a partir do nosso imunossensor proposto. Notavelmente, nosso
imunossensor baseado em papel combinado com o anticorpo vegetal pode ser preparado
de maneira fácil e barata em comparação com outros biossensores SAR-CoV-2.
3.5. Reatividade cruzada
Para investigar a reatividade cruzada de vários antígenos de vírus, o imunossensor
proposto em papel foi usado para testar com diferentes tipos de coronavírus patogênicos
humanos e vírus respiratórios, incluindo Proteína de Nucleocapsídeo (N) SARS
Recombinante (SARS-CoV-1), Proteína Recombinante de Nucleocapsídeo (N) de SARS
(SARS-CoV-1), Glicoproteína MERS Spike de Coronavírus Humano (S1), Glicoproteína
do Vírus Sincicial Respiratório Humano Recombinante (RSV), Receptor de Adenovírus
Coxsackie Humano Recombinante e Influenza conforme ilustrado na Fig. 4. Todos os
antígenos foram preparados na mesma concentração de 0,1 ng/mL antes de incubar na
superfície do eletrodo seguida pela medição eletroquímica. A porcentagem de correntes
normalizadas foi avaliada a partir de (ÿInterferência/ÿIRBD) × 100, onde ÿInterferência
obtida a partir da mudança na corrente de interferência em 0,1 ng/mL. Os resultados
indicaram que a corrente normalizada de MERS-CoV, RSV, Cox-sackie e Influenza foi
inferior a 5% em comparação com SARS-CoV-2, o que significa que a presença destes
antígenos não afeta este imunossensor. No entanto, a corrente normalizada do SARS-
CoV-1 foi superior a 5%. Isto significa que a N Protein SARS-CoV-1 afeta este
sistema proposto. Esta reatividade pode ser explicada pela semelhança de estrutura e
sequência de aminoácidos da proteína N do SARS-CoV-1 em comparação com o SARS-
CoV-2 [39]. Portanto, a proteína N do SARS-CoV-1 também é capaz de desencadear
respostas imunológicas contra o SARS-CoV-2 [40].
3.6. Reprodutibilidade e estabilidade do imunossensor baseado em papel
Para demonstrar a reprodutibilidade do imunossensor baseado em papel, três
eletrodos foram provados com três concentrações diferentes de proteína spike SARS-
CoV-2 RBD (0,01, 25, 100 ng/mL). O %RSD foi obtido na faixa de 0,3–2,9% (n = 3), que
foi inferior a 5%, indicando que este imunossensor proposto oferece boa reprodutibilidade
para a detecção de SARS-CoV-2.
Para avaliar a estabilidade, o imunossensor preparado foi armazenado em geladeira
a 4 ÿC antes do teste com 0,5 ÿg/mL de RBD a cada 3 dias. Observou-se que 98,17% de
sua resposta de corrente inicial foi retida dentro de um tempo de armazenamento de 5
dias, conforme mostrado na Fig. A curta vida útil do imunossensor proposto em papel
pode ser afetada pela condição úmida durante o armazenamento.
3.7. Detecção de SARS-CoV-2 em amostras de esfregaço nasofaríngeo e de garganta
Para ilustrar a capacidade do sistema proposto, o imunossensor baseado em papel
foi aplicado para detectar o antígeno SAR-CoV-2 em 14
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Figura 3. (A) Resposta DPV em 5 mM [Fe(CN)6] 3-/4- do imunossensor proposto em diferentes concentrações de RBD na faixa de 0,1 pg/mL a 500 ng/mL. (B)
Relação entre a corrente ÿ e a concentração de RBD (a inserção é a curva de calibração para o imunossensor proposto).
Figura 4. Reatividade cruzada do imunossensor proposto.
amostras de esfregaço nasofaríngeo e garganta obtidas no hospital Ramathibodi. Todas
as amostras coletadas foram armazenadas em solução de meio de transporte viral (VTM)
a -80 ÿC antes do uso, sem qualquer diluição. Os resultados obtidos em nosso sistema
foram comparados com aqueles determinados pelo método padrão RT-PCR, conforme
resumido na Tabela 1. Foi observada boa concordância entre as duas abordagens, e a
sensibilidade e especificidade do nosso sistema de detecção foram de 100%. Estes
resultados mostraram claramente que o imunossensor em papel poderia ser utilizado
para o rastreio do SARS-CoV-2 em amostras clínicas reais. No entanto, o anticorpo
monoclonal CR3022 baseado em plantas usado neste trabalho foi projetado para
reconhecer o RBD da sequência de referência da proteína spike SARS-CoV-2 Wuhan-
Hu-1. As outras variantes do SARS-CoV-2 não puderam ser reconhecidas pelo CR3022,
uma vez que os resíduos de aminoácidos na proteína spike do SARS-CoV-2 sofreram
mutações [41,42]. Esta alteração da estrutura do espigão mudaria a resposta imunitária
em epítopos cruciais reconhecidos pelo mAb.
3.8. Determinação de SARS-CoV-2 na saliva
Para demonstrar que nossa abordagem pode ser estendida para aplicação em
vários tipos de amostras, o imunossensor baseado em papel foi aplicado a
Tabela
1 Comparação dos resultados obtidos entre o imunossensor proposto e o método RT-PCR.
RT-PCR
+ -
Este imunossensor + 4
-
0 10
+: resultado positivo, ÿ : resultado negativo.
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detectar SARS-CoV-2 em saliva artificial. A seletividade para aplicação de saliva foi
examinada primeiramente. O imunossensor proposto foi testado com diversas
interferências que podem ser possivelmente encontradas na saliva, incluindo glicose,
ácido ascórbico (AA) e albumina sérica humana (HSA) [43,44].
Todas as interferências examinadas foram preparadas misturando-se com o RBD SARS-
CoV-2 (0,5 ÿg/mL) na concentração 100 vezes maior que o RBD alvo. S4, a mudança
na resposta da corrente foi observada de forma idêntica no RBD em relação ao RBD
misturado com outras interferências (%RSD foi inferior a 2%). Este resultado indicou que
o imunossensor proposto proporcionou boa seletividade para triagem de SARS-CoV-2
em amostra de saliva. A adição padrão de saliva artificial contendo concentrações
variadas de SARS-CoV-2 foi então estudada. A concentração de RBD de 0,05, 1,0, 20 e
400 ng/mL foi adicionada à saliva artificial. De acordo com a Tabela S2, as recuperações
percentuais de RBD fortificado foram obtidas em uma faixa aceitável de 40 a 120, com%
RSD de 0,6 a 13,2 [45]. Este resultado indicou que o imunossensor baseado em papel
pode ser estendido para detectar SARS-CoV-2 em amostras de saliva.
4. Conclusões
Uma nova plataforma eletroquímica de detecção de antígeno baseada em papel foi
desenvolvida com sucesso para detecção de SARS-CoV-2. A detecção eletroquímica
utilizando DPV foi realizada com base em uma etiqueta simples- 3-/4-
imunoensaio livre medindo a mudança atual via [Fe(CN)6]
antes e depois da adição do RBD alvo. A característica existente do nosso sistema
proposto é o uso do inovador mAb CR3022 baseado em plantas, que proporciona uma
notável simplicidade e economia em termos de produção de Ab. Além disso, a excelente
sensibilidade foi alcançada aproveitando a vantagem do CNC, pois oferece locais
abundantes do grupo funcional COOH para imobilização de Ab. O LOD e o LOQ foram
de 2,0 fg/mL e 8,0 fg/mL com alta especificidade. O dispositivo sensor proposto foi então
aplicado com amostras de swab nasofaríngeo e o sistema apresentou 100% de
sensibilidade e especificidade em comparação ao método padrão de RT-PCR. Além
disso, também demonstramos que nosso sistema existente pode ser estendido para
detectar RBD de SARS-CoV-2 em amostras de saliva. Dado o baixo custo e a elevada
especificidade do anticorpo utilizado, a adaptabilidade do sistema a diferentes tipos de
amostras e a simplicidade de utilização que beneficia do ensaio sem rótulo, o
desenvolvimento desta abordagem forneceu uma ferramenta alternativa valiosa para o
rastreio rápido de COVID -19. Embora tenhamos como alvo o SARS-CoV-2 com esta
plataforma, nosso dispositivo pode ser facilmente adaptado para outros alvos, trocando
o anticorpo de captura, permitindo que este sistema seja utilizado em diversas aplicações
de diagnóstico.
0 Declaração do autor de crédito
Jutamas Jaewjaroenwattana: Conceituação, Metodologia,
6
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J. Jaewjaroenwattana et al.
Investigação, Validação, Redação – versão original. Waranyoo Phool-charoen: Recursos,
Redação – revisão e edição. Ekawat Pasomsub: Recursos. Prinjaporn Teengam:
Conceitualização, Metodologia, Redação – revisão e edição. Orawon Chailapakul:
Supervisão, administração de projetos, aquisição de financiamento.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes ou relações
pessoais conhecidas que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Disponibilidade de dados
Os dados serão disponibilizados mediante solicitação.
Reconhecimentos
JJ reconhece o financiamento do 90º aniversário do Fundo da Universidade Chula-
longkorn (GCUGR1125651046M). A PT agradece com gratidão o apoio do Fundo do
Segundo Século (C2F), da Universidade Chulalongkorn. OC agradece o apoio financeiro
do Conselho Nacional de Pesquisa da Tailândia (NRCT) (N35A640020). Os autores
gostariam de agradecer o apoio do Centro de Excelência em Eletroquímica e Espectroscopia
Óptica (EOSCE) da Universidade Chulalongkorn. Os autores também agradecem ao Dr.
Wisarut Khamcharoen pela gentil assistência na edição do manuscrito.
Apêndice A. Dados suplementares
Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em https://doi. org/10.1016/
j.talanta.2022.123783.
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