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Biotecnologia Molecular
https://doi.org/10.1007/s12033-021-00431-7

REVEJA

A tendência das tecnologias baseadas em CRISPR na doença COVID-19: além

Edição do genoma

Zeinab Yousef Najafabadi1,2,3 · Songwe Fanuel4 · Reza Falak3 · Saeed Kaboli5 · Gholam Ali Kardar1,2

Recebido: 29 de setembro de 2021 / Aceito: 22 de novembro de 2021

© O(s) autor(es), sob licença exclusiva da Springer Science+Business Media, LLC, parte da Springer Nature 2021

Abstrato
As abordagens biotecnológicas sempre buscaram utilizar métodos inovadores e eficientes na prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças.
Esta ciência tem consistentemente tentado revolucionar a ciência médica empregando tecnologias de ponta em engenharia genômica e
proteômica. O sistema CRISPR–Cas é uma das técnicas emergentes no campo da biotecnologia. Até o momento, o sistema CRISPR–Cas
tem sido amplamente aplicado na edição de genes, visando sequências genômicas para diagnóstico, tratamento de doenças por meio de
manipulação genômica e na criação de modelos animais para pesquisas pré-clínicas.
Com o surgimento da pandemia de COVID-19 em 2019, há necessidade de desenvolvimento e modificação de novas ferramentas como o
sistema CRISPR–Cas para uso em emergências diagnósticas. Este sistema pode competir com outros métodos biotecnológicos existentes
em exatidão, precisão e amplo desempenho que podem garantir seu futuro nessas condições. Neste artigo, revisamos as várias plataformas
do sistema CRISPR–Cas destinadas ao diagnóstico de SARS-CoV-2, procedimentos terapêuticos antivirais, produção de modelos animais
para estudos pré-clínicos e estudos de triagem genômica para o desenvolvimento de medicamentos e vacinas.

Palavras -chave Sistemas CRISPR–Cas · SARS-CoV-2 · Diagnóstico · Abordagem antiviral · Estudo de associação ampla do genoma ·
Modelo animal

Introdução pelo terceiro surto humano em larga escala de sua família nas
últimas duas décadas. Este vírus zoonótico é um vírus de RNA de
O vírus SARS-CoV-2, membro da família Coronaviri dae, gênero fita simples de sentido positivo envelopado não segmentado com
Betacoronavirus, e agente causador da Doença de Coronavírus um grande tamanho genômico que tem alta transmissão animal-
2019 (COVID-19), é responsável humano e humano-humano em comparação com seus membros da
família [1]. A sequência genômica deste novo vírus emergente tem
uma alta taxa de mutação e recombinação, devido ao seu fenômeno
* Gholam Ali Kardar
único de autorreplicação [2]. No início da pandemia, a sequência
gakardar@tums.ac.ir
completa do genoma viral foi compartilhada por meio de abordagens
Zeinab Yousef Najafabadi z-
metagenômicas e a estrutura tridimensional de suas principais
yousefn@razi.tums.ac.ir
proteínas foi determinada [3]. Os quatorze quadros de leitura aberta
1
Departamento de Biotecnologia Médica, Escola de (ORF) do genoma do SARS-CoV-2 codificam dezesseis proteínas
Tecnologias em Medicina, Universidade de Medicina de Teerã não estruturais para formar o complexo de replicase (como pro tease
Ciências, Teerã, Irã
semelhante à 3-quimotripsina (3CLpro), protease semelhante à
2
Imunologia, Asma Allergy Research Institute (IAARI), papaína (PLpro), helicase e RNA RNA polimerase dependente
Universidade de Ciências Médicas de Teerã, Teerã, Irã
(RdRp), nove proteínas acessórias e quatro proteínas estruturais
3
Departamento de Imunologia, Escola de Medicina, Irã (spike (S), membrana (M), envelope (E) e nucleocapsídeo (N)). A
Universidade de Ciências Médicas, Teerã, Irã
proteína spike tem dois segmentos funcionais (S1 e S2) que são
4
Departamento de Biociências Aplicadas e Biotecnologia, ativados por proteases da célula hospedeira (catepsina L e protease
Faculdade de Ciências e Tecnologia, Estado de Midlands
transmembranar serina 2 (TMPRSS2) [4]. No SARS-CoV-2, o
University (MSU), Gweru, Zimbábue
domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína spike se liga à
5
Departamento de Biotecnologia Médica, Faculdade de Medicina,
célula humana
Universidade de Ciências Médicas de Zanjan, Zanjan, Irã

Vol.:(0123456789) 1 3
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Biotecnologia molecular

receptores, Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ACE2), e [10]. Tipos II, V e VI da classe II do CRISPR/
define o tropismo e a patogenicidade do vírus, enquanto a O sistema Cas possui atividade enzimática com um domínio
proteína spike de outros coronavírus humanos pode se ligar a de nuclease semelhante em sua proteína efetora através da
outros receptores de entrada celular, como aminopeptidase N detecção de sequências de DNA ou RNA alvo. No complexo
(APN) e dipeptidil peptidase 4 ( DPP4) também. A mutação no CRISPR/Cas, o RNA CRISPR (crRNA) é responsável pela
RBD aumenta a afinidade de ligação do vírus ao ACE2 humano identificação da sequência alvo (RNA ou DNA) e pode
e, consequentemente, maior transmissibilidade em comparação depender do motivo associado ao protoespaçador (PAM) ou
com SARS-CoV e MERS-CoV [1, 5]. do sítio de fanking do protoespaçador (PFS) baseado nos
A criação de plataformas novas e rápidas em três tipos de CRISPR. Além do crRNA e do complexo Cas, o tipo II
compassos de prevenção, diagnóstico e tratamento de e o tipo VB possuem RNA transativador adicional (tracrRNA)
infecções por vírus são abordagens biotecnológicas notáveis que medeia a ligação entre eles. A sequência de RNA de guia
na pandemia de COVID 19. Portanto, saber mais sobre a único (sgRNA) é projetada quimericamente com cerca de 20
biologia e a patogênese do vírus ajudará no diagnóstico, nos nucleotídeos complementares da sequência alvo, em vez do
regimes de tratamento e no desenho da vacina. Regiões de complexo crRNA-tracrRNA, em laboratório para uso como
sequências de genes RdRP no ORF1ab, gene da proteína do ferramenta biotecnológica. Nesses complexos, os domínios de
envelope (E) e gene da proteína do nucleocapsídeo (N) são nuclease da proteína Cas têm atividade de clivagem, resultando
regiões de hotspot usadas para detecção molecular do vírus SARS-CoV-2 devido àno
em sequências sua
alvo rombas ou salientes [11, 12]. A Tabela
sequências conservadas [2]. O uso de estratégias de 1 resume os três tipos mais aplicados de sistemas CRISPR–
intervenção, como direcionar a via de entrada da célula do Cas classe II [13–16].
vírus, incluindo RBD, bem como o complexo de replicação do
vírus, incluindo RdRp, são alvos críticos no projeto de
plataformas terapêuticas moleculares antivirais [6, 7].
Aplicações dos sistemas CRISPR–Cas
na doença COVID-19
Sistema CRISPR–Cas
Alguns aspectos do sistema CRISPR além da edição do
Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interespaçadas genoma foram considerados por pesquisadores durante este
Agrupadas (CRISPR) e suas proteínas associadas (Cas) são curso da pandemia de COVID-19. Nesta revisão, selecionamos
codificadas por bactérias e archaea como mecanismos de artigos de pesquisa do PubMed e LitCovid para
defesa contra agentes genéticos invasivos, como vírus e Aplicação do sistema CRISPR–Cas no SARS-CoV-2 usando
plasmídeos, através de um processo de três estágios de ''COVID-19 e CRISPR'' como palavras-chave para o período
adaptação, maturação e interferência . 8, 9]. Este sistema de de 2020 e 2021. Retornamos 290 artigos e após a exclusão
dois componentes (array CRISPR e proteína Cas) é classificado de artigos não relacionados, artigos de revisão e pré-impressão,
em classe I e classe II, incluindo diferentes tipos e subtipos ficamos com 86 artigos com foco em diagnóstico, terapêutica
baseados na sequência computacional e análise de proteínas antiviral, modelos pré-clínicos e triagem genômica ampla. A
de suas subunidades efetoras. A descoberta do sistema distribuição percentual das pesquisas de diagnóstico e os
CRISPR revolucionou as abordagens da biotecnologia devido outros artigos de pesquisa categorizados é apresentada por
ao seu reconhecimento de sequência genômica e capacidade meio de um diagrama de pizza na Fig. 1.
de clivagem enzimática para engenharia genética do genoma e além

Tabela 1 Tipos aplicados de sistema CRISPR–Cas classe II

Modelo Subtipos Domínio da nuclease PAM/PFS Atividade de clivagem Formulários

II (Cas9) II-A Domínios HNH e RuvC Motivo rico em G 3' dsDNA atividade de clivagem sem corte Plataformas de diagnóstico
II-B Triagem de todo o genoma
II-C Modelagem de animais

Domínios V (Cas12) VA (Cas12a/Cpf1) RuvC e Nuc Atividade de clivagem de dsDNA de motivo rico em T 5' Plataformas de diagnóstico

Domínio VB (Cas12b/C2c1) RuvC e atividade de clivagem colateral de

ssDNA

VI (Cas13) VI-A (Cas13a/C2c2) 2 domínios HEPN 3' nenhum G PFS ssRNA clivagem saliente Plataformas de diagnóstico

VI-D (Cas13d) Nenhum atividade e atividade de clivagem Terapia antiviral

colateral de ssRNA

Motivo adjacente do protoespaçador PAM , local de fanking do protoespaçador PFS

13
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Biotecnologia molecular
Antiviral
Todo o genoma
terapêutica
triagem 5%
20%
Modelos pré-
clínicos
1%
Diagnóstico
74%
Fig. 1 Diagrama de artigos de pesquisa publicados relacionados a estudos
baseados em CRISPR para COVID-19
Ensaios de diagnóstico baseados em CRISPR
Para a maioria dos ensaios de diagnóstico molecular in vitro de
agentes infecciosos, como vírus, o ácido nucleico alvo deve
primeiro ser amplificado. Amplifcações baseadas em termociclagem,
ou seja, reação em cadeia da polimerase (PCR) e métodos de
PCR em tempo real, são as técnicas padrão-ouro. Além disso,
métodos de amplificação baseados em isotérmicos, ou seja,
amplificação isotermal mediada por loop (LAMP) e amplificação
da polimerase recombinase (RPA), são outros testes rápidos de
amplificação de ácido nucleico disponíveis. Parâmetros como
sensibilidade, especificidade, eficiência, precisão, simplicidade,
custo e, principalmente, neste caso, a velocidade de reação são
critérios signifcativos para a criação de uma plataforma de
diagnóstico molecular adequada para identificação de agentes [17,
18]. O objetivo de projetar plataformas de diagnóstico é receber
métodos point-of-care (POC), considerando a detecção com o
mínimo de ferramentas e até mesmo ao ar livre, longe do
laboratório. Portanto, a detecção simultânea de vários agentes no base única em amostras de pacientes [31].
Os métodos
menor tempo está mudando a abordagem de métodos de rotina para novos métodosde[19,
detecção
Uma das novas aplicações do sistema CRISPR–Cas, além da
edição do genoma, é o diagnóstico de doenças infecciosas e não
infecciosas. Desde 2017, plataformas de diagnóstico baseadas
em CRISPR (CRISPR-DX) baseadas na detecção de ácidos
nucleicos foram desenvolvidas. O projeto das plataformas CRISPR-
DX foi capaz de considerar a maioria dos parâmetros necessários,
incorporando outros métodos de amplificação e detecção para
desenvolver sistemas ótimos com alto desempenho [21]. Até o
momento, há uma necessidade urgente de desenvolver novos
métodos de detecção de POC na condição emergente da pandemia
de COVID-19. Em 2020, os sistemas de detecção baseados em
CRISPR para SARS-CoV-2 conseguiram receber a aprovação de
autorização de uso emergencial (EUA) da Food and Drug
Administration (FDA) dos EUA [22].
Devido à estrutura do sistema CRISPR–Cas, o projeto de
diferentes e inovadoras ferramentas de diagnóstico baseadas em
CRISPR geralmente considera a diversidade de classes e tipos de
nucleases de Cas. A subunidade Cas com suas propriedades de
atividade enzimática de RNase junto com crRNA pode identificar
o DNA ou RNA alvo e fazer a clivagem [23]. As classes mais
importantes desta enzima, aplicáveis na detecção, são a classe II
(tipos II/Cas9, V/Cas12a/b e VI/Cas13), com sensibilidade
attomolar para detecção de vírus de RNA ou DNA. Normalmente,
o uso de cada tipo de proteína Cas para detecção do genoma do
vírus deve ser combinado com métodos de amplificação,
especialmente métodos isotéricos, para melhorar a sequência da
amostra alvo. Então, através do complexo crRNA e Cas, a
sequência alvo pode ser identificada com mais precisão com
leitura baseada em fuorescente visual ou ensaio de fluxo lateral
(LFA) na etapa de detecção final [10, 24]. Em casos com baixo
número de cópias de RNA viral, é difícil interpretar por detecção
visual. Por outro lado, existe uma correlação entre os sinais LFA e
os valores de Ct nos resultados da PCR em Tempo Real. Assim,
os resultados visuais podem ser semiquantificados por meio de
ferramentas de aprendizado de máquina para aumentar a
sensibilidade analítica. Houve esforços para usar aplicativos de
smartphones para detecção e quantificação de plataformas POC
SARS-CoV-2 CRISPR-DX por imagem [25]. Em leituras baseadas
em fuorescente usando laser de diodo [26], captura de imagem
por aplicativo de smartphone companheiro [27] e instrumento de
impressão 3D para ajudar na detecção de smartphones [28] são usados para des
Para detectar o vírus SARS-CoV-2, diferentes plataformas
baseadas em CRISPR estão usando as diversas enzimas Cas
nuclease listadas na Tabela 2. A proteína endonuclease Cas9 em
combinação com gRNA tem como alvo a sequência dsDNA. Uma
das vantagens de usar o tipo Cas9 é a capacidade de identificar
polimorfismos de nucleotídeo único que são úteis para genotipagem
de vírus, bem como mutações de genes de baixa frequência [29,
30]. Esse tipo de capacidade permitiu que o Cas9 de Campylobacter
jejuni NCTC11168 (CjeCas9) fosse usado para distinguir o SARS-
CoV-2 e sua variante D614G (Asp614 ÿ Gly) com resolução de
20]. eletroquímica sem amplificação são
baseados na afinidade de ligação entre o dCas9 (atividade morta
Cas9) e o genoma viral em chips FET baseados em grafeno, que
também têm potencial para detecção de SARS-CoV-2 [32].
A primeira plataforma de diagnóstico a ser projetada com base
no Cas12 foi um repórter trans CRISPR direcionado à endonuclease
(DETECTR) para a detecção de HPV em amostras de pacientes
humanos. Nesta plataforma, o complexo crRNA-Cas12a foi usado
para ligar e clivar a sequência do genoma do vírus amplificado. A
clivagem colateral de uma sequência curta de ssDNA não
específica, que é um supressor de fuoróforo (FQ) marcado como
repórter, foi usada para visualizar essa ligação por emissão de luz
[52]. A plataforma DETECTR foi redesenhada para detecção de
SARS-CoV-2 a partir do RNA extraído de um
13
 13
Tipo
V
(Cas12)
Cas12a
(Cpf1) Tipo
II(Cas9)
Cas9/
D10A
com modelo CRISPR–
Cas Tabela
2
Notáveis
plataformas
de
diagnóstico
baseadas
em
CRISPR–
Cas
para
SARS-
CoV-2
projetadas
em
2020
e
2021
Campylobacter Francisella
novicidae
NCTC11168
jejuni
(CjeCas9) Cas9 atividade
de
nickase
CRISPR-
Cas12a Específico
in
vitro fuo
baseado
em
CRISPR DNA
endonuclease Aproveitando
a
engenharia CRISPR/
Cas9- Troca
de
primer
matriz
CRISPR Nome
da
técnica
NER) (CRISPR-
Cas12a leitura
a
olho
nu Ensaio
para
detecção
de
ácido
nucleico
(iSCAN) Baseado
em
CRISPR CRISPR-
FDS) 19
(sistema
de
diagnóstico
recente
de
COVID-19
para
COVID (DETECTOR) repórter
trans
visado
CRISPR (LEOPARDO) Detecção
de
RNA DNAs
para
paralelo tracrRNAs
necessários
e
no
alvo (TL-
LFA) ensaio
de
fluxo
lateral
de
linha
tripla
mediado cascatas
de
circuitos
bioquímicos
baseados
em
reações mediado
RT-
RAA LÂMPADA
RT RT-
RPA RT-
LÂMPADA RT-
PCR
ou
livre RT-
RPA POR Método
de
amplificação Métodos
de
atendimento
amplificação
Baseado
em
fluorescência Fluxo
lateral
e Baseado
em
fluorescência Fluxo
lateral
visual Gel
de
poliacrilamida Fluxo
lateral
visual Eletroquímico Método
de
detecção
detecção detecção
baseada
em
fuorescência microtitulação
de
96
poços
e
adaptável
ao
formato
de
chip
leitura
de
smartphone
detecção
em
placa
de Leia Bioanalisador eletroforese
ou Leia biossensor
orf1a,
orf1b
núcleo Nucleocapsídeo
(N) Nucleocapsídeo
(N) Nucleocapsídeo
(N) Espigões) Duplo
simultâneo Nucleocapsídeo
(N) Genes
alvo
ocapsídeo
(N)
e
envelope
(E) e
envelope
(E) e
envelope
(E) e
envelope
(E) genes;
envelope
(E)
e
Orf1ab
2
cópias
por
µl
de 10
cópias
por
µl
de
uma
cópia,
ou
1,7
aM 5
nM
para
sintetizado (LOD) Limite
de
detecção
10
cópias
por
µl
de
entrada
Três
etapas
dentro 10
cópias
por
µl
de 100
cópias
de
RNA
por
Amostras
de
swab
nasofaríngeo amostras
de
zaragatoas
nasais amostras
de
swab
nasofaríngeo cópias,
ou
0,6
nM
na
diluição
original,
sem
pré-
amplificação diluição
original,
de
RNA
comparado
com
3×108
na reação
(25
ÿl) Genoma
SARS-
CoV-2
no
lisado
de
células
humanas
Um
e
dois
passos Três
passos
dentro Três
passos
dentro não
especificado Duas
etapas
a
37
°C Três
passos
(CRISPR Tempo
de
duração
60
minutos a
62
°C
em
60
min 50
minutos 30-40
minutos dentro
de
40
minutos reagente,
reagente
PER
e
detecção)
dentro
de
110
min
Referências
[39] [38] [36,
37] [35] [31] [34] [33]
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13
modelo CRISPR–
Cas Tabela
2
(continuação)
Cas12b
(C2c1)
Teste
SHERLOCK Assistido
por
CRISPR CRISPR
(DWS Partida
a
quente
digital Isota
microfúdica Tudo-
em-
um
duplo Visual
de
um
pote APRIMORAR
o
sistema
RT-
LAMP Enriquecido
com
manganês Potencializador
específico Nome
da
técnica
em
um
pote
(STOP) detecção
(detecção
CAS) CRISPR) Baseado
em
CRISPR Choforese
(ITP)- (AIOD-
CRISPR) CRISPR-
Cas12a denominado
(opvCRISPR)
Sistema
de
detecção
SARS-
CoV-2 (MeCas12a) Detecção
Cas12a (SENA) Ácido
nucleico para
PCR
amplificado
LÂMPADA
RT RT-
RAA RT-
DAMP LÂMPADA
RT RT-
RPA LÂMPADA
RT RT-
RAA rRT-
PCR Método
de
amplificação Métodos
de
atendimento
Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Baseado
em
fluorescência Método
de
detecção
ensaio
ede
fluxo
lateral ensaio ensaio ensaio ensaio ensaio ensaio
ede
fluxo
lateral detecção detecção
Nucleocapsídeo
(N) RdRp Nucleocapsídeo
(N) Nucleocapsídeo
(N) Nucleocapsídeo
(N) Espigões) Nucleocapsídeo
(N) Envelope
(E) Orf1ab
(O)
e Genes
alvo
e
envelope
(E) nucleocapsídeo
(N)
10
cópias
por
µl
de
5
cópias/
µl
de
RNA
em 5
cópias
por
µl 5
cópias
por
µl 5
cópias
com
Mn2+
3–
300
cópias
por
µl
Três
etapas
dentro (LOD) Limite
de
detecção
100
cópias/
reação
Amplifca
de
um
passo 10
cópias
por
µl 1,6
cópias
por
µl
de
o
chip
sensibilidade
dez
vezes
maior
do
que
o
formato
de
ensaio
em
massa
baseado
em
tubo Amostras
de
swab
nasofaríngeo comparado
a
10
cópias
com
Mg2+ swabs
de
faringe
e
nasofaringe
com
95%
de
confiança
uma
etapa
a
42
°C Um
passo
em
Quant Dentro
de
30
minutos Amplificador
de
um
passo Três
passos
dentro Três
passos
dentro Três
passos
dentro Tempo
de
duração
ção
e
detecção
a
60°C
em
45
min dentro
de
60
minutos Chip
digital
Studio
3D
iniciando
acima
de
50
°C à
temperatura
ambiente
(37
°C)
dentro
de
20
min ção
e
detecção 45
minutos 40-60
minutos 45
minutos Tempo
de
detecção
CRISPR tempo
de
rRT-
PCR
e
Referências
[48] [47] [46] [45] [44] [43] [42] [41] [40]
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 13
Reação
de
troca
primer
PER
amplificação
isotérmica
mediada
por
laço
LAMP
transcrição
de
RNA
rLAMP
após
LAMP,
amplificação
auxiliada
por
recombinase
RAA
amplificação
isotérmica
de
recombinase
RPA
amplificações
isotérmicas
de
iniciação
dupla
DAMP
, ,, Tipo
VI
(Cas13)
Cas13a
(C2c2) modelo CRISPR–
Cas Tabela
2
(continuação)
Cas13
assistido Alta
simplificada Combinatório High-
sen
específico Nome
da
técnica
(CASSPIT) e
teste
integrado
de
smartphone à
base
de
saliva iluminação
de
infecções
para
navegar
epidemias
(SHINE) (CARMEN-
Cas13) reações
em
matriz
para
avaliação
multiplexada
de
ácidos
nucleicos (SHERLOCK) Desbloqueio
de
repórter atividade
Enzimática
RT-
RPA
e
T7 RT-
RPA
e
T7 PCR
ou
RT-
RPA RT-
RPA
e
T7 Método
de
amplificação Métodos
de
atendimento
transcrição transcrição transcrição
Ensaio
de
fluxo
lateral Baseado
em
fluorescência Fluorescência Baseado
em
fluorescência Método
de
detecção
integrado
com
um
aplicativo
de
smartphone ensaio
ede
fluxo
lateral ensaio
baseado
usando
misturas
de
sequências
amplificadas
codificadas
por
cores ensaio
ede
fluxo
lateral
S
e
Orf1ab ORF1a Espiga
(S),
nucleopro
espiga
(S),
nucleopro Genes
alvo
(Orf1ab) teína
(N)
replicase
poliproteína
1ab (Orf1ab) teína
(N)
replicase
poliproteína
1ab
200
cópias/
reação 42
cópias
de
RNA
por (LOD) Limite
de
detecção
10
cópias
por
µl
com 104
cópias
por
µl
para
correspondente
de
35,4
para
o
gene
S
com
um
valor
Ct alvos
sintéticos reação
do
swab
naso-
faríngeo
100%
de
especificidade
Duas
etapas
de
aquecimento
duplo Um
passo Três
passos Três
passos
dentro Tempo
de
duração
inativação
(37
°C
por
10
min
e
95
°C
por
5
min) 60
minutos
Referências
[25] [27] [50,
51] [26,
49]
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Biotecnologia molecular

Etapa I: Amplificação

Reverte a transcrição e
amplificação isotérmica

RPA
LÂMPADA

Amostra nasofaríngea Inativação do Extração de RAA

coleção SARS-CoV-2 RNA SARS-CoV-2
DNA amplificado para o gene alvo

Transcrição T7
Baseado em detecção de Cas9 Baseado em detecção de Cas12 Baseado em detecção Cas13

Biotinilado ADN RNA

ADN

Cas12-crRNA Complexo Cas13- repórteres ssRNA

repórteres ssDNA
Cas9 e tracrRNA crRNA
complexo
marcado
com FAM
complexo

Ligando-se ao DNA alvo e

ativando Ligando-se ao RNA alvo e
atividade de clivagem ativando
colateral atividade de clivagem
colateral

Vinculação ao destino
biotinilado amplificado
ADN Repórteres clivados
Repórteres clivados

ensaio de fluxo lateral ensaio de fluxo lateral OU ensaio baseado em fluorescência

Luz azul

anti-FAM
Clivado
anticorpo
Biotina-FAM
repórter Clivado
Quencher
Emissão
Fluoróforo
Banda positiva
fluorescente
Fluxo de amostra Banda de controle Anti Banda de controle Anti banda positiva repórter
Fluxo de amostra
estreptavidina anticorpo de coelho estreptavidina Anticorpo FAM revestido
revestido revestido revestido

Fig. 2 Uma visão geral dos ensaios de diagnóstico baseados em CRISPR extração de RNA do SARS-CoV-2, passam por três etapas e podem ser
com três tipos de enzimas Cas; Detecções Cas9, Cas12 e Cas13 com visualizados através do ensaio de fluxo lateral ou ensaio baseado em
nomes de FELUDA, DETECTR e SHERLOCK, respectivamente, após fuorescência

swab respiratório, por ensaio de fluxo lateral. A colaboração deste
método com a amplificação isotermal mediada por transcriptase
reversa (RT-LAMP) para converter e amplificar vírus de RNA em
DNA aumentou efetivamente a eficiência de detecção [35]. As
vantagens deste método são a independência e rapidez dos
instrumentos de laboratório, juntamente com precisão e especificidade
aceitáveis [28, 53]. Outras plataformas semelhantes ao DETECTR
para COVID-19 estão listadas na Tabela 2.
O pioneiro do sistema CRISPR-DX é o Specifc High Sensitive
Enzymatic Reporter unlocking (SHERLOCK) que usa o tipo VI/
Cas13 para detecção [54]. Esta plataforma foi projetada para
detectar patógenos, incluindo vírus, em
combinação com amplificação de polimerase transcriptase-
recombinase reversa (RT-RPA) e transcrição de T7 para aumentar
a precisão da detecção usando um repórter de ssRNA fuorescente
extinto adequado para leitura de fluxo visual ou lateral [55]. Esta
plataforma foi bem sucedida no diagnóstico do vírus SARS-CoV-2
durante a sua pandemia. É a primeira plataforma baseada em
CRISPR a ser utilizada em amostras clínicas com aprovação US
FDA-EUA e apresenta resultados aceitáveis em comparação com
outros métodos diagnósticos, como sequenciamento de próxima
geração (NGS) e RT-PCR (q-PCR ) [22, 49, 56].
Discriminação do SARS-CoV-2 selvagem e mutante, como a
mutação D614G com Cas13a-gRNA e Cas12a-gRNA

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Biotecnologia molecular

a Uma visão geral da terapia antiviral para SARS-CoV-2 com sistema baseado em CRISPR

Expresso Cas13-
Infecção por SARS-CoV-2
complexo de crRNA

Entrega local para

células das vias aéreas

SARS-CoV-2

Biblioteca do Cas13- Genoma de RNA ou mRNA

AAV
crRNA em AAV
biblioteca
vetor de transferência para

SARS-CoV-2

genômica conservada Genoma viral Bloqueando o genoma viral

regiões degradação expressão

Célula das vias aéreas infectada por SARS-CoV-2

b Uma visão geral da produção de modelos animais pré-clínicos através do sistema CRISPR-Cas9

Modelo humano ACE2

Humano ACE2
mACE2
Microinjeção no zigoto Humano exprimível
promotor Zigoto manipulado

promotor mACE2
inexprimível

Ex on-2 mouse ACE2 ACE2

Intranasal

inoculação de

Complexo CRISPR-Cas9 SARS-CoV-2

Infeccioso grave

Modelo de camundongo ACE2 humanizado Intranasal

inoculação de

SARS-CoV-2

Não infeccioso

Rato tipo selvagem com mACE2

c Uma visão geral da triagem de todo o genoma CRISPR

População resistente a vírus genes pró-virais

Sequenciamento

e análise de dados

sgRNA

Transdução de biblioteca

Todo o genoma CRISPR

ACE2 positivo genes antivirais

linha celular visando a biblioteca Suprimir

lentiviral CRISPR de células

sgRNAs selecionados
Sequenciamento e

análise de dados

sgRNA

Plataformas baseadas em CRISPR, são valiosas para o plataformas para detecção de vírus SARS-CoV-2 estão listadas na
monitoramento de análises epidemiológicas e podem melhorar a Tabela 2. A Figura 2 mostra as etapas dos três tipos disponíveis de
capacidade dos testes POC [57, 58]. Outros notáveis baseados em CRISPR–Cas13
plataformas CRISPR-DX.

13
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Biotecnologia molecular
ÿ Fig. 3 um complexo Cas13-crRNA através de sistemas de entrega variável
(como o método de entrega de AAV) pode direcionar genes de vírus (como
genes ORF1ab, RdRp, S e N) para degradar o genoma viral e bloquear a
expressão do genoma do vírus. b Produção de modelo de camundongo ACE2
humanizado através da microinjeção de complexo CRISPR-Cas9 e sequência
de modelo de ACE2 humano em zigoto de camundongo para substituir o gene
ACE2 de camundongo e expressar no pulmão, intestino e cérebro de um
camundongo sob seu promotor. Este modelo humanizado é comparado com
um camundongo do tipo selvagem em condições infecciosas por SARS-CoV-2.
c A triagem de todo o genoma CRISPR agrupada ou agrupada é feita para
análise de agrupamentos de genes de primeira linha na via de infecção por vírus em células hospedeiras.
Nessa direção, o design da biblioteca de sgRNA para direcionar o gene da
célula hospedeira candidata para a produção de células nocauteadas e o
desafio com o vírus SARS-CoV-2 são feitos para determinar os genes antivirais
e pró-virais de células sensíveis e resistentes
Terapêutica Baseada em CRISPR
As terapias convencionais para o tratamento de doenças virais geralmente
se baseiam na prevenção de infecções virais por meio do direcionamento
de biomoléculas na via de entrada até a proliferação.
No surgimento dos vírus, o primeiro passo na terapia antiviral é o
reaproveitamento de medicamentos para uso dos medicamentos existentes
em benefício do tratamento no menor tempo possível. A segunda
abordagem poderia ser o design de drogas baseado em alvos, concentrando-
se na genômica e proteômica do vírus desejado [59, 60]. Com base nessas
duas abordagens, os candidatos a medicamentos para o tratamento do
vírus SARS-CoV-2 infeccioso geralmente se concentram na interrupção da
função enzimática do vírus (especialmente RNA polimerase dependente de
RNA), prevenção da endocitose do vírus, bloqueio de proteínas virais
(envelope, membrana, nucleocapsídeo e proteínas acessórias), ajudando
a imunidade inata ou suprimindo a resposta inflamatória excessiva e
prevenção da replicação do SARS-CoV-2 [61]. Por outro lado, vírus que
apresentam novas mutações e causam pandemias geralmente não
respondem a medicamentos e vacinas antigas. Essas limitações no
tratamento e prevenção do COVID-19 podem ser aplicadas a outros vírus
da mesma família, como SARS e MERS. Portanto, nessas condições, há
uma necessidade urgente de novas terapias baseadas no direcionamento
das sequências genômicas do vírus. A interrupção da função gênica na
terapia antiviral incorpora ferramentas biotecnológicas, como o siRNA ou o
sistema CRISPR–Cas. Uma das aplicações bem conhecidas do sistema
CRISPR–Cas é a possibilidade de identificar a sequência de DNA ou RNA
do vírus para cortá-los e destruir sua função [62].
Estudos relacionados sugeriram o CRISPR como um candidato aceitável
para direcionar patógenos humanos, como HIV, vírus da hepatite B (HBV),
herpesvírus, papilomavírus humano (HPV) e vírus JC (JCV) [63]. A Cas9 e
Cas13 como subunidades de enzimas endonucleases no sistema CRISPR
podem identificar o DNA e o RNA de vírus em células de mamíferos
infectados. Estudos mostraram que Cas9 tem um menor
eficácia de clivagem para ssRNA e também a capacidade de criar
de alvos na sequência de DNA de células hospedeiras infectadas por vírus
[15, 64]. O sistema CRISPR-Cas13 não depende da detecção de PAM e o
crRNA tem como alvo sequências de codificação de ssRNA do vírus sem
interferir com o transcriptoma humano, causando degradação da sequência,
interrompendo a expressão gênica e, eventualmente, bloqueando a função
viral [65]. Portanto, o uso do CRISPR–Cas13 é superior ao CRISPR–Cas9
como um sistema de inibição programável antiviral.
O CRISPR antiviral profilático em células humanas (PAC MAN), pode
efetivamente identificar e degradar a sequência do vírus e seus mutantes
nas células epiteliais do pulmão humano. O sistema PAC-MAN usa o
sistema classe 2, tipo VI-D, CRISPR–Cas13d derivado de Ruminococcus
fa vefaciens XPD3002. O PAC-MAN identifica simultaneamente mais de
90% de todos os coronavírus usando uma combinação de 6 crRNAs,
identificando regiões protegidas (como genes ORF1ab, RdRp e N), bem
como detectando ssRNA do vírus em suas fases de replicação e transcrição
[66]. O conjunto abrangente de métodos de bioinformática para receber
candidatos ótimos de crRNA in silico pode melhorar a eficiência dos testes
laboratoriais para combater o SARS-CoV-2 em menos tempo [67]. Além do
design in silico e testes de linha celular humana, o uso de modelos animais
melhorará os estudos pré-clínicos com a simulação de infecções respiratórias
in vivo e ajudará a rastrear a segurança e a eficácia das plataformas
baseadas em CRISPR para abordagens antivirais [68]. As vantagens dos
sistemas antivirais baseados em CRISPR são alta fexibilidade na
identificação de sequências virais, velocidade de detecção e direta contra o
vírus [65, 66]. O vetor de expressão Cas13d pode ser transmitido através
do vírus adeno-associado
sistema de empacotamento (método de entrega AAV) com alto tropismo
para tecidos respiratórios e expresso sob a indução de promotores de
expressão em tecidos específicos, especialmente células das vias aéreas
[65]. A base do sistema antiviral baseado em CRISPR para SARS-CoV-2
está representada na Fig. 3a.
CRISPR em pesquisas pré-clínicas
Pesquisas pré-clínicas relacionadas ao COVID-19 exigem modelo animal
adequado que possa ser infectado com o SARS
vírus CoV-2 e, posteriormente, acessar doenças leves a graves. Como
nas células humanas, as células-alvo no animal selecionado devem possuir
ACE2 como receptor de ligação ao SARS-CoV-2 para permitir a entrada
das células do vírus. Animais como hamsters, furões, macacos verdes
africanos, cinomolgos e macacos rhesus têm receptores ACE2 humanos
semelhantes. Para pesquisas extensas, o melhor candidato são os
camundongos devido à redução de custos e ao aumento do número de
animais, mas o ACE2 de camundongo tem afinidade de ligação muito
menor para a proteína do pico viral, em comparação com sua contraparte
humana.
Esta afinidade de baixa ligação desenvolverá uma doença leve em modelos
de camundongos que não é adequado para estudos de múltiplos aspectos
13
 13
Biossíntese
de
colesterol GlicosilfosfatidilinositolSinalização
SREBP Biossíntese
de
glicosaminoglicanos Regulação
de
RNA Sinalização
celular Modificação
de
histonas Remodelação
da
cromatina Ciclo
de
replicação Biossíntese
de
colesterol de
Rab-
GTPase
GlicosilfosfatidilinositolRequisitos Via
de
biossíntese
do
colesterol Caminhos
e
processos
selecionados Tabela
3
Telas
CRISPR
em
todo
o
genoma
de
vias
eprocessos
envolvidos
na
infecção
por
SARS-
CoV-2
biossíntese biossíntese
ancorada bomba
de
prótons
ATPase,
retromer
ecomplexos
Commander) (parte
da
via
de
entrada
endossomal
do
vacuolar
Células
de
hepatoma
Huh-7.5
(Huh-7.5- VeroE6 Huh
7,5 A549 Huh-7.5-
Cas9 HAP1 A549 Linha
celular
rastreada
Cas9)
RAB10 RAB6A PMVK MVK HMGCS1 ACE2 VAC14 TMEM41B TMEM106B SCAP PIAS2 BPTF TRIP12 CABINE1 HIRA HMGB1 KDM6A DYRK1A SMARCA4 ACE2 CTSL KDM6A DYRK1A ARID1A TMEM41B RAB14 RAB10 RAB2A EIF4E2 HS2ST1 SREBP/
SCAP PIK3C3 CCDC22 RAB7A NPC1 ATP6V1A ATP6AP1 Genes
resistentes Clusters
de
genes
mais
bem
classificados
no
caminho
TARDBP MRPS27 MRPS25 MRPS5 MRPS2 Sensibilizar
genes
Exigência
absoluta
de RNA-
RNA
viral
e
RNA-
pro SARS-
CoV-2
requer
TMEM41B SCAP
regula
lipídios
ecoles Perda
de
genes
resistentes,
como Destaques
SARS-
CoV-2 TMEM41B
para
infecção
por Proteína
contendo
domínio
VTT A
linhagem
SARS-
CoV-2
HMGB1
é
fundamental
para
a
entrada
viral
da
linhagem
SARS
com
papel
crítico
na
expressão
de
ACE2 mitocondrial
mediada
por
SARS-
CoV-2
Adurante
a
infecção
genes
evias
pró-
virais,
incluindo
HMGB1,
e
o
complexo
de
remodelação
de
estanho
croma
SWI/
SNF
são
disfunção interações
tein
revelam para
ciclos
de
replicação
na
célula homeostase
do
terol
sequestrando
SREBPs
no
RE
na
presença
de
esteróis RAB7A
reduz
a
entrada
viral
sequestrando
o
receptor
ACE2
dentro
da
célula
Nenhum SIS3,
que
tem
como
alvo
o
pró-
viral PFI-3,
que
tem
como
alvo
o
bromodo Nenhum 27-
Hidroxicolesterol
(27OHC) Molécula
de
Fatostatina
como
SCAP Sequenciamento
de
RNA
de
células
tratadas Pequena
molécula
semelhante
tela gene
SMAD3
identificado
no SMARCA4
e
SMARCA2 principal
das
proteínas
SWI/
SNF e
25OHC
têm
atividade
antiviral
SARS-
CoV-2
em
células
VeroE6 inibidores
mostra
propriedades
antivirais com
amlodipina
pequena
molécula
mostra
um
perfil
de
expressão
gênica
diferencial
semelhante
ao
observado
em
CRISPR
knock-
out
de
genes
na
via
de
biossíntese
colesterol
Referências
[86] [80,
81] [85] [83] [84]
Biotecnologia molecular
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Ciclo
de
replicação Biossíntese
de
colesterol de
Rab-
GTPase
Glicosilfosfatidilinositol Requisitos Via
de
biossíntese
do
colesterol Biossíntese
de
N-
glicano Biossíntese
de
O-
glicano Heparan
sulfato
biossintético Homeostase
do
colesterol Fosfatidilinositol
Fosfato Caminhos
e
processos
selecionados Tabela
3
(continuação)
biossíntese
ancorada bomba
de
prótons
ATPase,
retromer
ecomplexos
Commander) (parte
da
via
de
entrada
endossomal
do
vacuolar genes biossíntese
A549 Huh-7.5-
Cas9 HAP1 A549 HEK293T células
de
hepatoma
Huh7.5.1 Linha
celular
rastreada
TMEM41B RAB14 RAB10 RAB2A EIF4E2 HS2ST1 SREBP/
SCAP PIK3C3 CCDC22 RAB7A NPC1 ATP6V1A ATP6AP1 MGAT1 C1GalT1 SREBP/
SCAP XYLT2 UGDH SLC35B2 NDST1 FAM20B EXTL3 EXT2 B4GALT7
EXT1 B3GAT3 B3GALT6 TMEM106B Genes
resistentes Clusters
de
genes
mais
bem
classificados
no
caminho
MRPS27 MRPS25 MRPS5 MRPS2 Sensibilizar
genes
SARS-
CoV-2
requer
TMEM41B SCAP
regula
lipídios
ecoles Perda
de
genes
resistentes,
como Biossina
de
N-
glicano
nocauteador Exclusões
em
TMEM106B
causaram Destaques
para
ciclos
de
replicação
na
célula homeostase
do
terol
sequestrando
SREBPs
no
RE
na
presença
de
esteróis RAB7A
reduz
a
entrada
viral
sequestrando
o
receptor
ACE2
dentro
da
célula tese
sobre
entrada
viral
revogada
por
Spike defeitos
no
tráfego
de
lisossomos,
acidificação
prejudicada
e
níveis
reduzidos
de
enzimas
lisossomais,
mas
sua
função
molecular
precisa
permanece
enigmática
Nenhum Molécula
de
Fatostatina
como
SCAP
27-
hidroxicolesterol
(27OHC) Sequenciamento
de
RNA
de
células
tratadas Molécula
pequena
de
kifunensina Nenhum Pequena
molécula
semelhante
e
25OHC
têm
atividade
antiviral
SARS-
CoV-2
em
células
VeroE6 inibidores
mostra
propriedades
antivirais com
amlodipina
pequena
molécula
mostra
um
perfil
de
expressão
gênica
diferencial
semelhante
ao
observado
em
CRISPR
knock-
out
de
genes
na
via
de
biossíntese
colesterol inibe
a
glicosilação
ligada
a
Npara
reduzir
aentrada
viral
Referências
[85] [83] [84] [89] [87,
88]
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Biossíntese
de
N-
glicano Biossíntese
de
O-
glicano Heparan
sulfato
biossintético Homeostase
do
colesterol Fosfatidilinositol
Fosfato Biossíntese
de
colesterol GlicosilfosfatidilinositolSinalização
SREBP Biossíntese
de
glicosaminoglicanos Regulação
de
RNA Sinalização
celular Modificação
de
histonas Remodelação
da
cromatina Caminhos
e
processos
selecionados Tabela
3
(continuação)
genes biossíntese biossíntese
HEK293T células
de
hepatoma
Huh7.5.1 Células
de
hepatoma
Huh-7.5
(Huh-7.5- VeroE6 Huh
7,5 Linha
celular
rastreada
Cas9)
MGAT1 C1GalT1 SREBP/
SCAP XYLT2 UGDH SLC35B2 NDST1 FAM20B EXTL3 EXT2 B4GALT7
EXT1 B3GAT3 B3GALT6 TMEM106B RAB10 RAB6A PMVK MVK HMGCS1 ACE2 VAC14 TMEM41B TMEM106B SCAP PIAS2 BPTF TRIP12 CABINE1 HIRA HMGB1 KDM6A DYRK1A SMARCA4 ACE2 CTSL KDM6A DYRK1A ARID1A Genes
resistentes Clusters
de
genes
mais
bem
classificados
no
caminho
TARDBP Sensibilizar
genes
Biossina
de
N-
glicano
nocauteador Exclusões
em
TMEM106B
causaram Exigência
absoluta
de RNA-
RNA
viral
e
RNA-
pro Destaques
tese
sobre
entrada
viral
revogada
por
Spike defeitos
no
tráfego
de
lisossomos,
acidificação
prejudicada
e
níveis
reduzidos
de
enzimas
lisossomais,
mas
sua
função
molecular
precisa
permanece
enigmática SARS-
CoV-2 TMEM41B
para
infecção
por Proteína
contendo
domínio
VTT A
linhagem
SARS-
CoV-2
HMGB1
é
fundamental
para
a
entrada
viral
da
linhagem
SARS
com
papel
crítico
na
expressão
de
ACE2 mitocondrial
mediada
por
SARS-
CoV-2
Adurante
a
infecção
genes
evias
pró-
virais,
incluindo
HMGB1,
e
o
complexo
de
remodelação
de
estanho
croma
SWI/
SNF
são
disfunção interações
tein
revelam
Molécula
pequena
de
kifunensina Nenhum Nenhum SIS3,
que
tem
como
alvo
o
pró-
viral PFI-3,
que
tem
como
alvo
o
bromodo Pequena
molécula
semelhante
inibe
a
glicosilação
ligada
a
Npara
reduzir
aentrada
viral tela gene
SMAD3
identificado
no SMARCA4
e
SMARCA2 principal
das
proteínas
SWI/
SNF
Referências
[89] [87,
88] [86] [80,
81]
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Biotecnologia molecular
[69, 70]. A aplicação de camundongos transgênicos pode resolver esse
problema inserindo o gene do receptor ACE2 humano no genoma do
embrião de camundongo de uma maneira projetada que passará para a
próxima geração. Nesse caso, camundongos incorporados a ACE2
humanizados serão mais sensíveis à infecção por SARS-CoV-2 por meio
de inoculação intranasal. Notavelmente, os resultados patológicos e os
danos pulmonares subsequentes serão semelhantes à infecção humana
[71]. Além das técnicas baseadas em biotecnologia usadas para produzir
camundongos transgênicos, a tecnologia CRISPR também pode inserir
o gene alvo no genoma do camundongo pelo processo knock-in. Para
estudos pré-clínicos COVID-19, a tecnologia knock-in CRISPR-Cas9
pode ajudar na expressão do receptor ACE2 humano em vários tecidos
de camundongos. Camundongos humanizados são sensibilizados para
inoculação intranasal de SARS-CoV-2 e inoculação intragástrica [72],
que é representada na Fig. 3b. A produção de camundongos humanizados
facilitou a pesquisa terapêutica antiviral, o desenvolvimento de vacinas,
o estudo da transmissão e patogênese do vírus e a triagem de sintomas
graves no COVID-19.
Triagem de todo o genoma por CRISPR
Estudos funcionais de genes via mutagênese condicional em células de
mamíferos têm sido considerados há décadas. Ferramentas de
engenharia de genoma, como Cre-recombinase, RNAi e nucleases
projetadas, como ZFN e TALENs, foram usadas para encaminhar triagem
genética até 2012. A descoberta do sistema CRISPR–Cas como um
novo método biotecnológico de geração de nucleases projetadas é um
técnica alternativa para superar as limitações. Uma das vantagens da
triagem CRISPR em todo o genoma é o projeto de bibliotecas de sgRNA
para direcionar milhares de genes simultaneamente para triagem
agrupada ou em matriz e identificar diretamente os candidatos do
fenótipo desejado [73, 74]. Além da mutagênese em todo o genoma
através da abordagem de knock-out CRISPR, este sistema é uma
ferramenta adequada para inserção e exclusão dos genes alvo. Além
disso, a edição de base direcionada ao local e a regulação de genes
para cima/para baixo por meio de fatores de transcrição específicos de
genes podem ser feitas com as novas modificações do CRISPR
sistema. CRISPRing forneceu uma oportunidade para entender a
biologia de células de mamíferos relacionadas a doenças, como câncer
e patógenos infecciosos, incluindo vírus, e projetar os estudos
farmacológicos através da criação de bibliotecas de células mutantes
direcionadas [75, 76].
Normalmente, os genes do hospedeiro que coordenam os processos
de entrada e patogênese do vírus são desconhecidos. A identificação
dos principais genes do hospedeiro na via de infecção, regulação ou
supressão viral pode fornecer uma melhor compreensão da função do
vírus na célula hospedeira e pode ajudar a encontrar novas marcas
terapêuticas potenciais, como drogas antagonistas, e projetar uma vacina
apropriada. Todos esses estudos no
linhagens de células hospedeiras podem ser feitas por triagem de
mutagênese em todo o genoma CRISPR-Cas9. Recentemente, a triagem
de Norovi ruses, vírus Zika, vírus do Nilo Ocidental e HIV em linhagens
de células hospedeiras foi realizada por CRISPRing [77-79].
A necessidade de identificar a patogênese da pandemia do vírus
SARS CoV-2, novos estudos de triagem são estendidos para revelar a
entrada viral e a patogênese dos genes do hospedeiro por meio de
bibliotecas CRISPR agrupadas ou de matriz em todo o genoma nas
linhagens celulares apropriadas. Nestes estudos, os genes hospedeiros
candidatos são determinados por abordagens de biologia de sistemas e
interactoma proteína-vírus hospedeiro [61]. As bibliotecas de sgRNA
direcionadas são projetadas para genes hospedeiros candidatos para
produzir linhas celulares knock-out. Essas células mutantes serão
desafiadas por vírus e, finalmente, o sequenciamento da região alvo dos
sgRNAs no genoma da célula mutante determinará os genes causadores
de resistência e sensibilidade [80-82]. O processo de triagem de todo o
genoma CRISPR da célula hospedeira SARS CoV-2 é representado na
Fig. 3c. Após as etapas de eliminação, os genes que tornam as células
resistentes ao vírus são pró-virais, e os genes que tornam as células
sensíveis ao vírus são antivirais. Ao propagar células knock-out
resistentes e sequenciar a análise de dados, drogas antivirais seriam
projetadas com base nessas vias genéticas [83]. Na Tabela 3, é relatada
a triagem de todo o genoma baseada em CRISPR de importantes vias e
processos celulares para determinar os genes resistentes e sensíveis de
primeira linha envolvidos na infecção por SARS-CoV-2. Em alguns casos,
as pequenas moléculas candidatas que imitam as vias dos genes
antivirais ou bloqueiam as vias dos genes pró-virais foram especificadas.
Os estudos mostram que, devido à falta de conhecimento adequado
sobre as vias genéticas específicas envolvidas na citotoxicidade e no
metabolismo associados ao reaproveitamento de drogas no SARS-
CoV-2, a pesquisa nesse campo começou pelo CRISPR em todo o
genoma.
Conclusão
Após menos de dois anos da pandemia do COVID-19, a tecnologia
CRISPR mostrou algum potencial em todas as aplicações, desde o
diagnóstico até o tratamento desta doença. Todos esses recursos são
resultado da alta sensibilidade, flexibilidade, adaptabilidade e plataforma
de desenvolvimento do CRISPR. Além disso, com base nas novas
mutações do SARS-CoV-2 e na necessidade de vacinas recém-
projetadas, precisamos encontrar outras estratégias de tratamento, como
a tecnologia CRISPR para COVID-19 e outras infecções virais futuras.
Além de todas as vantagens do uso do sistema CRISPR na detecção de
variantes do vírus, produção de um modelo animal pré-clínico para
pesquisas de medicamentos e vacinas, sua aplicação em terapêutica
antiviral baseada na eliminação do vírus nas células infecciosas e
estudos de genes envolvidos na doença; este sistema certamente tem
deficiências.
13
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Uma das desvantagens deste sistema no diagnóstico é a
dificuldade de acesso aos resultados para clínicos em estudos
clínicos, portanto, os protocolos de diagnóstico baseados em
plataformas CRISPR-DX devem ser voltados para automação e
melhor leitura usando o aplicativo móvel com provisão para modo offline ou online.
Em estudos relacionados às aplicações antivirais do sistema
CRISPR, a maior limitação é o desenvolvimento de métodos de
entrega in vivo eficazes e seguros. Portanto, mais estudos sobre
a transferência de estruturas são necessários. Além disso, a
expressão suficiente de CRISPR/Cas nas células alvo tem um
efeito direto na obtenção de inibição viral eficiente através da
clivagem do genoma viral.
Efeitos no alvo e atividade limitada no alvo, bem como baixa
eficiência de knock-out para sgRNAs projetados, são outros
problemas enfrentados pelas pesquisas de triagem de todo o
genoma CRISPR, que exigem a otimização de sistemas CRISPR
por meio de engenharia estrutural e design mais preciso de
sgRNAs para o genoma alvo .
Concepção das Contribuições dos Autores , ZY e SF; supervisão, GK; redação—
preparação do rascunho original, ZY; revisão e edição do manuscrito, GK, RF e SK;
todos os autores leram e concordaram com a versão final do manuscrito.
Financiamento Esta pesquisa não foi financiada.
Declarações
Conflito de interesse Os autores declaram não ter conflito de interesse.
Referências
1. Harrison, AG, Lin, T., & Wang, P. (2020). Mecanismos de transmissão e
patogênese do SARS-CoV-2. Tendências Imunologia. https://doi.org/10.1016/
j.it.2020.10.004
2. Sood, S., et ai. (2020). Pandemia de COVID-19: Da biologia molecular,
patogênese, detecção e tratamento ao impacto social global. Relatórios de
Farmacologia Atuais. https://doi.org/10.1007/
s40495-020-00229-2
3. Dömling, A., & Gao, L. (2020). Química e biologia da SARS
CoV-2. Chem, 6(6), 1283-1295.
4. V'kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., & Thiel, V.
(2020). Biologia e replicação do coronavírus: Implicações para SARS-CoV-2.
Nature Reviews Microbiologia. https://doi.org/10.
1038/s41579-020-00468-6
5. Shang, J., et ai. (2020). Mecanismos de entrada celular do SARS-CoV-2.
PNAS, 117(21), 11727-11734.
6. Morse, JS, Lalonde, T., Xu, S., & Liu, WR (2020). Aprendendo com o passado:
possíveis opções urgentes de prevenção e tratamento para infecções
respiratórias agudas graves causadas por 2019-nCoV. Chem BioChem, 21(5),
730-738.
7. Elfky, AA (2020). Ribavirina, remdesivir, sofosbuvir, galidesivir e tenofovir contra
a polimerase de RNA dependente de RNA do SARS-CoV-2 (RdRp): Um estudo
de encaixe molecular. Ciência da vida. https://
doi.org/10.1016/j.lfs.2020.117592
13
Biotecnologia molecular
8. Makarova, WY, & Koonim, E. (2018). Classificação e nomenclatura dos sistemas
CRISPR-Cas: De onde vem? The CRISPR Journal, 1(5), 325–336.
9. Makarova, KS, et ai. (2011). Evolução e classificação dos sistemas CRISPR-Cas.
Nature Reviews Microbiology, 9(6), 467–477.
10. Tang, Y., & Fu, Y. (2018). Classe 2 CRISPR/Cas: Uma caixa de ferramentas de
biotecnologia em expansão para e além da edição de genoma. Cell &
Bioscience, 8, 59.
11. Shmakov, S., et ai. (2015). Descoberta e caracterização funcional de diversos
sistemas CRISPR-Cas classe 2. Célula molecular,
60(3), 385-397.
12. Shmakov, S., et ai. (2017). Diversidade e evolução dos sistemas CRISPR-Cas
classe 2. Revisões da natureza. Microbiologia, 15(3), 169-182.
13. Burmistrz, M., Krakowski, K., & Krawczyk-Balska, A. (2020).
Sistemas CRISPR-Cas direcionados a RNA e suas aplicações.
Revista Internacional de Ciências Moleculares. https://doi.org/
10.3390/ijms21031122
14. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA, & Charpentier, E.
(2012). Uma endonuclease programável de RNA duplo—DNA guiada na
imunidade bacteriana adaptativa. Ciência,
337 (6096), 816-821.
15. Freije, CA, et al. (2019). Inibição programável e detecção de vírus de RNA
usando Cas13. Célula Molecular, 76(5), 826-
837.e11.
16. Zetsche, B., et ai. (2015). Cpf1 é uma única endonuclear guiada por RNA de um
sistema CRISPR-Cas classe 2. Cell, 163(3), 759-771.
17. Esbin, MN, Whitney, ON, Chong, S., Maurer, A., Darzacq, X., & Tjian, R. (2020).
Superando o gargalo para testes generalizados: uma revisão rápida das
abordagens de teste de ácido nucleico para detecção de COVID-19. RNA,
26(7), 771-783.
18. Shen, M., et ai. (2020). Avanços recentes e perspectivas de detecção de ácidos
nucleicos para coronavírus. Jornal de Análise Farmacêutica. https://doi.org/
10.1016/j.jpha.2020.02.010
19. Feng, W., et ai. (2020). Diagnóstico molecular do COVID-19: Desafios e
necessidades de pesquisa. Química Analítica, 92(15), 10196-10209.
20. R. Jalandra et al., Estratégias e perspectivas para desenvolver métodos e
diagnósticos de detecção de SARS CoV-2. Farmacêutico Biomédico,
2020.
21. Murugan, K., Babu, K., Sundaresan, R., Rajan, R., & Sashital, D.
G. (2017). A revolução continua: sistemas recém-descobertos expandem o kit
de ferramentas CRISPR-Cas. Molecular Cell, 68(1), 15-25.
22. Guglielmi, G. (2020). Primeiro teste CRISPR para o coronavírus aprovado nos
Estados Unidos. Natureza. https://doi.org/10.1038/
d41586-020-01402-9
23. Sashital, DG (2018). Detecção de patógenos na era CRISPR-Cas.
Medicina do Genoma, 10(1), 32.
24. Jolany Vangah, S., Katalani, C., Booneh, HA, Hajizade, A., Sijercic, A., &
Ahmadian, G. (2020). Diagnóstico baseado em CRISPR de doenças infecciosas
e não infecciosas. Procedimentos Biológicos Online. https://doi.org/10.1186/
s12575-020-00135-3
25. Azmi, I., et ai. (2021). Um fluxo de trabalho livre de extração de RNA baseado
em saliva integrado ao Cas13a para detecção de SARS-CoV-2. Fronteiras em
Microbiologia Celular e Infecciosa. https://doi.org/10.3389/
fcimb.2021.632646
26. Fozouni, P., et ai. (2020). Detecção sem amplificação de SARS CoV-2 com
CRISPR-Cas13a e microscopia de telefone celular. Célula. https://doi.org/
10.1016/j.cell.2020.12.001
27. Arizti-Sanz, J., et ai. (2020). Desativação simplificada, amplificação e detecção
baseada em Cas13 de SARS-CoV-2. Nature Communications, 11(1), 5921.
28. Chen, Y., et ai. (2020). Detecção visual livre de contaminação de SARS-CoV-2
com CRISPR/Cas12a: um método promissor na
Machine Translated by Google
Biotecnologia molecular
detecção de ponto de atendimento. Biossensores e Bioeletrônica. https://
doi.org/10.1016/j.bios.2020.112642
29. Jia, C., et ai. (2018). Novas aplicações do sistema CRISPR/Cas9 na detecção de
DNA mutante. Gene, 641, 55-62.
30. Wang, Q., Zhang, B., Xu, X., Long, F., & Wang, J. (2018).
PCR de tipagem CRISPR (ctPCR), um novo método de detecção de DNA
baseado em Cas9. Relatórios Científicos, 8(1), 14126.
31. Jiao, C., et ai. (2021). Os crRNAs não canônicos derivados de transcritos do
hospedeiro permitem a detecção de RNA multiplexável por Cas9. Ciência,
372 (6545), 941-948.
32. Hajian, R., et ai. (2019). Detecção de genes-alvo não amplificados via CRISPR-
Cas9 imobilizado em um transistor de efeito de campo de grafeno.
Nature Biomedical Engineering, 3(6), 427-437.
33. Dai, Y., Xu, W., Somoza, RA, Welter, JF, Caplan, AI e Liu, CC (2020). Circuito
bioquímico heterogêneo multifuncional integrado para análise genética baseada
em eletroquímica de alta resolução. Edição Internacional de Angewandte
Chemie. https://doi.
org/10.1002/anie.202010648
34. Xiong, E., et ai. (2020). Diagnóstico simultâneo de dois genes de SARS-CoV-2
com base no ensaio de fluxo lateral mediado por CRISPR/Cas9. Edição
Internacional de Angewandte Chemie. https://doi.org/
10.1002/anie.202014506
35. Broughton, JP, et al. (2020). Detecção baseada em CRISPR-Cas12 de SARS-
CoV-2. Biotecnologia da Natureza. https://doi.org/10.1038/
s41587-020-0513-4
36. Huang, Z., et ai. (2020). Diagnóstico COVID-19 ultrassensível e de alto rendimento
com CRISPR-p. Biossensores e. https://
doi.org/10.1016/j.bios.2020.112316
37. Ning, B., et ai. (2020). Um teste de saliva ultrassensível e quantitativo lido por
smartphone para COVID-19. Avanços da Ciência. https://doi.
org/10.1126/sciadv.abe3703
38. Ali, Z., et ai. (2020). iSCAN: Um módulo CRISPR Cas12 acoplado a RT-LAMP
para detecção rápida e sensível de SARS-CoV-2.
Pesquisa de vírus, 9, 221.
39. Guo, L., et ai. (2020). Detecção de SARS-CoV-2 com diagnóstico CRISPR. Cell
Discov, 6, 34.
40. Huang, W., et ai. (2020). Um intensificador específico baseado em CRISPR-
Cas12a para detecção mais sensível da infecção por SARS-CoV-2.
EBioMedicine, 61, 103036.
41. Ma, P., et ai. (2020). MeCas12a, um sistema altamente sensível e específico para
detecção de COVID-19. Ciência Avançada (Weinheim),
7(20), 2001300.
42. Nguyen, LT, Smith, BM e Jain, PK (2020). O aprimoramento da atividade de trans-
clivagem de Cas12a com crRNA manipulado permite a detecção de ácido
nucleico amplificado. Nature Communications, 11(1), 4906.
43. Wang, R., et ai. (2020). opvCRISPR: Plataforma RT-LAMP CRISPR visual de
um pote para detecção de SARS-cov-2. Biosens Bioelectron,
172, 112766.
44. Ding, X., et ai. (2020). Detecção ultrassensível e visual de SARS-CoV-2 usando o
ensaio duplo CRISPR-Cas12a completo. Nature Communications, 11(1), 4711.
45. Ramachandran, A., et ai. (2020). Microfu idics acionados por campo elétrico para
diagnósticos rápidos baseados em CRISPR e sua aplicação na detecção de
SARS-CoV-2. PNAS. https://doi.org/10.1073/pnas.
2010254117
46. Ding, X., Yin, K., Li, Z., Sfeir, MM, & Liu, C. (2021). Detecção quantitativa
sensível de SARS-CoV-2 em amostras clínicas usando o ensaio digital CRISPR
de inicialização a quente. Biosens Bioelectron, 184, 113218.
47. Teng, F., et ai. (2019). Detecção: Detecção de DNA baseada em CRISPR-Cas12b
com sensibilidade subattomolar e especificidade de base única. Genoma
Biologia, 20(1), 132.
48. Joung, J., et ai. (2020). Detecção de SARS-CoV-2 com teste SHER LOCK One-
Pot. Jornal de Medicina da Nova Inglaterra,
383(15), 1492-1494.
49. Patchsung, M., et al. (2020). Validação clínica de um ensaio baseado em Cas13
para a detecção de RNA de SARS-CoV-2. Nature Biomedical Engineering, 4,
1140-1149.
50. Ackerman, CM, et ai. (2020). Detecção de ácido nucleico massivamente
multiplexado com Cas13. Natureza, 582 (7811), 277-282.
51. Storch, GA (2020). A ferramenta CRISPR é dimensionada para interrogar uma
enorme linha de suspeitos virais. Natureza, 582 (7811), 188-189.
52. Chen, JS, et ai. (2018). A ligação ao alvo CRISPR-Cas12a desencadeia atividade
indiscriminada de DNase de fita simples. Ciência, 360 (6387), 436-439.
53. Saha, A., Arantes, PR, Hsu, RV, Narkhede, YB, Jinek, M., & Palermo, G. (2020).
A dinâmica molecular revela um interruptor dinâmico induzido por DNA que
desencadeia a ativação de CRISPR Cas12a. Jornal de Informação Química e
Modelagem. https://doi.org/10.1021/acs.jcim.0c00929
54. Gootenberg, JS, et ai. (2017). Detecção de ácido nucleico com CRISPR-Cas13a/
C2c2. Ciência, 356 (6336), 438-442.
55. Gootenberg, JS, Abudayyeh, OO, Kellner, MJ, Joung, J., Collins, JJ, & Zhang, F.
(2018). Plataforma de detecção de ácido nucleico multiplexada e portátil com
Cas13, Cas12a e Csm6.
Science (Nova York, NY), 360 (6387), 439-444.
56. Hou, T., et ai. (2020). Desenvolvimento e avaliação de um diagnóstico rápido
baseado em CRISPR para COVID-19. Patógenos PLoS. https://doi.org/10.1371/
journal.ppat.1008705
57. Wang, Y., et ai. (2021). Detecção de SARS-CoV-2 e suas variantes mutantes por
meio de amplificação de transcrição baseada em CRISPR-Cas13. Química
Analítica, 93(7), 3393-3402.
58. Meng, Q., et ai. (2021). Detecção da mutação SARS-CoV-2 D614G usando RNA
guia Cas12a projetado. Revista Biotecnologia. https://doi.org/10.1002/
biot.202100040
59. Saxena, A. (2020). Alvos de medicamentos para a terapêutica COVID-19:
Esforços globais em andamento. Journal of Biosciences, 45(1), 87.
60. Chellapandi, P., & Saranya, S. (2020). Insights genômicos do SARS-CoV-2
(COVID-19) na descoberta de medicamentos baseados em alvos. Pesquisa em
Química Medicinal. https://doi.org/10.1007/
s00044-020-02610-8
61. Gordon, DE, et ai. (2020). Um mapa de interação da proteína SARS-CoV-2 revela
alvos para reaproveitamento de medicamentos. Natureza, 583 (7816), 459-468.
62. Atzrodt, CL, et ai. (2020). Um guia para COVID-19: uma pandemia global causada
pelo novo coronavírus SARS-CoV-2. Revista FEB. https://doi.org/10.1111/
febs.15375
63. Soppe, JA, & Lebbink, RJ (2017). Antiviral se torna viral: aproveitando o CRISPR/
Cas9 para combater vírus em humanos. Trends in Microbiology, 25(10),
833-850.
64. Price, AA, Sampson, TR, Ratner, HK, Grakoui, A., & Weiss, DS (2015).
Direcionamento de RNA viral mediado por Cas9 em células eucarióticas.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 112(19), 6164–6169.
65. Nguyen, TM, Zhang, Y., & Pandolfi, PP (2020). Vírus contra vírus: Um tratamento
potencial para 2019-nCov (SARS CoV-2) e outros vírus de RNA. Cell Research,
30(3), 189-190.
66. TR Abbott et al., Desenvolvimento de CRISPR como uma estratégia antiviral para
combater SARS-CoV-2 e Infuenza. Cel, 2020.
67. Wang, L., Zhou, J., Wang, Q., Wang, Y., & Kang, C. (2021).
Projeto e desenvolvimento rápidos de CRISPR-Cas13a visando a proteína
spike SARS-CoV-2. Theranostics, 11(2), 649-664.
68. Blanchard, EL, et al. (2021). Tratamento de infecções por influenza e SARS-
CoV-2 via Cas13a codificado por mRNA em roedores.
Nature Biotechnology, 64, 4893.
69. Subbarao, K., & Roberts, A. (2006). Existe um modelo animal ideal para SARS?
Trends in Microbiology, 14(7), 299–303.
70. Ni, W., et ai. (2020). Papel da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) no
COVID-19. Cuidados Críticos, 24(1), 422.
13
Machine Translated by Google
71. Lutz, C., Maher, L., Lee, C., & Kang, W. (2020). Modelos pré-clínicos COVID-19:
camundongos transgênicos da enzima conversora de angiotensina 2 humana.
Genômica Humana, 14(1), 20.
72. Sun, SH, et ai. (2020). Um modelo de camundongo de infecção e patogênese por
SARS-CoV-2. Cell Host & Microbe, 28(1), 124-133.e4.
73. Agrotis, A., & Ketteler, R. (2015). Uma nova era em genômica funcional usando
CRISPR/Cas9 na triagem de bibliotecas em array.
Frontiers in Genetics, 6, 300.
74. Francis Stewart, A., & von Melchner, H. (2019). Novos métodos para extrair funções
do genoma de mamíferos. Métodos,
164-165, 1-2.
75. Ludwig, ML, et ai. (2018). Geração e utilização de bibliotecas de triagem CRISPR/
Cas9 em células de mamíferos. Tinta.
Appasani (Ed.), edição de genoma e engenharia: De TAL ENs, ZFNs e CRISPRs
para cirurgia molecular (pp. 223-234).
Cambridge University Press.
76. Yu, JSL e Yusa, K. (2019). Triagem de CRISPR-Cas9 em todo o genoma em
células de mamíferos. Métodos, 164-165, 29-35.
77. Ma, H., et ai. (2015). Uma tela baseada em CRISPR identifica genes essenciais
para a morte celular induzida pelo vírus do Nilo Ocidental. Relatórios de Células,
12(4), 673-683.
78. Savidis, G., et ai. (2016). Identificação de fatores de dependência do vírus Zika e
do vírus da dengue usando genômica funcional. Relatórios de Células,
16(1), 232-246.
79. Park, RJ, et al. (2017). Uma tela CRISPR em todo o genoma identifica um conjunto
restrito de fatores de dependência do hospedeiro do HIV. Genética da Natureza,
49(2), 193-203.
80. Wei, J., et ai. (2020). As telas CRISPR em todo o genoma revelam fatores do
hospedeiro críticos para a infecção por SARS-CoV-2. Célula. https://doi.org/
10.1016/j.cell.2020.10.028
13
Biotecnologia molecular
81. Flynn, RA, et ai. (2021). Descoberta e interrogação funcional das interações da
proteína hospedeira do RNA SARS-CoV-2. Cell, 184(9), 2394-2411.e16.
82. Lu, F., & Tellier, M. (2020). CRISPRing para genes hospedeiros que regulam
SARS-CoV-2. Nature Reviews Imunologia. https://doi.org/
10.1038/s41577-020-0400-
83. Hofmann, HH, et ai. (2020). A interrogação funcional de um interactoma de proteína
hospedeira SARS-CoV-2 identifica fatores hospedeiros de coronavírus únicos e
compartilhados. Cell Host & Microbes, 5, 4921.
84. Daniloski, Z., et ai. (2020). Identificação dos fatores do hospedeiro necessários
para a infecção por SARS-CoV-2 em células humanas. Célula. https://doi.org/
10.1016/j.cell.2020.10.030
85. Hofmann, HH, et ai. (2021). TMEM41B é um host pan-favivirus
fator. Cell, 184(1), 133-148.e20.
86. Schneider, WM, et ai. (2021). Identificação em escala genômica de redes de fatores
hospedeiros SARS-CoV-2 e pan-coronavírus. Célula,
184(1), 120-132.e14.
87. Wang, R., et ai. (2021). Triagens genéticas identificam fatores do hospedeiro para
SARS-CoV-2 e coronavírus de resfriado comum. Célula, 184(1), 106-
119.e14.
88. Baggen, J., et ai. (2021). A triagem CRISPR em todo o genoma identifica o
TMEM106B como um fator hospedeiro proviral para SARS-CoV-2.
Nature Genetics, 53(4), 435-444.
89. Yang, Q., et ai. (2020). Inibição da entrada viral SARS-CoV-2 ao bloquear a
elaboração de N- e O-glicanos", Elife. https://doi.
org/10.7554/eLife.61552
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