Mutações Cromossômicas

Alterações Cromossômicas Numéricas

- Problema quan ta vo e não qualita vo
- Euploidia: alterações no número inteiro de conjuntos cromossômicos; múl plos
Mecanismos Responsáveis por Fenó pos Anormais
de n (poliploidia)
- Efeito de dose: deleção ou duplicação de material cromossômico
- Causas: polispermia e não disjunção celular
- Efeito direto da aberração: disrupção de um ou mais genes no ponto de quebra
- Triploidia (3n): podem nascer vivos (raríssimo)
de um rearranjo
- A maioria sofre aborto espontâneo até o 1º trimestre; outros
- Efeito de posição: relacionado à função inadequada de um gene
são na mortos
Teratoma Ovariano
- A manifestação clínica depende da origem parental do conjunto
cromossômico extra  paterno: geralmente abortados
Tumores benignos ocorrentes no espontaneamente no início da gestação; materno: placenta
degenera va anormal com feto pequeno
ovário que se originam de células 46,
XX contendo somente cromossomos - Aneuploidia: alterações em parte do conjunto cromossômico ou em um par; a
maternos maioria é letal

- Causas: não disjunção dos cromossomos homólogos ou das cromá des

Molas Hida formes - Aneuploidias viáveis:
- Parciais: triploides - Cromossomos sexuais: X, XXY, XXX, XYY, XXXX...

- Origem paterna: 2/3 dos casos; - Cromossomos 13, 21 e 18 (possuem um menor número de genes)
trofoblasto abundante (placenta
- Obs: nem toda síndrome de Down tem 47 cromossomos;
desenvolvida) e desenvolvimento fetal várias síndromes podem ser numéricas ou estruturais
deficiente

- Origem materna: retardo do

crescimento embrionário com placenta Alterações Cromossômicas Estruturais
pequena e fibró ca - Mudanças na estrutura dos cromossomos, que resultam de uma ou mais quebras
- Completas: diploides com carió po 46, XX em um ou mais cromossomos, com subsequente reunião em uma configuração
diferente.
- Todos os cromossomos são de origem paterna: um espermatozoide 23, X
fer liza um óvulo anucleado - Rearranjo balanceado: sem perda nem ganho de material gené co
- Não-balanceado: quan dade incorreta de material gené co; trissomias ou - Translocação Robertsoniana: sempre recíproca
monossomias parciais
- Braços curtos de dois
- Causas das mutações estruturais: cromossomos não-
homólogos são perdidos
- Duplicação: sempre desbalanceada
e os braços longos se
- Deleção: sempre desbalanceada fundem no centrômero
formando um único
- Consequência clínica: cromossomo
haploinsuficiência (incapacidade
de uma única cópia realizar a - Específica dos cromossomos acrocêntricos
função normal desempenhada
- Portadores de 45 cromossomos por célula 
pelas 2 cópias de um gene)
feno picamente normais
- Deleções visíveis microscopicamente geralmente envolvem
- Cromossomos 13, 14, 15, 21, 22  é mais comum entre
múl plos genes e as consequências podem ser severas
13 e 14
- Translocação: pode ser balanceado ou não
- Entre 14 e 21  5% dos casos de síndrome de Down
- Não ocorre em cromossomos do mesmo par
- ½: abortos; 1/3 dos vivos: síndrome de Down; 1/3 dos
- Translocação simples: ocorre somente em 1 direção; um vivos: normal; 1/3 dos vivos: portador da translocação
cromossomo perde um pedaço e outro o ganha rob(14q, 21q)

- Translocação recíproca: os cromossomos trocam pedaço - Cromossomo em anel: problemas para a mitose  separação das
cromá des irmãs, quebra e posterior fusão formando anéis maiores ou
menores  instabilidade mitó ca

- Comum em tumores
- Inversão: geralmente balanceada Alterações Cromossômicas Cons tucionais

- Não existe síndrome - Mosaico: não disjunção nas mitoses pós-zigó cas
causada por inversão
- 46,XX  46,XX e 47,XX,+21
- Problema: gametas
- O grau e o estágio de desenvolvimento são relevantes para o fenó po
(pareamento dos
(abrandamento das síndromes)
cromossomos homólogos
não ocorre corretamente) - Cromossomo marcador: pequeno cromossomo não iden ficado
 alterações estruturais
(crossing-over anormal) - Cromossomo extranumerário, estruturalmente anormal (apenas ele; os
outros são normais)
- Inversão paracêntrica:
não envolve o centrômero;
envolve apenas 1 braço
Síndromes Cromossômicas Numéricas
- Inversão pericêntrica: envolve o centrômero; envolve os dois
braços Síndrome de Down – Trissomia do 21

- Cromossomo dicêntrico: problemas na mitose  pode se romper no meio - 1/700 NV

- Células tumorais  instabilidade - Origem:

pode ser mitó ca e genômica - 95%: trissomia livre
- Mais comum em células mitó cas - 4%: translocações
- 1%: mosaicos

- Caracterís cas:
- Isocromossomo: braços idên cos  P e P; Q e Q
- Prega Epicân ca, olhos amendoados, fenda palpebral oblíqua,
- Consequência: trissomia e monossomia achatamento da face, ponte nasal baixa, sulco palmar único, separação
parcial entre os 2 primeiros dedos do pé, baixa estatura com ossos curtos e largos,
boca pequena, língua grande (para fora);
- Mais comum: Xq  síndrome de Turner
- Hipotonia, hiper flexibilidade das ar culações, tendência à obesidade, QI
- Comum em tumores sólidos e neoplasias geralmente abaixo da média, porém há grande variabilidade quanto a
hematológicas malignas cognição; malformação cardíaca congênita em 50% dos casos (canal
- Ocorre pela divisão horizontal do atrioventricular com ausência de sopro), obstruções gastrointes nais,
cromossomo ao invés da separação das leucemia em adultos (probabilidade 11 vezes maior), achados neurológicos
cromá des irmãs (ver cal) compa veis com Alzheimer; há um certo índice de infer lidade masculina;
Megacólon;
 Síndrome de Patau - Trissomia do 13
- 1/5000 a 10000 NV, aumentando com a idade materna
- Origem:
- Trissomia livre
- Translocação
- Caracterís cas:
- Expecta va de vida baixíssima:
90% morrem antes dos 6 meses de vida
- Afeta tudo relacionado à linha média do corpo
- Múl plas anomalias congênitas: microcefalia, ano almia ou micro almia,
ciclopia, nariz achatado, triangular e largo, lábio e/ou palato fendido, palato
ogival (arqueado), microgna a, cardiopa a congênita, polidac lia, genitais
externos anormais, ausência de órgãos, costelas ou vértebras, pés com
calcâneo proeminente
- Deficiências cogni vas muito graves
Síndrome de Edwards – Trissomia do 18
- 1/3500 a 1/8000 NV, aumentando com a idade materna
- Segunda trissomia autossômica mais comum
- Caracterís cas:
- Expecta va de vida muito baixa: 30%
morrem antes de 1 mês de vida e 10% antes
de um ano; mosaicos podem chegar à vida
adulta com alto grau de deficiência cogni va;
- Fenda palpebral pequena, epicanto, deficiência no crescimento pré-natal
(baixo peso), orelhas dismórficas e de baixa implantação, microstomia
(boca pequena), punhos fechados com dedos sobrepostos, rigidez
muscular, malformações dos membros inferiores, pés mal posicionados,
cardiopa as congênitas, genitais externos anormais, alta deficiência
cogni va;
Síndrome de Turner – Monossomia do X
- 1/2500 NV
- Origem:
- 50%: 45,X
- 25%: mosaicos
- 25%: Isocromossomo Xq ou deleção Xq
- Caracterís cas:
- 90% dos embriões sofrem aborto espontâneo
- Falha puberal: amenorreia primária (não menstrua),
não desenvolve as mamas e os pelos pubianos, tem
disgenesia ovariana (ovário em fita)  infer lidade
- Baixa estatura, tórax largo com mamilos espaçados, cúbito valgo (braços
levemente afastados do corpo em posição anatômica), pescoço alado e
largo, implantação baixa do cabelo na nuca, boca de peixe, cardiopa as
(coarctação da aorta), 1 rim em ferradura, linfedema congênito que pode
persis r após o nascimento
- Q.I. normal, mas com dificuldades aeroespaciais e em matemá ca
- Expecta va de vida normal
- Muitas sem caracterís cas iden ficáveis ao nascimento  diagnós co em
várias etapas da vida
Síndrome Duplo Y e Variantes – 47,XYY
- 1/840 NV masculino, aumenta com a idade paterna
- Origem: não disjunção da meiose II paterna
- Caracterís cas:
- A maioria dos homens com XYY são
feno picamente normais; homens com
estatura elevada (são proporcionais), não
dismórficos, orelhas anormais (de abano), fer lidade normal, inteligência
normal ou deficiência cogni va moderada, dificuldades de aprendizagem
 Síndrome de Klinefelter – 47,XXY | 48,XXXY | 49,XXXXY Síndromes Cromossômicas Estruturais
- 1/600 NV masculino
Síndrome de Cri-du-Chat (miado do gato) – del(5p)
- 50% dos casos: resultado da não disjunção na meiose I
- 1/15000 NV
paterna
- Deleção do braço curto do cromossomo 5:
- Caracterís cas:
46,XX,del(5p) ou 46,XY,del(5p): deleção 5p15
- Hipogonadismo, ginecomas a, infer lidade
- Esporádica  raro ter mais de 1 filho com a
(azoospermia), baixa fer lidade, atraso do
síndrome
desenvolvimento pubertário com hábito
eunucoide, ausência de barba e pelos no corpo, ↑ - Caracterís cas:
estatura desproporcional
- Expecta va de vida variável, muitos chegam à vida adulta
- Q.I. normal ou um pouco abaixo da média,
- Baixo peso ao nascer, choro parecido com miado, microcefalia,
T.D.A.H., dificuldades de aprendizado, e de
hipertelorismo ocular (olhos mais afastados), fácie arredondada,
organizar ro nas diárias, incoordenação motora,
microgna a (mandíbula pequena), prega epicân ca, orelhas dismórficas
baixo desenvolvimento do tônus muscular
com ou sem baixa implantação
- 40 a 50% não apresentam caracterís cas percep veis
- Déficit cogni vo de médio a severo (QI médio 35; muitos não
- ↑nº X ↑malformações ↓crescimento ↓Q.I. desenvolvem a fala), retardo neuromotor (começam a andar tardiamente),
cardiopa as congênitas
- Expecta va de vida normal
Síndrome de Wolf-Hirschhorn - del(4p16.3)
Síndrome Poli-X – 47,XXX | 48,XXXX | 49,XXXXX
- Deleção terminal no braço curto do cromossomo 4:
- 1/1000 NV feminino
46,XX,del(4p16.3) ou 46,XY,del(4p16.3)
- Caracterís cas:
- Caracterís cas:
- ↑nº X ↑malformações ↓Q.I.
- Deficiência intelectual grave, retardo
- Puberdade e fer lidade, em geral, normais;
neuromotor e do crescimento, convulsões,
esterilidade em alguns casos, normalmente sem
cardiopa as congênitas;
malformações
- Hipertelorismo ocular, ponte nasal larga e nariz tubular, epicanto, filtro
- Leve déficit cogni vo, deficiência de crescimento pré-
curto, cantos da boca virados para baixo, microcefalia, protuberâncias
natal, distúrbios de atenção e problemas de
frontais (testa), palato ogival, lábio e palato fendido esporádico, orelhas
aprendizagem em 70% casos; 25% dos casos apresentam problemas
grandes e dismórficas, malformações esquelé cas, pés tortos, dedos e
emocionais e/ou psiquiátricos, podendo ocorrer comportamento psicó co
unhas malformados;
 Síndrome de Williams - del(7q11.23)
- 46,XX,del(7q11.23) ou 46,XY,del(7q11.23)
- Caracterís cas:
- Não afeta a expecta va de vida
- Quanto maior a região deletada, maior é
o número de caracterís cas da síndrome
- A região deletada inclui o gene da elas na
- Ponte nasal funda, inchaço embaixo dos
olhos, prega epicân ca, olhos azuis com
padrão estrelado, filtro longo, dentes
pequenos e espaçados, boca larga, lábio
inferior proeminente, microgna a
- Hipercalcemia e variedade de alterações
vasculares, sensibilidade musical e boa
memória audi va, grande sociabilidade,
deficiência cogni va de leve a moderada,
desenvolvimento motor mais lento,
grande dificuldade em executar tarefas
que necessitem de coordenação motora, como cortar papel, desenhar,
andar de bicicleta, amarrar o sapato etc.
- Primeiro ano de vida: dificuldade de se alimentar (vômito e recusa
alimentar), irritabilidade e choro excessivo
Síndrome de DiGeorge – del(22q11.2)
- 1/2000 a 4000 NV
- Deleção no braço longo do cromossomo 22: del(22q11.2)
- 8 a 28%: mutação de novo (mutação aleatória)
- Síndrome velo-cardio-facial, Shprintzen, SD22q11
- Caracterís cas:
- Defeito do 3º e 4º arcos branquiais  anomalias relacionadas aos
derivados embriológicos dessa região
- Grande variabilidade feno pica na família  mais de 180
malformações associadas
- 30% dos pacientes com malformações conotruncais isoladas (alterações
nas vias de saída do coração) possuem a deleção
- Hipoplasia ou aplasia das glândulas para reoides  hipocalcemia;
agenesia ou hipoplasia do mo  deficiência das céls T  disfunção
imune; anomalias cardíacas conotruncais e renais, nariz tubular e alargado,
fenda pala na; deficiências de aprendizagem e problemas
neuropsiquiátricos
Técnicas Citogené cas
Tipos de Célula Proliferados em cultura
- Linfócitos (mais acessíveis)  biópsias
- Fibroblastos da pele
- Medula óssea  diagnós co de leucemia (cél. presentes apenas na MO), biópsias
- Células fetais do fluido amnió co ou de vilosidades coriônicas  início da
gestação
- Tecido derivado de tumor
- Sangue: o mais usado em indivíduos que já nasceram
- Sangue do cordão umbilical  final da gestação ou logo após o nascimento
- DNA fetal livre do plasma materno  u lizado para análise cromossômica, mas
não para realização de carió po
 Indicações para Análise Cromossômica Bandeamento Cromossômico

- Suspeita (a par r dos achados clínicos) de síndrome cromossômica conhecida  - Bandeamento GTG (padrão ouro): tratamento com tripsina, corante Giemsa,
direcionar o laboratório para o que se está procurando possibilitando um carió po visível pela coloração dos cromossomos condensados.

- Padrão irreconhecível de 2 ou + malformações (malformações congênitas - Padrão claro: banda G –

múl plas em RN ou única em feto)  descrever o quadro para o laboratório
- Padrão escuro: banda G+  poucos genes e menos transcricionalmente
- Genitália ambígua a vo

- Deficiência cogni va, problemas de crescimento ou desenvolvimento em crianças - 400 a 550 bandas

- Genitores e filhos de pessoas com cromossomopa as estruturais - Detecção de deleção ou duplicação maior que 5 -10 Mb  se for menor
que 5Mb, o GTG não detecta
- Na morto com malformações ou sem nenhum mo vo reconhecível para morte
fetal

- Problemas de fer lidade: mulheres com amenorreia primária, casais com

infer lidade ou abortos de repe ção

- Neoplasia

- Gestação

Citogené ca Clássica – Preparação de Carió po

- Bandeamento de alta resolução: 840

bandas ou mais  é possível ver
alterações menores

- Deleções ou duplicações de 2
a 3Mb
- Bandeamento Q: uso de corante fluorescente (DAPI/quinacrina); bandas Q - Bandeamento R (reverso): os cromossomos são desnaturados por calor antes de
marcam os mesmos segmentos das bandas G serem corados com Giemsa  as bandas claras e escuras são reversas ao GTG

- Não é usado ro neiramente  precisa de um microscópio mais caro - Usado para ver alterações muito claras no bandeamento GTG e que são
mais di ceis de enxergar

- Bandeamento NOR: os cromossomos são corados em suas regiões satélites (braço

curto dos cromossomos acrocêntricos: região organizadora do nucléolo) 
constrição secundária

- A prata (Ag) é um dos corantes mais usados

Citogené ca molecular – FISH

- Hibridização in situ (pareamento das fitas) com fluorescência (FISH)

- Bandeamento C: os cromossomos são expostos à desnaturação com uma solução - Detecta anomalias cromossômicas como pequenos rearranjos, microdeleções e
saturada de hidróxido de bário antes da coloração com Giemsa duplicações que a citogené ca tradicional não consegue iden ficar

- É possível ver somente o centrômero  heterocroma na - Iden ficação de cromossomo marcador (cromossomo não iden ficado que não
centromérica/cons tu va  DNA altamente repe vo faz parte dos 46)

- Iden ficação de alterações nos centrômeros: cromossomo dicêntrico ou - Sondas de DNA (pedaços de DNA de fita simples) marcadas com fluorocromos
inversões que mudam a posição do centrômero (corantes fluorescentes) específicas para cromossomos individuais, regiões
cromossômicas ou genes

- Cromossomo metafásico ou interfásico

- U liza microscópio de fluorescência

- Subs tui o bandeamento de alta

resolução

- Diagnós co de síndrome de Williams

 Cario pagem Espectral – SKY - Aplicações: crianças com atraso de desenvolvimento ou crescimento não
explicado, deficiência intelectual não explicada, au smo, defeitos congênitos sem
- É um po de cario pagem FISH
alteração no carió po convencional, convulsões, genitália ambígua, síndromes
- U liza várias sondas com uma cor para cada cromossomo gené cas de microdeleção

- Cromossomos em metáfase - Limitações:

- Usa microscópio espectral - Detecta número de cópias, mas não se estão translocadas ou rearranjadas
 não detecta alterações balanceadas como inversões

- Não detecta a posição das alterações

- Detecta CNV benigno

- Não detecta alterações abaixo da resolução

Hibridização Genômica Compara va em Microarranjo – aCGH

- Verifica o genoma inteiro simultaneamente, representando uma matriz ordenada

de segmentos genômicos em uma lâmina microscópica (chip) contendo segmentos
de DNA sobrepostos ou regularmente espaçados que representam o genoma
inteiro  hibridização do DNA teste

- Quanto maior o número de sondas na lâmina, maior a resolução do teste

- Detecta ganhos ou perdas (variação no número de cópias - CNV) em todo o

genoma e perda de heterozigosidade (dissomia uniparental)

- Detecta variação na quan dade de material gené co

- Dissomia uniparental  ex: AA x Aa  nasce aa

- Herdou apenas 1 cromossomo do par (de só um dos pais) e o
duplicou
 Padrões de Herança Monogênica Padrão de Herança Autossômico Recessivo (AR)

- Autossômico porque:
O que significa padrão de herança?
- Sexo masculino e feminino são afetados na mesma proporção
- Dominante ou recessivo: refere-se ao fenó po  o caráter dominante ou
recessivo é definido pelo fenó po do heterozigoto - Pode ser transmi do diretamente de homem para homem
- Em qual cromossomo está o gene que, quando mutado, causa a doença? - Recessivo porque:
- Herança autossômica, ligada ao X, ligada ao Y (holândrica), mitocondrial - Heterozigotos não são afetados
- Quem manifesta a doença? - A caracterís ca aparece na prole de
genitores não afetados  salto de geração
- Heterozigotos ou somente homozigotos?
(pode ser salto de muitas gerações)
- Se heterozigotos manifestam  dominante
- A caracterís ca aparece em irmandades
- Se heterozigotos não manifestam, somente portadores de 2 alelos
- Frequentemente os genitores são
mutados (não necessariamente a mesma mutação nos dois
consanguíneos (em qualquer geração)
cromossomos)  recessivo
- Muito comum em comunidades judaicas
- Ex: albinismo  autossômico recessivo

- Gene TYR do cromossomo 11  autossômico

Padrão de Herança Autossômico Dominante (AD)
- Heterozigoto saudável/normal  herança recessiva
- Autossômico porque:
- Homozigoto (portador de 2 mutações) afetado (albino)
- Sexo masculino e feminino são afetados na mesma proporção
- Ex: síndrome do X frágil  ligado ao X *dominante*
- Pode ser transmi do diretamente de homem para homem
*Para uma mulher heterozigota, ser afetada ou não depende de qual
cromossomo X foi ina vado* - Dominante porque:
- Gene FMR1 do cromossomo X  Ligado ao X - Heterozigotos são afetados
- Heterozigota afetada  dominante - Ocorre em todas as gerações
- Homem  não depende da dominância - Somente afetados possuem
filhos afetados
- Se houver a mutação  afetado

- Se o alelo for normal  saudável

 Padrão de Herança Recessivo Ligado ao X Padrão de Herança Holândrico

- Ligado ao X porque: - Somente homens afetados porque só eles têm cromossomo Y

- Não se distribui igualmente nos dois sexos - Não há salto de geração  para um homem ser afetado, seu pai também deve ser
afetado e seu filho também será
- Não há transmissão direta de homem para homem
- Não há doenças relacionadas a esse padrão de
- Recessivo porque:
herança
- As mulheres heterozigotas não
- Usado para reconhecimento de paternidade
são afetadas
entre homens
- Há mais homens afetados do
que mulheres

- Há salto de geração
Padrão de Herança Mitocondrial
- Homens afetados geralmente
tem filhos normais, de ambos os - Mutação em genes no DNA mitocondrial (presente no citoplasma)
sexos
- Todas as nossas mitocôndrias são derivadas do
Padrão de Herança Ligado ao X Dominante citoplasma do óvulo  herança exclusivamente
materna
- Ligado ao X porque:
- Uma mulher afetada passa a doença para
- Não se distribui igualmente nos
todos os seus filhos
dois sexos
- Um pai afetado não passa a doença para seus
- Não há transmissão direta de
filhos* (há exceções)
homem para homem

- Dominante porque:

- As mulheres heterozigotas são afetadas

- Mais mulheres afetadas do que homens

- Homens afetados  100% das filhas afetadas e filhos do sexo masculino

normais

- Mulheres afetadas heterozigotas podem ter 50% de seus filhos de ambos

os sexos afetados
 Iden ficação do Padrão de Herança Heterogeneidade de Lócus

- Feita por exclusão: Mutações em genes diferentes causam a mesma doença.

1) Pode ser holândrica? - Se os pais verem mutação em genes diferentes cada um, os filhos não terão a
doença  AAbb x aaBB = 100% AaBb (normal)
pai afetado  filhos homens afetados
- Ex: Alzheimer de início precoce, Xeroderma Pigmentoso
2)Pode ser mitocondrial?
Heterozigoto Composto
mãe afetada  todos os filhos afetados
Genó po formado por 2 mutações, afetado por doença recessiva.
pai afetado  nenhum filho afetado
- Heterozigotos podem ser afetados por heranças autossômicas recessivas se os
3) Se a resposta for não para as 2 perguntas acima, conta-se o número de dois alelos forem mutados (1 mutação diferente para cada alelo)
afetados para cada sexo (diferença +/- 2x1, 3x1, 4x1...)
Expressividade Variável
nº homens afetados = nº mulheres afetadas  autossômico
A doença possui diferentes
nº homens afetados > nº mulheres afetadas  ligado ao X recessivo indivíduos e/ou diferentes
nº homens afetados < nº mulheres afetadas  ligado ao X dominante grupos etários. Ex:
Síndrome de Marfan e
Neurofibromatose.
Alterações de Padrões de Herança
- A mutação não explica o
Albinismo (Doença Autossômica Recessiva)
grau da doença.
- Albinismo Oculocutâneo Total (Tirosinase-nega vo)

- Tipo 1A: ausência completa de pigmento na pele, cabelos e olhos, devido

Mutação de Novo
à ausência de função da enzima rosinase
Surgimento de uma mutação em uma família (primeiro caso se for dominante).
- Tipo 1B: a vidade reduzida de rosinase, produzindo pouca melanina
- Considera-se que a mutação não é herdada  0% de chance do próximo filho ser
- Gene TYR, 11q14 - 303 mutações
afetado
Heterogeneidade Alélica
- Ex: Síndrome de Marfan, Distrofia Muscular da Duchenne e Acondroplasia
Diferentes alelos no mesmo gene causadores da doença.

- Várias mutações para o mesmo gene

- Ex: Albinismo, FC, fenilcetonúria

 Penetrância Incompleta (para Heranças Dominantes) Doenças mitocondriais:

Quando nem todos os portadores de mutação manifestam a doença. Ex: Síndrome - Afetam músculos e SNC
do X Frágil.
- Aparecimento tardio
- Pode haver salto de gerações mesmo em doenças autossômicas dominantes
- Progressivas
- Penetrância de 80%  80% dos portadores de mutação manifestam a doença
- Mutações de ponto
- Quem não manifesta a doença são aqueles cujo cromossomo X mutado
- Grandes deleções
foi o cromossomo ina vado

Mutação Dinâmica
Herança Limitada ao Sexo
Expansões de trinucleo deos que são instáveis ao longo das gerações.
O fenó po é limitado (só se expressa) em um dos sexos. Os genes são autossômicos,
Antecipação Gené ca
mas o efeito feno pico é determinado pelo sexo (geralmente pela dosagem dos
Manifestação precoce ao longo das gerações, causada por mutações dinâmicas. Ex: hormônios sexuais).
Distrofia miotônica, Doença de Hun ngton.
- Exemplo: Testotoxicose familiar
- Ex: avó manifesta com 55 anos; filha com 30; neta na infância
- Dominante
Mutação em Genes Mitocondriais
- Puberdade precoce masculina (3, 4 anos de idade)

- Gene que codifica o receptor do hormônio luteinizante (LCGR) 

mutações a vam a ação sinalizadora do receptor mesmo na ausência do
hormônio

- Caracterís cas sexuais secundárias e es rão da adolescência aos 4 anos,

fer lidade normal, fusão das epífises precoce  baixa estatura quando
adultos

Técnicas de Biologia Molecular

Extração de DNA

- Lise das membranas plasmá ca e nuclear

- Cons tuídos de fosfolipídeos + proteínas

- Uso de solução detergente

- Purificação do DNA - Cria um polo posi vo e um polo nega vo (o DNA vai do polo nega vo para o polo
posi vo)
- Remoção de componentes celulares (proteínas, organelas, restos
celulares) Brometo de e deo  corante de DNA – molécula que se intercala na dupla hélice
e, quando ligada ao DNA e exposta à luz UV, fluoresce na cor alaranjada
- Proteinase K – desnatura proteínas
- Poços iluminados e alinhados horizontalmente são fragmentos de mesmo
- Uso de fenol, clorofórmio, cloreto de sódio
tamanho
- Precipitação do DNA

- DNA é solúvel em água, mas insolúvel em álcool

- Uso de etanol  quanto mais gelado menos solúvel o DNA vai estar

- Formação de pellet

- Reidratação do DNA

- Após a re rada do álcool, o DNA deve ser solubilizado – água ou solução

tampão

- Armazenar o DNA a -20º C

- Quan ficação: determinar a concentração e pureza do DNA em solução

Eletroforese de DNA

- É uma técnica baseada na separação de par culas em um determinado gel

(matriz) de acordo com sua massa e carga

- Pode ser u lizada para separação de diversas moléculas orgânicas, como

lipoproteínas, proteínas, RNA e DNA

- O princípio da eletroforese para separação de DNA baseia-se:

- Na carga global nega va do DNA

- No tamanho da molécula  comprimento da dupla hélice (nº de pares de

bases)

- A composição C, G, T, A não influencia

 PCR – Reação em Cadeia da Polimerase - Tipos de PCR

- Amplificação in vitro de um fragmento de DNA - PCR convencional: necessário eletroforese para visualização do resultado

- Sua sequência, ou parte dela, deve ser conhecida

- Amplificação sele va: u liza-se a enzima polimerase isolada da bactéria Thermus

aqua cus  Taq polimerase

- Aplicações:

- Detecção da presença de organismos como patógenos

- Aumento do número de cópias de uma região de DNA de interesse para

u lização posterior em outras técnicas

- Itens necessários:

- DNA molde

- Enzima Taq polimerase - PCR em tempo real: a u lização de fluoróforos (corantes fluorescentes)
- Tampão de reação permite que uma câmera vai coletando dados ao longo do PCR e quando
este finaliza já é possível a visualização do resultado, não sendo necessária
- Nucleo deos livres a eletroforese
(dNTP = dATP, dCTP, dGTP
e dTTP) - qPCR: quan ta vo  carga viral

- Cloreto de magnésio - PCR em tempo real qualita vo (sistema TaqMan):

(cofator da enzima) - É possível acompanhar a fluorescência
- Primers específicos - Não precisa de uma análise posterior
para a região a ser
amplificada - Discriminação alélica: detecta diferenças mesmo se o
tamanho for igual (ex: trocas de nucleo deos); usado para
- Água estéril detectar qual alelo está presente em um local do gene
- Equipamento termociclado - Presença x ausência

- Uso de sondas de hibridização (pedaços de DNA para

parear com o DNA) alelo específicas marcadas com
fluorescência
 Sequenciamento de DNA

- ddPCR (droplet digital PCR):

- 3ª geração
- dNTP e ddNTP  nucleo deos
- PCR digital em gotas terminadores de cadeia ligados a uma
fluorescência  quando um é u lizado na sequência, a cópia encerra
- Quan ficação absoluta  contagem precisa do número de cópias
do DNA/RNA em uma amostra - Serão gerados milhões de
fragmentos de tamanhos
- Quan ficação de sequências raras
diferentes
- A amostra a ser amplificada é par cionada em 20.000 gotas
- Precisa ter um fragmento
juntamente com os reagentes inerentes a uma reação de PCR
para cada posição da
- A ddPCR pode ser sequência  indica qual
aplicada a qualquer análise nucleo deo está naquela
na qual a sequência alvo é posição (cada po tem uma
rara, ou que tenham cor diferente para diferenciar
considerável quan dade C, G, T, A)
de inibidores, ou que o
volume de amostra é
escasso
 Sequenciamento de Nova Geração - Illumina: sequenciamento por síntese

- Sequenciamento de Sanger - O primer é universal  ele se liga aos adaptadores

- Gold Standard para fragmentos – DNA amplificado por PCR

- Não é adequado para grandes porções de DNA: caro e ineficiente

- Novas técnicas mais eficientes e mais baratas para regiões maiores de

DNA

- NGS – Next Genera on Sequencing / Massively Parallel Sequencing / High

Throughput Sequencing
- Ion Torrent
- Diferentes tecnologias  marcas registradas de empresas
- Sequenciamento em semicondutor
- Mais rápidas e baratas para grandes quan dades de DNA
- Chip com micro sensor de
- Leitura de bilhões de fragmentos ao mesmo tempo, small reads
pH  detectam o processo
- Leitura e posição dos nucleo deos para iden ficar SNPs, pequenas de amplificação do DNA a
inserções e deleções par r da liberação de íons
H+ que são liberados no
- Não consegue avaliar grandes variações processo de incorporação
- Funciona somente quando os fragmentos se sobrepõem de base

- Libera 1 íon H+ para cada

nucleo deo  se o
nucleo deo for u lizado,
ocorre um pico no gráfico

- Podem ser u lizados para sequenciar:

- Genoma inteiro  whole genome sequencing (WGS)

- Somente as regiões codificadoras dos genes (o exoma  éxons)  whole

exome sequencing (WES)

- Genes alvo, painel de genes (targeted sequencing)  direcionado