REVISÃO DE GENÉTICA 3

CITOGENÉTICA ▪ Usado para associar alterações cromossômicas

com patologias
P: braço curto REPRESENTAÇÃO DO CARIÓTIPO

Q :grande ▪ Cariograma: foto do conjunto diplóide.

▪ idiograma: representação do conjunto haplóide

Metacêntrico. O centrômero está localizado aproximadamente no

meio do cromossomo; logo, o cromossomo tem dois braços de
mesmo tamanho. Submetacêntrico. O centrômero está deslocado
para uma extremidade, criando um braço longo e um curto. (Nos
cromossomos humanos, o braço longo é indicado pela letra q, e o
curto, pela letra p). Acrocêntrico. O centrômero está próximo de
uma extremidade, produzindo um braço longo, e um botão, ou
satélite, na outra extremidade. Telocêntrico. O centrômero está na
extremidade do cromossomo ou muito próximo desta ( Amostras

▪ Sangue Periférico
▪ Medula Óssea: Neoplasias Hematológicas
▪ Fragmento de Pele: Fibroblastos
▪ Líquido Amniótico: Amniócitos
▪ Vilosidade Coriônica
▪ Tumores
▪ Outros tecidos

Obtenção de cromossomos metafásicos

▪ Punção venosa
▪ Meio de cultura para leucócitos (72 horas)
▪ Colchicina: parar o ciclo celular na metáfase
▪ Solução hipotônica (KCl): liberar os cromossomos
▪ Fixação na lâmina
▪ Coloração

Histórico da Citogenética

▪ Eduard Strasburger (1875) e Walter Flemming

(1879 – 1889): termos cromatina, mitose, prófase,
metáfase;
▪ Painter (1923): 48 cromossomos na espécie
humana;
▪ Tjio & Levan (1956): 46 cromossomos na espécie
humana; Uso da colchicina e solução hipotônica;
▪ Nowell (1960): Fitohemaglutinina;
▪ Caspersson et al. (1968): Bandas Q (Quinacrina
mostarda);
▪ Seabright (1971): Banda G (Giemsa).

Caracterização do Cariótipo

▪ Cariótipo Descrição das características do Caracterização do Cariótipo

conjunto cromossômico.
▪ Número Tamanho Posição dos centrômeros
▪ Constrições secundárias
▪ Técnicas de bandeamento: melhor identificação
dos cromossomos
▪ Número de Cromossomos
▪ Número haplóide ou gamético (n)
▪ Número diplóide ou somático (2n) Posição do
Centrômero

Técnicas de Bandeamento

▪ Bandeamento GTG Enzima tripsina para digestão

de proteínas não-histônicas da cromatina, corante
Giemsa para visualização dos cromossomos
▪ Banda Q: Quinacrina mostarda (1970) –
fluorescente;
▪ bandas brilhantes e opacas;
▪ Banda C: Heterocromatina constitutiva (1971);
▪ Banda NOR (RON): Região organizadora de
nucléolos (1973);
▪ nitrato de prata;
▪ Banda R: pré tratamento com calor e coloração
giemsa; reversa à banda G.

Classificação universal de Denver (1960)

 ▪ Trissomia (2n+1) - um cromossomo a mais no
cariótipo.

Indicações para análise dos cromossomos

▪ Problemas precoces de crescimento e ▪ As monossomias são mais deletérias do que as

desenvolvimento trissomias;
▪ Falta e retardo do desenvolvimento, fácies ▪ As monossomias completas geralmente não são
dismórfica, malformações múltiplas, baixa viáveis, exceto pela monossomia do cromossomo
estatura, genitália ambigua, retardo mental. X (Síndrome de Turner);
▪ Natimortos e morte neonatal. Responde por até ▪ As trissomias completas são viáveis para os
10% dos casos. cromossomos 13 (Patau), 18 (Edwards), 21
▪ Infertilidade Responde por 3 a 6% dos casos de (Down), X (Klinefelter) e Y.
infertilidade ou abortos recorrentes.
▪ História Familiar: Anomalia cromossômica
conhecida ou suspeita em parente de primeiro
grau.
▪ Neoplasia Auxílio no diagnóstico ou para
informações prognósticas.
▪ Gestação em idade avançada: Risco aumentado
de anomalias cromossômicas em fetos concebidos
por mulheres com mais de 35 anos.

Mutações Cromossômicas

▪ Mutações Cromossômicas Numéricas – alterações

no número típico de cromossomos
▪ Euploidias – alteração do número haplóide de Alterações Estruturais
cromossomos
▪ Aneuploidias (somias) – adição ou deleção (perda)
de um ou poucos cromossomos “Alterações na estrutura dos cromossomos, podendo
ocasionar a perda de genes, a leitura duplicada ou erros
Euploidias na leitura de um ou mais genes”

▪ Triplóide (3n) e tetraplóide (4n) foram observados
em fetos; não sobrevivem por muito tempo;
▪ 1 a 3% das concepções; maioria resultado da
fertilização por 2 espermatozoides;
▪ maioria não resiste ao primeiro trimestre.
▪ Podem acontecer por deleção, duplicação,
translocação ou inversão de partes de
cromossomos.
Deficiência ou Deleção (del)

Aneuploidias ▪ perda de um pedaço do cromossomo, com

▪ Nulissomia (2n-2) - perda de um par inteiro de
cromossomos. Na espécie humana é letal.
▪ Monossomia (2n-1) - um cromossomo a menos no
cariótipo.
consequente perda de genes;
▪ Indivíduo é monossômico para a informação
genética no segmento correspondente do
homólogo normal (haploinsuficiência).
 Inversão (inv)

▪ quebra de um segmento do cromossomo que se

solda invertido, provocando erros na leitura dos
genes

▪ Pode ser de dois tipos:

Duplicação (dup)

▪ presença de um segmento duplicado do

cromossomo, acarretando uma dupla leitura de
genes Duplicação em 12p: Síndrome de Pallister-
Killian.

▪ Rearranjo balanceado;
▪ normalmente não apresenta um efeito fenotípico
(todo o material cromossômico está presente);
▪ Produção de gametas desbalanceados.
▪ Pericêntrica: o risco de defeitos de nascimento na
prole aumenta com o tamanho da inversão;
▪ Paracêntrica: risco muito baixo de um fenótipo
anormal.
Translocação (t)

▪ troca de segmentos entre cromossomos não

homólogos, provocando erros na leitura.
 Translocação (t) – Pode ser de dois tipos:

Translocação Robertsoniana ou Fusão Cêntrica

Nomenclatura

Translocação: 46,XY,t(4;15)(q11;q22)[20]
Citogenética Molecular

▪ Hibridização in situ Fluorescente (FISH)

▪ Década de 80 Utilização de sondas marcadas com
fluorocromos
Principais tipos de Sondas:

▪ Sondas de Sequências Repetitivas: Centroméricas

e Teloméricas – enumeração de cromossomos e
pesquisa de aneuploidias.
▪ Sondas de Pintura Cromossômica: várias sondas
hibridizando em todo cromossomo
▪ Sondas Gênicas ou de Sequência Única: identifica
uma região específica do cromossomo

▪ Pintura Cromossômica Aberrações estruturais
▪ Sondas Gênicas ou de Sequência Única Rearranjo
gênico, Amplificação Gênica e Mapeamento
▪ Sondas Gênicas ou de Sequência Única
▪ Hibridização Genômica Comparativa (CGH)
SÍNDROMES CROMOSSÔMIC AS
Incidências das anomalias cromossômicas
▪ Neonatos: 1/160 nascimentos
▪ Trissomia 21 (Down) (nascimento)
▪ Trissomia 18 (Edwards) (nascimento)
▪ Trissomia 13 (Patau) (nascimento)
▪ 45, X (Turner) (nascimento)
▪ 47, XXY (Klinefelter) (puberdade)
▪ 47, XYY (puberdade)
▪ 47, XXX (puberdade)
▪ Rearranjos balanceados raramente são
clinicamente identificados
▪ Abortos espontâneos: 40% - 50% 45, X: 20% dos
abortos espontâneos cromossômicamente
anormais;
▪ Trissomia do 16: 1/3 das trissomias entre os
abortos
Imprinting genômico
▪ Imprinting: alterações na cromatina que ocorrem
naturalmente na linhagem germinativa de um dos
genitores, durante a gametogênese;
▪ Marca alguns genes como provenientes da
mãe/pai;
▪ Pode ser metilação da citosina;
▪ Afeta a expressão do gene mas não a sequência
do DNA;
▪ Persiste durante toda a vida (cópia imprintada
não é expressa).
▪ Expressão do fenótipo da doença depende de o
cromossomo anormal ter sido herdado do pai ou
da mãe;
▪ Síndrome de Prader-Willi e Síndrome de
Angelman

Síndrome de Prader-Willi
▪ Obesidade, hábitos alimentares excessivos e
indiscriminados, mãos e pés pequenos, baixa
estatura, hipogonadismo, retardo mental;
▪ Deleção em 15q11-q13 no cromossomo paterno.
Expressa apenas a região do 15 materno.
▪ Aspecto facial incomum, baixa estatura, grave
retardo mental, espasticidade e convulsões;
▪ Em 70% dos casos ocorre deleção da mesma
região no cromossomo 15 materno;
▪ Expressa apenas a região do 15 paterno.
Dissomia Uniparental
▪ Presença de uma linhagem celular dissômica
contendo dois cromossomos herdados de um
único genitor;
▪ 30% dos casos de Prader-Willi (ambos os
cromossomos 15 intactos herdados da mãe);
▪ 5% dos casos de Angelman (ambos os
cromossomos 15 intactos herdados do pai).
Síndrome de Beckwith-Wiedemann:
▪ dissomia uniparental paterna de 11p15;
▪ Fetos grandes ao nascimento, língua aumentada e
protrusão do umbigo, hipoglicemia grave,
neoplasia de rim, adrenal e fígado.
Alterações Cromossômicas e Síndromes Humanas
Síndrome de Down (Trissomia do 21) Frequência na
População – 1/800
▪ Hipotonia Muscular
▪ Hiperflexibilidade articular (boca sempre aberta)
▪ Estatura reduzida
▪ Braquicefalia com a região occipital achatada
▪ Face plana
▪ Epicanto
▪ Pescoço curto
▪ Ponte nasal baixa
▪ Orelhas de baixa implantação
▪ Mancha de Brushfield nos olhos
▪ Retardo psicomotor
▪ Mãos curtas e planas com prega palmar única;
quinto dedo encurvado;
▪ dermatóglifos característicos
▪ Maior separação entre hálux e segundo dedo dos
pés
▪ Cardiopatia congênita (1/3)
▪ Mais comum e bem conhecido distúrbio
cromossômico;
▪ Causa genética mais comum de retardo mental
moderado; Apenas 20 a 25% dos conceptos com
trissomia do 21 sobrevivem ao nascimento;
▪ Menor sobrevida entre os portadores de
cardiomiopatia congênita;
▪ Aumento do risco em 15 vezes em desenvolver
leucemia
▪ Síndrome de Down Trissomia Simples: não
disjunção do cromossomo 21 na meiose materna;
▪ 95% dos casos; Translocação: indivíduos com
síndrome de Down apresentando 2n= 46
cromossomos
▪ 4% dos casos: Envolvendo os cromossomos 14 ou
22
▪ Mosaicismo: indivíduo apresenta um percentual
de suas células normais (2n= 46), e outro com 47
cromossomos 2% dos casos
▪ 2n= 47, XX,+21 (95% dos casos) 90% na meiose
materna;
▪ primeira divisão 10% na meiose paterna;
▪ segunda divisão2n= 47, XX,+21 2n= 46, XY,
rob(14;21) +21 2n= 46, XY, rob(22;21) +21 2n= 46,
XY, t(21;21)
▪ 2n= 46, XY, rob(14;21)
▪ 4% dos casos Não tem relação com idade materna
e Recorrência na família
Síndrome de Patau (Trissomia do 13)
▪ Frequência na População – 1/15.000 a 25.000
▪ Retardo do crescimento e mental graves
▪ Malformações do SNC – arrinencefalia,
holoprosencefalia
▪ Malformação de orelhas
▪ Mãos fechadas com sobreposição do segundo e
quinto dedos
▪ Fenda Labial e/ou Palatina
▪ Polidactilia
▪ Proeminências nos calcanhares
▪ Anomalias Cardíacas
▪ Anomalias urogenitais Metade morre no primeiro
mês de vida Idade materna avançada (não
disjunção do 13 na meiose I)
▪ Translocação não-balanceada: 20% dos casos
▪ 2n = 47, XX, +13
Síndrome de Edwards (Trissomia do 18)
▪ Frequência na População – 1/7.500 95% dos
conceptos são abortados espontaneamente
▪ Retardo mental e do desenvolvimento
▪ Malformação cardíaca
▪ Cabeça com occipúcio proeminente e retrognatia
▪ Orelhas mal formadas e implantação baixa ▪ Boca
e nariz pequenos
▪ Rim duplo ou em ferradura
▪ Esterno curto e dedos sobrepostos
▪ Pés de cadeira de balanço
▪ Dermatóglifos característicos e prega palmar
única 90% vão a óbito nos primeiros seis meses de
vida
▪ Idade materna avançada
▪ Translocação em 20% dos casos
▪ 2n = 47, XX, +18
Síndrome de Cri du Chat (deleção)
▪ Frequência na População – 1/7.000
▪ 1% dos pacientes com retardo mental
▪ Emite choro agudo semelhante a miado de gato
▪ Assimetria facial
▪ Microcefalia
▪ Má formação da laringe
▪ Hipertelorismo ocular (distanciamento dos olhos)
▪ Hipotonia
▪ Epicanto
▪ Orelhas de baixa implantação
▪ Retardamento neuromotor acentuado
▪ Defeitos cardíacos 10% a 15% dos casos
translocação
▪ (deleção terminal ou intersticial em 5p)
▪ 2n=46, XX, 5p-
Síndromes de microdeleção e duplicação
Cromossomo Y
▪ Região pseudoautossômica (recombinação na
meiose I);
▪ Cromossomo Y pobre em genes (50 genes) –
desenvolvimento gonadal e genital;
▪ Desenvolvimento a partir da 6ª semana;
▪ Sequência de genes que leva ao desenvolvimento ▪ Mulheres são mosaicos na expressão de genes
de testículos ou ovários ligados ao X
▪ Gene XIST: regulador da inativação do X RNA não
codificante Ativo no X inativo Inativo no X ativo

Síndrome de Klinefelter (2n=47, XXY)

▪ Frequência na População: 1/1.000

▪ Retardo mental moderado
▪ Pacientes altos e magros
▪ Membros longos
▪ Hipogonadismo
▪ Infertilidade
▪ Ginecomastia
▪ Caracteres sexuais pouco desenvolvidos
▪ Erros na meiose I paterna ou materna
▪ Cariótipo variantes associados a maior gravidade
fenotípica (48, XXYY; 48, XXXY; 49, XXXXY).
▪ (2n=47, XXY)
Síndrome de Turner (Monossomia do X)
▪ Homens XX e mulheres XY: recombinação fora da
região pseudoautossômica; ▪ Frequência na População: ¼.000
▪ Gene SRY: determinação dos testículos Próximo à ▪ Disgenesia ovariana
região pseudoautossômica 1/20.000 nascimentos ▪ Baixa estatura
▪ Gene AZF: espermatogênese 10% dos casos de ▪ Palato estreito
azoospermia não obstrutiva 6% dos casos de ▪ Pescoço curto
oligospermia severa ▪ Tórax largo com mamilos afastados
Cromossomo X ▪ Anomalia cardíaca
▪ Anomalias renais
▪ Inativação do X: silenciamento epigenético ▪ Anomalia de cotovelo
aleatório de um dos cromossomos X nas células ▪ Linfedema fetal
somáticas de mulheres; ▪ (2n= 45, X)
▪ Iguala a expressão de genes ligados ao X nos dois
sexos;
▪ Explica tolerância de anormalidades no
cromossomo X;

ACOMPANHAMENTO GENÉTICO
Consulta Genética:
▪ 1983: portaria do CFM define a Genética
Clínica como especialidade médica;
▪ Portaria nº 199, de 30 de janeiro de 2014:
Política Nacional de Atenção Integral às
Pessoas com Doenças Raras;
▪ Doença rara: acomete até 65 a cada 100.000
indivíduos; de origem genética ou não
genética.
“Processo pelo qual um indivíduo ou família
obtém informações sobre um problema
genético real ou possível”. Informar sobre o
significado de determinados genes para a
saúde e o bem-estar das pessoas.
▪ PROCESSO DE COMUNICAÇÃO sobre os riscos
de ocorrência ou recorrência familial de
doenças ou síndromes genéticas;
▪ Enfoque no paciente original e em outros
membros da família, nascidos e/ou que irão
nascer
Objetivo:
▪ Oferecer informações e apoio a famílias em risco
de vir a ter, ou que já tenham, parentes com
defeitos congênitos ou doenças genéticas;
▪ Consulente: pessoa que busca a consulta
genética;
▪ Probando: membro por meio do qual uma família
com distúrbio genético é averiguada pelo médico
geneticista
▪ Ajudar os familiares a: Compreender o
diagnóstico, o curso da doença e medidas de
controle existentes;
▪ Entender como a hereditariedade contribui para a
doença e risco de recorrência;
▪ Entender as opções para lidar com o risco de
recorrência;
▪ Identificar os valores, crenças, objetivos e
relações afetados pelo risco ou presença da
doença;
▪ Escolher o curso de ação mais adequado;
▪ Receber os encaminhamentos aos especialistas e
grupos adequados.
Abordagem Genérica
Etapas
ANAMNESE (questionário verbal)
▪ Identificação do paciente, motivo da consulta;
▪ História familiar (heredograma: 3 gerações,
consanguinidade, doenças genéticas, defeitos
congênitos, RM, abortos, partos prematuros,
etnia da família);
▪ Idade dos pais concepção;
▪ Idade de aparecimento dos sintomas;
▪ História gestacional e dos antecedentes perinatais
(medicamentos, drogas, doenças infecciosas);
▪ Tipo de parto e avaliação do RN (boletim de
Apgar);
▪ Medidas antropométricas no nascimento;
▪ Desenvolvimento neuropsicomotor, sociabilidade,
escolaridade e perfil comportamental da criança.
HEREDOGRAMA Registra graficamente a história
genealógica de uma família e permite:
▪ Compreensão rápida das relações de parentesco
entre diversos membros de uma genealogia
▪ Verificar se há doença genética/hereditária na
família:
▪ -A doença se manifesta em um único caso
(esporádico) ou se repete.
▪ -Qual a distribuição dos casos afetados segundo o
sexo?
▪ -Qual a ordem de nascimento dos doentes nas
irmandades?
▪ - Qual a fertilidade dos casais? Abortos?
▪ Averiguar a ocorrência de casamentos
consanguíneos e sua relação com a manifestação
da doença?
▪ Qual a ascendência étnica?
EXAME CLÍNICO
▪ Aspecto geral: impressão geral do paciente
▪ Medidas antropométricas: peso, estatura,
perímetros e pregas (Tabelas e Gráficos de
referência para parâmetros físicos)
▪ Pele e anexos
▪ Crânio e couro cabeludo
▪ Face: geral, olhos e região orbitária, pavilhão
auricular, nariz, filtro e boca
▪ Pescoço
▪ Tórax
▪ Abdome
▪ Genitália externa e períneo
▪ Membros
▪ Coluna
EXAMES COMPLEMENTARES
▪ Solicitação de exames de cariótipo, moleculares,
bioquímicos, etc
HIPÓTESES DIAGNÓSTICAS
▪ Estabelecer se o problema é genético: >
cromossômico; > monogênico;
▪ poligênico ou multifatorial;
▪ causa ambiental
▪ Estabelecer o padrão de herança e risco de
recorrência
LAUDO
▪ Relatório por escrito com o diagnóstico da doença
e informações relevantes sobre:
▪ quadro clínico, causa, prognóstico e evolução da
doença;
▪ tratamentos disponíveis:
▪ risco de recorrência e necessidade de investigação
de outros membros da família em risco ou de
diagnóstico pré-natal em futuras gestações;
▪ Avaliar o que os consulentes entenderam;
▪ Se necessário encaminhar para acompanhamento
com psicólogo
▪ Acompanhamento periódico
Equipe multidisciplinar:
▪ Médico Geneticista,
▪ Médicos (pediatra, ginecologista, neurologista,
outras modalidades),
▪ Psicólogo,
▪ Assistente social,
▪ Nutricionista,
▪ Enfermeiro
Unidades de apoio:
▪ Genética Clínica: unidade central, para onde os
pacientes são encaminhados, se realizam os
primeiros contatos, entrevista, são levantadas as
hipóteses- diagnósticas, dadas as orientações,
pedidos de interconsultas e exames.
▪ Citogenética e Biologia Molecular: técnicas que
possibilitem a identificação de doenças
cromossomicas (cariótipo) e alterações gênicas
▪ Bioquímica: exames para detecção de erros inatos
do metabolismo, dosagens hormonais, etc
▪ Hematologia: investigação de hemoglobinopatias,
coagulopatias, hemogramas, etc
▪ Imunologia: investigação de infecções capazes de
provocar anomalias congênitas, como
toxoplasmose, sífilis, rubéola e citomegalovírus
▪ Outras unidades: radiologia, oftalmolgia,
psicologia, etc.
NÃO DIRETIVA!
Não se diz aos pacientes que decisões tomar
em relação aos exames e opções de conduta;
Informações e apoio aos pacientes, para que
estes cheguem a uma decisão apropriada;
Direito de cada casal fazer suas escolhas sobre
reprodução, livre de coerção.
Compromissos na consulta genética
▪ Neutralidade moral do aconselhador: informações
genéticas isentas de valores pessoais ou
julgamentos que possam alterar ou direcionar sua
compreensão
▪ Não-diretividade do aconselhamento:
aconselhador não deve impor suas preferências,
mas, sim, cuidar que as escolhas de seus
pacientes sejam informadas e esclarecidas
▪ Privacidade e confidencialidade da informação
genética

Medidas para controle de recorrência

▪ Casais com risco de terem filhos com doença

hereditária:
▪ Exames genéticos laboratoriais;
▪ Contracepção ou esterilização;
▪ Adoção;
▪ Inseminação artificial (ovócitos II ou esperma
doado);
▪ Diagnóstico pré-implantação;
▪ Interrupção da gravidez (quando possível).

Determinação dos riscos de recorrência

▪ Doença monogênica: determinação de risco a
partir de princípios mendelianos básicos.
▪ A: mutação nova em III 1. Parentes femininos não
tem risco significativo de serem portadoras;
▪ B: mutação nova em II 1. Filha III 2 tem risco de ½
de ser portadora; neta IV 1 tem risco de ¼ de ser
portadora;
▪ C: I 1 e II 1 são portadoras do alelo. Todos os
parentes femininos tem risco de ½ ou ¼ de serem
portadoras.

▪ Penetrância reduzida, expressividade variável,

▪ Risco empírico de recorrência: doenças
mutação nova: risco mendeliano associado a
poligênicas, complexas e/ou multifatoriais;
probabilidade condicional;
▪ Fendas labial e palatina, meningomielocele,
▪ Genótipos dos indivíduos relevantes na família
doenças psiquiátricas, etc;
não podem ser inferidos com certeza;
▪ Risco de recorrência em parentes de primeiro
▪ Risco de recorrência muda se esses indivíduos
grau de indivíduos afetados pode ser aumentado
portarem um alelo normal de um gene de doença.
em comparação ao histórico de incidência da
▪ Análise Bayesiana: probabilidade relativa de duas
doença na população, mas não ao nível esperado
ou mais possibilidades alternativas, por exemplo,
para doenças monogênicas;
se uma pessoa possui ou não um alelo mutado;
▪ Estudar várias famílias com a doença e observar
▪ Em certas situações é possível testar diretamente
quão frequentemente ela recorre.
o alelo mutado.

Consulta genética no câncer hereditário
▪ Importância da identificação de indivíduos em
risco:
▪ Risco de desenvolver câncer
▪ Identificação de familiares em risco
▪ Medidas de rastreamento / preventivas
▪ Identificação de famílias portadoras:
▪ Rastreamento – mamografia, ultrassom,
colonoscopia, ressonância...
▪ Medidas preventivas:
▪ Cirurgias Profiláticas: mastectomia, ooforectomia
, colectomia
▪ Quimioprevenção (Tamoxifeno)
▪ Drogas-alvo = inibidores de PARP
▪ MUTAÇÕES EM GENES DE REPARO
▪ Síndrome de Câncer de Mama e Ovário
Hereditários
▪ Síndrome de Câncer Colorretal Hereditário sem
Polipose ou Síndrome de Lynch
▪ Polipose associada ao MUTYH
▪ MUTAÇÕES EM GENES DO CICLO CELULAR
▪ Síndrome de Li-Fraumeni
▪ Polipose Adenomatosa Familiar
▪ Etapas:
▪ História familiar
▪ Diagnóstico
▪ Estimativa de risco
▪ Teste genético
▪ Estratégias de vigilância / redução de risco
▪ Quando suspeitar:
▪ História familiar positiva
▪ Idade precoce de aparecimento
▪ Tumores bilaterais em órgãos duplos
▪ > 1 tumor primário em um paciente
▪ Aspecto multifocal do tumor
▪ Câncer em indivíduo com anomalia congênita
e/ou do desenvolvimento
▪ AG oncológico com teste genético preditivo:
▪ Necessário realizar consultas genéticas préteste e
pós-teste.
▪ Necessidade de avaliação psicológica
▪ A quem deve ser oferecido?
▪ > 10% risco de ser portador de mutação em gene
de SPHC (ASCO e ASHG)
▪ Consulta Genética Pré-teste:
▪ Diagnóstico e propósito do teste
▪ Estimativa de risco
▪ Possíveis resultados do teste genético: positivo,
negativo, inconclusivo
▪ Transmissibilidade da mutação
▪ Risco de estresse psicológico
▪ Risco de discriminação
▪ Opções de prevenção / manejo
▪ Confidencialidade
▪ Opção pela não realização do teste
▪ Teste Genético:
▪ Sensibilidade: Número de indivíduos com uma
dada doença que testam positivo em um dado
teste.
▪ Especificidade: Frequência com a qual um
resultado de teste é negativo quando a doença
está ausente.
▪ Valor preditivo:
▪ Positivo: probabilidade de ocorrência de doença
em vista de um teste positivo.
▪ Negativo: probabilidade de não ocorrência da
doença em vista de um teste negativo
▪ Consulta Genética Pós-teste:
▪ Resultado do teste genético e suas implicações
▪ Estratégias de prevenção e manejo
▪ Suporte e aconselhamento
Consulta genética pré-natal
▪ INDICAÇÕES
▪ História familiar
▪ Infertilidade/esterilidade
▪ Idade materna/paterna avançada
▪ Aborto/perda fetal
▪ Teratógeno
▪ Consanguinidade
▪ Pré-natal
▪ OBJETIVOS
▪ Detectar anomalias no feto
▪ Informar/ educar o casal com risco aumentado
▪ ANOMALIAS CROMOSSÔMICAS
▪ Doenças gênicas
▪ Doenças cromossômicas
▪ Retardo mental
▪ Câncer
▪ ABORTO
▪ EXPOSIÇÃO A TERATÓGENOS
 ▪ Análise molecular

TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR E SUAS

APLICAÇÕES NA MEDICINA

TÉCNICAS EM BIOLOGIA E GENÉTICA MOLECULAR

▪ QUAIS SÃO AS TÉCNICAS/OS TESTES QUE

▪ INFERTILIDADE
▪ Translocação balanceada
▪ Anomalia de cromossomos sexuais
▪ Doenças gênica
▪ CONSANGUINIDADE
▪ PRÉ-NATAL
▪ Ultrasonografia
▪ Translucência nucal (11-13 sem)
▪ Punção de VC (10-12 sem)
▪ Amniocentese precoce (12-14 sem)
▪ Amniocentese tradicional (16-18 sem)
▪ Teste do risco fetal (perfil bioquímico)
POSSUEM APLICABILIDADE DIAGNÓSTICA?
▪ QUAIS SÃO AS TÉCNICAS QUE POSSUEM
APLICABILIDADE TERAPÊUTICA?
▪ SEQUENCIAMENTO GENÉTICO
▪ EXOMA
▪ DESENVOLVIMENTO DE IMUNOTERAPIAS TERAPIA
DO DNA RECOMBINANTE
▪ QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA (PCR)
▪ IMUNOENSAIOS (Western blot,
imunohistoquímica, imunofluorescência, ELISA,
etc)
Sequenciamento de Genomas
“Método para identificar a ordem de
nucleotídeos do material genético de um
organismo”

▪ Metodologia do Sequenciamento
▪ US morfológico (17-20 sem)
▪ Frederick Sanger (1977), Inglaterra;
▪ Cordocentese (> 18 sem)
▪ Prêmio Nobel
▪ Ecocardiograma fetal (> 20 sem)
▪ Síntese de DNA in vitro por término didesoxi.
▪ NIPT (non-invasive prenatal testing)
▪ Utilização de enzimas de restrição para gerar
▪ PRIMEIRO TRIMESTRE
fragmentos de DNA menores.
▪ 11-14 semanas
▪ PAPP-A (proteína A plasmática associada a
Os fragmentos de DNA podem ser separados e
gestação) e fração livre do beta-HGC.
seus tamanhos podem ser determinados com
▪ Identifica, mas não confirma 75% dos casos de
o uso de eletroforese em gel. Os fragmentos
Síndrome de Down
podem ser visualizados ao usar um corante
▪ SEGUNDO TRIMESTRE
específico para ácidos nucleicos ou marcar os
▪ 15-18 semanas fragmentos com um corante químico
▪ Alfa-fetoproteína, beta-HGC, estriol não
conjugado
▪ Identifica 63% dos casos de S. Down, 85% dos
casos de espinha bífida aberta e 100% dos
casos de anencefalia
▪ INDICAÇÃO DO ESTUDO CROMOSSÔMICO
▪ Idade materna > 35 anos
▪ Filho anterior com anomalia cromossômica
▪ Translocação balanceada em um dos pais
▪ Ansiedade do casal
▪ Triagem pré-natal alterada
▪ MFC no US do pré-natal
▪ TESTE PARA EIM
▪ Atividade enzimática
▪ Medida do substrato acumulado
 1986- automatização do método de Sanger
Qual a aplicabilidade do método de Sanger?
▪ O sequenciamento de Sanger é usado
clinicamente quando a sequência de um gene
específico está sendo testada.
▪ É o tipo de sequenciamento de escolha quando as
mutações já são conhecidas e o teste genético
serviria para comprovar a hipótese diagnóstica.
▪ Exemplo: mutação no fator IX em paciente com
suspeita de hemofilia B;
▪ avaliação de mutações específicas para propensão
a câncer familial (exemplo: caso Angelina Jolie,
mutação em BRCA1)
▪ Não é útil quando se precisa analisar múltiplos
genes pelo custo e pelo tempo empregado.
Projeto Genoma Humano
▪ 1990 – Lançamento do projeto genoma humano
▪ Mapa genético e físico detalhado dos
cromossomos humanos.
▪ Sequenciamento de todos os 3,2 bilhões de pares
de nucleotídeos.
▪ 5000 cientistas
▪ 250 diferentes laboratórios
▪ 2003: 99% do genoma humano com uma precisão
de 99,99%
▪ James Watson = primeiro diretor do projeto.
▪ John Craig Venter (bioquímico, geneticista e
empresário):
▪ Perkins-Elmer Corp
▪ 1000 genomas das mais diversas etnias foram
sequenciados
▪ Catálogo aberto utilizado para a avaliação dos
pacientes via bioinformática.
▪ Os geneticistas podem associar variação
estrutural com doenças específicas. "Pode ser que
se eu tiver uma cópia extra do gene A, a minha
propensão para X doença pode ser maior ou
menor.” Procurar variantes estruturais em
comum. Se uma dada variante contribuir para
uma doença, vai ocorrer em uma frequência
maior em pessoas com a doença.
2005 – Sequenciamento de nova geração NSG – next
generation sequencing Pirossequenciamento
▪ Como funciona?
▪ Adição de cada base
▪ Medida da emissão de fosfato
▪ A base que não encaixar na fita será degradada
▪ baseia-se na síntese de DNA: os nucleotídios são
adicionados um por vez na ordem especificada
pelo DNA molde, e a adição de um nucleotídio
específico é detectada por um flash de luz, gerado
à medida que o nucleotídio é adicionado
Os métodos de sequenciamento de próxima e terceira geração
sequenciam muitos fragmentos de DNA simultaneamente e
fornecem uma determinação mais rápida e menos onerosa de
uma sequência de bases de DNA do que o método de
sequenciamento de Sanger.
Pirossequenciamento

PROJETO HAPMAP HUMANO

▪ Cientistas de todo o mundo iniciaram o

International Human HapMap Project com o Sequenciamento de nova geração
objetivo de caracterizar as semelhanças e
▪ Nos anos seguintes, vários métodos de nova
diferenças em genomas humanos do mundo todo.
geração surgiram ao mesmo tempo:
▪ Iniciou com o sequenciamento de 62 pessoas (62
▪ métodos de segunda geração como Ion
projetos genoma humano)
Torrent e Illumina;
▪ 269 pessoas foram sequenciadas até 2005
▪ e de terceira geração como o Pacific
PROJETO 100O GENOMAS Biosciences e o Oxford Nanopore. Apesar das
diferenças consideráveis entre eles, todos têm
▪ Lançado em 2008 e finalizado em 2015.
 como principal característica o
processamento paralelo massivo de
fragmentos de DNA. Enquanto um
sequenciador que utiliza eletroforese
processa, no máximo, 96 fragmentos por vez,
os sequenciadores de nova geração podem ler
até bilhões de fragmentos simultaneamente.
▪ EXOMA
▪ SEPARAÇÃO E AVALIAÇÃO APENAS DOS
EXONS.
▪ Também é considerado um tipo de
sequenciamento de nova geração
▪ Em todas as plataformas NGS, há tipicamente
uma etapa de preparação de amostra ou
"preparação de biblioteca" na qual o DNA do
paciente, que serve como molde, é purificado,
amplificado e fragmentado, seguido de
isolamento físico de fragmentos de DNA por
fixação a superfícies sólidas ou pequenas esferas .
▪ Os dados de sequência são gerados nesses
pequenos fragmentos e os resultados eletrônicos
são alinhados computacionalmente contra um
genoma ou sequência de "referência" (isto é, um
genoma sequenciado anteriormente designado
como uma referência "normal").
▪ Uma versão atualizada de um genoma de
referência humano comumente usado, GRCh38,
foi lançada pelo National Center for Biotechnology
Innovation (NCBI) em 24 de dezembro de 2013.
(UP TO DATE, 2020)
Sequenciamento/Exoma: qualquer alteração deve
ser motivo de preocupação?
▪ Uma variante em relação ao genoma de
referência suscita uma questão: esta diferença
não estaria relacionada ao fato de se estar
comparando o genoma de um brasileiro com a de
um indivíduo de outro background genético?
▪ É uma possibilidade que deve ser considerada.
▪ Este fato o levou a julgar de extrema importância
a montagem de um banco de variantes da
população brasileira. Mesmo porque uma
mutação frequente na população do Brasil pode
não ser patogênica e podem estar sendo feitas
associações equivocadas em relação à genética de
outros povos. Daí a importância da geração de
banco das alterações comuns na população
brasileira.
Sequenciamento Avaliação do médico geneticista
▪ Mais de 20 mil genes são analisados em um
sequenciamento genético automatizado.
▪ A análise é realizada a partir da comparação do
genoma daquele paciente com um banco de
dados de genomas, por bioinformática de alta
complexidade.
▪ O médico geneticista filtra aqueles genes que
podem ser significativos (que já foram associados
ao quadro clínico do paciente) e analisa apenas
aqueles determinados genes.
▪ Exemplo: câncer de mama = genes BRCA1 e
BRCA2, além de outros genes supressores de
tumores ou oncogenes.
Aplicações Clínicas
Qual a finalidade do sequenciamento de nova geração e do
exoma?
Quando solicitar um sequenciamento de segunda geração
(Sanger) ou um sequenciamento de nova geração ou um
exoma?
Qual a finalidade do sequenciamento e do exoma?
▪ Encontrar mutações
Indicações clínicas para o seq de nova geração ou
exoma
▪ Suspeitas de doenças com caráter genético, que já
foram investigadas por outras metodologias,
porém sem conclusão;
▪ Desordem genética de origem desconhecida;
▪ Casos de apresentações clínicas atípicas, com
sobreposição de sinais e sintomas, que podem ser
causados por mutações ainda não descritas em
genes conhecidos;
▪ Doenças com heterogeneidade genética, ou seja,
certas doenças podem ser determinadas por
mutação em mais de um gene.
▪ Predisposição genética para determinada doença,
visando a prevenção.
Vantagens do exoma
▪ Em contraste com técnicas usuais de
sequenciamento de DNA em que é analisado um
único gene ou fragmentos deste, o
sequenciamento do Exoma realiza uma varredura
no DNA do indivíduo, analisando de forma
simultânea os éxons de aproximadamente 25.000
genes (180.000 exons) utilizando a tecnologia de
sequenciamento de nova geração - NGS. Este
exame é capaz de analisar de forma simultânea,
aproximadamente 93 a 97% de todos os genes
relacionados às questões médicas.
▪ Investiga as regiões mais informativas do genoma,
já que a maioria das mutações (85%) causadoras
de doenças genéticas com padrão de herança
familiar ocorre nos éxons;
▪ Fornece uma solução diagnóstica mais rápida e de
maior custobenefício, uma vez que os éxons
correspondem a aproximadamente 1,6% de todo
o genoma;
▪ Analisa a maioria dos genes ao mesmo tempo,
sendo capaz de identificar mutações em genes
responsáveis por síndromes e diagnósticos raros;
▪ Possibilita a reanálise dos dados em investigações
futuras;
▪ Permite o aconselhamento genético do paciente
e da família para futuras gestações.
NSG ou exoma
▪ Diagnóstico de doenças complexas - a
consideração de NGS como uma ferramenta
clínica (por exemplo, para diagnóstico genético) é
apropriada em indivíduos para os quais o
sequenciamento de um único gene
provavelmente não fornecerá um diagnóstico.
▪ Os exemplos incluem suspeitas de doenças
genéticas nas seguintes configurações:
▪ Um dos muitos genes potenciais pode ser o
responsável e / ou o médico não sabe que gene
(s) testar porque muitos genes diferentes causam
o mesmo fenótipo (por exemplo, devido à
heterogeneidade genética).
▪ Genes candidatos óbvios foram testados e
considerados normais. Isso é especialmente
aplicável quando a porcentagem de doença
atribuída a esses genes candidatos é baixa, e
outros genes potencialmente causadores do
distúrbio existem, mas ainda não foram
identificados. Essas análises são frequentemente
auxiliadas pela comparação dos resultados NGS
de membros da família afetados e não afetados.
Imunoterapia específica para neoantígenos
▪ Isolar DNA e RNA de células normais e tumorais
do paciente
▪ Realizar o exoma
▪ Reconhecer peptídeos ou minigenes dos
neoantígenos
▪ Neoantígenos são utilizados para estimular APCs
▪ Linfócitos infiltrados do tumor do paciente são
isolados e estimuladas com as APCs: produção de
células T específicas para o neoantígeno.
▪ Seleção de células T do paciente que já são
responsivas ao neoantígeno e expansão das
mesmas
▪ Síntese de vacinas com peptídeos do neoantígeno
Quando solicitar o sequenciamento?
▪ Sequenciamento:
▪ Confirmação diagnóstica de doença genética que
envolve uma mutação conhecida (teste específico
para a mutação)
▪ Quando houver probabilidade de mutação em
regiões não genicas ou introns
 Terapia do DNA Recombinante
A principal aplicação da terapia do DNA recombinante é a
terapia gênica. A terapia gênica é a transferência direta dos
genes nos humanos para tratar doenças. Ela foi implantada
com sucesso em 1990 e agora é usada para tratar doenças
genéticas, câncer e doenças infecciosas.
Biblioteca Genômica
▪ Coleção de fragmentos de DNA recombinantes
que representa o genoma completo de um
organismo;
▪ Bibliotecas de cDNA (expressão)
Um método para encontrar um gene é criar e rastrear uma
biblioteca de DNA. Uma biblioteca genômica é criada pelo
corte do DNA genômico em fragmentos sobrepostos e pela
clonagem de cada fragmento em uma célula bacteriana
separada. Uma biblioteca de cDNA é criada a partir do mRNA
que é convertido em cDNA e clonado nas bactérias.
Aplicações da TDR
▪ Expressão de proteínas humanas em bactérias ou
células eucarióticas para produção em grande
escala, purificação e utilização em pacientes;
▪ Insulina ® 1º produto comercial obtido pela TDR
(1982). Vantagem de eliminar contaminantes ou
agentes infecciosos.
▪ GH – tratamento do nanismo hipofisário, causado
pela deficiência de hormônio do crescimento
humano.
▪ Anticoagulante TPA (ativador de plasminogênio
tipo tecidual), fator VIII de coagulação e
eritropoietina (estimula a produção de
eritrócitos).
▪ Imunoglobulinas (pacientes com
imunodeficiências congênitas –
agamablobulinemia ligada ao X, deficiências em
células B, etc..)
▪ Interleucinas
▪ Terapia gênica por transfecção de células do
paciente com retrovírus, ou outros tipos de vírus,
para introduzir um gene normal em caso de
doenças.
▪ Primeira terapia gênica (1990)
▪ Deficiência da adenosina desaminase, com
implantação de linfócitos T transfectados com
retrovírus expressando a proteína ausente nos
doentes.
▪ Imunodeficiências (em teste atualmente) Ex.
Doença granulomatosa crônica – NADPH oxidase
▪ Para quantificações de expressão gênica: PCR
(Protein Chain Reaction) Real Time
▪ Reação em cadeia da polimerase u Identifica o
número de cópias de determinado gene em uma
quantidade “x” de amostra.
▪ Análise de DNA (geralmente usado para analisar
presença de virus ou outros microrganismos) ou
de RNAm (usado para avaliar a expressao de
determinado gene humano. Ex. IgG.)
▪ Utilizado em infecçõeses bacterianas quando as
bactérias são de difícil cultivo, como Chlamydia
trachomatis e Neisseria gonorrhoeae
▪ Utilizado para diagnóstico e prognóstico de
diversas doenças (COVID-19, Hepatite B, AIDS,
etc…)