UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHÃO-UEMA

CENTRO DE CIENCIAS AGRÁRIAS

CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA
DOCENTE:GISELLE CUTRIM
DISCENTE :BEATRIZ SOPHIA CORDEIRO CUNHA FERREIRA

MÉTODOS DE ESTUDO E DIAGNÓSTICO DE VÍRUS

Com os avanços biotecnológicos no campo da virologia é possível descrever os efeitos, detectar

partículas virais, isolar vírus em cultivo celular, detectar componentes virais e avaliar resposta imune
por meio de inúmeros ensaios laboratoriais. Destacam-se tais métodos:
isolamento e identificação do vírus em cultura de células; sorologia para detecção de antígenos virais
e/ou anticorpos específicos produzidos pelos hospedeiros em resposta à infecção viral; detecção direta
da partícula viral; amplificação de ácidos nucleicos.
1.Isolamento e identificação viral
No isolamento viral, a escolha do sistema de propagação para o vírus pesquisado é o determinante
essencial. Uma vez o vírus inoculado no sistema hospedeiro suscetível, o vírus provoca alterações
morfológicas denominadas efeitos citopáticos (CPE, do inglês cytopathogenic effect) que são
observadas como alterações na morfologia de células individuais ou em grupo de células induzidas
pela infecção viral. Diversos sistemas hospedeiros têm sido utilizados para a propagação de vírus em
laboratório como animais de experimentação, ovos embrionados e cultura de células (Santos, 2015).
2.Animais de laboratório
A propagação viral em animais de laboratório tem sido substituída com o advento do cultivo celular
no diagnóstico das infecções virais. Entretanto, podemos citar o uso de camundongos recém-nascidos
utilizados no diagnóstico do vírus da Raiva quando inoculados pela via intracerebral (Kimura &
Joeler, 2019), coelhos da linhagem Nova Zelândia inoculados experimentalmente com peptídeos
sintéticos (Simões et al., 2014) e pesquisas envolvendo primatas não-humanos, como os chimpanzés
que podem ser utilizados em ensaios de neurovirulência para o desenvolvimento de vacinas.
3.Ovos embrionados
Os ovos embrionados foram o sistema hospedeiro de escolha para a propagação de muitos vírus até a
década de 1950. A observação da propagação viral em ovos embrionados pode ser realizada a partir
da técnica de hemaglutinação (HA) no líquido amniótico ou alantoico, ou mesmo a partir da
visualização de lesões esbranquiçadas e/ou hemorrágicas denominadas pocks na membrana
corioalantoica, uma vez que a escolha da via de inoculação bem como a idade do embrião são
determinadas pela especificidade do vírus a ser isolado (Santos, 2015).
4.Cultura de células
Por sua vez, a propagação viral em cultura de células geralmente em linhagens bidimensionais (2D)
são classificadas com base na morfologia epitelial ou fibroblástica, e de acordo com a sua capacidade
de aderência a uma superfície formando uma monocamada ou expandindo em suspensão no meio.
Além disso, as linhagens celulares também podem ser classificadas conforme o tipo de cultivo como
sendo células primárias, culturas diploides, linhagens contínuas, culturas clonadas e estirpes derivadas
de espécies animais.As culturas de células primárias também chamadas de culturas finitas, de
diferentes origens têm sido usadas para o desenvolvimento de vacinas produzidas com vírus
atenuados ou inativados. Contudo, a tendência é a substituição para culturas celulares diploides que
são provenientes do subcultivo de células primárias com a vantagem de até 100 vezes mais de divisão
celular antes de entrar na fase de senescência. Por sua vez, as linhagens de células contínuas ou
imortais apresentam crescimento ilimitado e são derivadas do cultivo primário de células de tumor de
origem humana ou animal tais como a linhagem de células HeLa (Santos, 2015).
Ademais, existem as culturas clonadas que é gerada a partir de uma população de células derivadas
de uma única célula (clone) com base na expressão de características específicas de interesse. Em
contraste, existe a metodologia de cultura de células tridimensionais (3D) demonstrando maior
semelhança com o comportamento fisiológico das células in vivo e heterogeneidade celular (Sousa,
2016).
.Diagnóstico sorológico das infecções virais:
Dentre os métodos sorológicos utilizados na virologia destacam-se:
1.Teste de neutralização
O teste de neutralização por redução de placas pode ser utilizado para identificação do antígeno viral
ou para avaliação do nível de anticorpos. Experimentalmente, amostras de soro de primatas não-
humanos que receberam ou não anticorpos monoclonais foram investigados quanto a capacidade de
neutralizar o vírus Zika
2.Imunofluorescência
A técnica de imunofluorescência utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes para revelar
a formação de um imunocomplexo vírus-anticorpo. Existem dois tipos de imunofluorescência: direta
(usada para identificação de muitos antígenos virais) e indireta (usada para identificação de antígenos
ou anticorpos). Um exemplo clássico do vírus da Raiva é a detecção direta com o uso do fluorocromo
que ao ser excitado por uma luz ultravioleta emite uma fluorescência verde-amarelo brilhante
permitindo a visualização de antígenos virais rábicos (Kimura & Junior, 2019).
3.Imunoenzimático
A reação imunoenzimática também denominada ELISA envolve as etapas de formação de
imunocomplexo (antígeno-anticorpo), adição do conjugado (anticorpo-enzima), sucessivas lavagens e
posterior revelação (adição do substrato e reação de cor). A leitura do ensaio é realizada pela
absorbância após a adição da solução de interrupção através do espectrofotômetro.
4.Imunocromatográfico
O teste imunocromatográfico também chamado lateral, ocorre por capilaridade em uma membrana de
nitrocelulose pelo fluxo lateral da amostra. É um teste rápido e de fácil detecção com diversas opções
disponíveis comercialmente. A interpretação do resultado é simples sendo considerado positivo
quando as duas linhas (teste e controle) são detectadas indicando que o vírus presente na amostra
reagiu com o conjugado formando um imunocomplexo. Nova reação ocorre com um outro anticorpo
vírus-específico gerando uma banda visível. Por outro lado, o resultado é negativo quando somente a
linha controle estiver visível e no caso de nenhuma linha ser visualizada, o teste deverá ser invalidado
(Santos, 2015).
5.Immunoblotting ou Western blotting
Immunoblotting é um teste altamente sensível e específico gerando interpretações subjetivas em
alguns resultados. Consiste na separação de proteínas virais por eletroforese em gel de poliacrilamida
(PAGE) contendo o detergente duodecil sulfato de sódio (SDS). As proteínas são transferidas para
uma membrana de nitrocelulose para detecção de anticorpos conjugados com enzima e posterior
revelação do substrato associado a um cromógeno.
.Diagnóstico molecular das infecções virais
1.Reação em cadeia da polimerase
A reação em cadeia da polimerase, PCR, é uma técnica que amplifica sequências específicas do ácido
nucleico. Se o genoma é um RNA viral, é necessário converter em DNA complementar (cDNA)
utilizando a enzima transcriptase reversa (RT-PCR) para iniciar o processo de amplificação em escala
exponencial. A reação cíclica de PCR envolve três etapas clássicas: desnaturação das fitas de DNA,
hibridização dos oligonucleotídeos à sequência alvo, e extensão das fitas pela ação da DNA
polimerase usando os dNTPs (desoxinucleotídeos trifosfato) como substrato da reação. A enzima
DNA polimerase extraída da bactéria Thermus aquaticus, denominada Taq-polimerase é usada para
adicionar os desoxirribonucleotídeos a um pequeno segmento de DNA, ou primer, que dirige a síntese
do novo segmento de DNA sobre o molde onde o primer se ligar. O DNA das linhagens SiHa e HeLa
naturalmente infectadas com HPV-16 e HPV-18, respectivamente tem sido usadas como controle
positivo da reação de PCR para detecção molecular do papilomavírus usando os oligonucleotídeos
consensus MY09/11 direcionados para o gene ORF L1 amplificando um fragmento de 450 bp
(Simões et al., 2016).
2.RNA-sequencing
O RNA-sequencing (RNA-seq) é uma técnica que analisa a quantidade de sequências de RNAs em
uma amostra usando a plataforma NGS. Em outras palavras, a análise do transcriptoma destina-se ao
perfil de todos os RNAs, incluindo mRNA, rRNA e tRNA para mensurar a expressão de genes
simultaneamente (expressão gênica diferencial), capaz de identificar os genes que estão sendo mais
expressos (up regulated) ou menos expressos (down regulated) em um determinado momento dos
processos biológicos (Kremer, 2019).
3.Clonagem
O avanço de técnicas que permitiram a manipulação do DNA revolucionou a biologia molecular. A
clonagem é uma técnica que consiste em isolar um fragmento de DNA e inserir em outra célula
hospedeira, com capacidade de replicação independente resultando em uma molécula de DNA
recombinante. Geralmente o isolamento e a caracterização de genes específicos têm sido inseridos em
vetores plasmidiais. Conceitualmente, plasmídeo é um DNA circular extracromossômico presente em
bactérias contendo genes de resistência a determinados antibióticos. O plasmídeo recombinante
carreando o gene de interesse é inserido em uma bactéria transformada após sofrer o processo de
choque térmico ou eletroporação. O sucesso das clonagens pode ser conferido com as enzimas de
restrição também chamadas de endonucleases que funcionam como tesouras genéticas com
capacidade de reconhecer e clivar sítios específicas do DNA.

REFERÊNCIA

Kimura, L.M.S., Junior, J.V.D. Raiva. In: Virologia Humana e Veterinária. Simões, R.S.Q (ed).
Thieme Revinter: Rio de Janeiro, p: 305-316, 2019.
Kremer, F.S. Análise de expressão gênica diferencial com RNA-seq (reference-guided). Omixdata,
2019.
Santos, N.S.O. Diagnóstico Laboratorial das Viroses. In: Virologia Humana. 3ed. Santos, N.S.O.,
Romanos, M.T.V., Wigg, M.D (Eds). Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, p: 101-140, 2015.