Ciclo celular e

Replicação do DNA
PROFª. ALEXANDRA AMARAL
Dogma central da Biologia Molecular
 Ciclo celular
Processo em que uma célula-
mãe origina duas células-filhas
contendo cromossomos idênticos
aos da progenitora
Função: crescer, recuperar
órgãos e tecidos lesionados e até
mesmo fazer o cabelo aumentar
de tamanho
 Ciclo celular

Mitose
Divisão
Ciclo celular
Citocinese
celular
Intérfase
 Intérfase
Período mais longo do Ciclo celular
Filamentos de DNA descondensados no interior do núcleo
DNA em atividade = produção de RNA = síntese de proteínas
Replicação do DNA se preparando para a próxima divisão
Célula cresce
Fases da Intérfase
 Fases da Intérfase
Fase O:
 representa uma “pausa” no ciclo celular. Células que já atingiram um estágio
final de desenvolvimento e não precisam mais se dividir
Fase G1:
 Começa a preparação para a divisão celular! Nesta fase, as células aumentam
de tamanho, produzem RNA e sintetizam proteínas
Fase S:
 O nome “Fase S” vem do fato de que, neste momento, ocorre a síntese de
DNA, para que ambas as células-filhas fiquem com a mesma quantidade de
material genético da célula-mãe.
 Fases da Intérfase
Fase G2:
 No intervalo entre a síntese de DNA (Fase S) e a mitose, a célula continua a
crescer em tamanho e a produzir proteínas.

Fase M:
 No intervalo entre a síntese de DNA (Fase S) e a mitose, a célula continua a
crescer em tamanho e a produzir proteínas. Ao final, um novo checkpoint irá
decidir definitivamente se ela poderá entrar ou não em mitose.
 Frequência das divisões

Duodeno Esôfago Rins Neurônio Fibroblasto

- A cada - Uma vez - Só - G0 por - G0 até
24horas por quando toda a visa ser
semana lesado estimulado
Meselson-Stahl experiment
1957
Cresceram E. coli em meio com N-15 e depois
voltaram pra N-14
Purificação do DNA das bactérias
Três tipos de DNA
◦ N-15 + N-15
◦ N-15 + N-14
◦ N-14 + N-14

Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava

claro que uma fita continha N-15 e outra N-14
Como acontece a síntese do DNA?
Replicação semi-conservativa
◦DNA

A = adenina
T = timina
C = citosina
G = Guanina
 AUTODUPLICAÇÃO (Replicação)

Ocorre em presença da enzima DNA helicase

 As pontes de hidrogênio se
rompem
Molécula DNA

H
 As fitas originais se separam

Nucleotídeos LIVRES encaixam –se nas fitas

 Formam –se 2 moléculas de DNA idênticas

Fita NOVA
Fita original Fita original
(velha) (velha)
A duplicação do DNA permite que
as informações hereditárias sejam
transmitidas às células filhas
 Replicação do DNA
Garante que células-filhas recebam uma cópia exata de cada
molécula de DNA da célula parental
Células diploides 2n=46 cromossomos
Fase S cada molécula de DNA dá origem à outra idêntica a ela
Fase G2 célula humana contém 92 moléculas de DNA, sendo que
um dos 46 cromossomos contém duas moléculas de DNA
(cromátides-irmãs)
Células continuam diploides, tendo 2n = 46 cromossomos, embora
com o dobro do conteúdo de DNA
 Replicação do DNA
Ocorre na fase S da Intérfase
Velocidade de replicação:
E.coli = 30 mm por minuto
Células eucariontes = 0,5 a 2,0 mm por minuto (ou o mesmo que
3.000 bases/min) – nessa velocidade um cromossoma humano
demoraria 1 mês para se replicar
Enquanto em células procariontes a molécula
de DNA inicia a replicação em um único local,
chamado origem de replicação, em células
eucariontes existem múltiplas origens
 Como os nucleotídeos estão ligados?
O grupo hidroxila do carbono-3 da pentose do primeiro nucleotídeo
se une ao grupo fosfato ligado à hidroxila do carbono-5 da pentose
do segundo nucleotídeo através da ligação fosfodiéster
Os nucleotídeos se unem, constituindo uma fita DNA

Quando observamos o DNA, percebemos que suas duas fitas não
seguem a mesma orientação: é a chamada disposição antiparalela
É como se uma fita estivesse de “ponta-cabeça” em relação à outra
 5'- 3': O sentido da vida

Em uma extremidade da fita do DNA está livre a hidroxila do

carbono-5 da primeira pentose e na outra está livre a hidroxila do
carbono-3 da última pentose
Na fita complementar este sentido é invertido
Durante a duplicação do DNA, a DNA polimerase sintetiza as fitas de
DNA no sentido 5'- 3', produzindo fitas complementares
Sentido da Replicação
 Replicação do DNA
Células eucariontes  replicação em várias origens =
muitas unidades de replicação ao longo do genoma denominadas
Réplicons
Em cada núcleo de mamífero existem 20.000 a 30.000 réplicons.
 Replicon
Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação

Origem + Término
Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
O genoma de uma célula procariótica constitui um único replicon
Cada cromossomo eucariótico constitui vários replicons e todos são
ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não
simultaneamente
 Replicon

A replicação é vista
como um “olho”
flanqueado por
DNA não replicado
O genoma bacteriano circular
constitui um único replicon
 Replicação
Todas as unidades de replicação do genoma nuclear são replicadas
Cada réplicon replica somente uma vez, dentro de um único período S
Complexo de reconhecimento de origem (ORC) liga-se às origens de
replicação e sinaliza para que outras proteínas reguladoras venham a se
ligar também
Complexo pré-replicativo ou pré-RC liga-se a uma origem de replicação, o
complexo ORC é fosforilado e o processo de replicação é iniciado
Depois de corrida a replicação, o complexo pré-RC se desliga daquela
origem de replicação, impedindo outra leitura da mesma origem
 Origens de replicação
Locais com um contexto de
sequência específico

Ligam proteínas específicas

Quando acionadas, essas

proteínas permitem o início da
replicação
Origens de replicação
 Micrografia - Bolha de replicação

Forquilhas de replicação
 Genoma eucariótico com vários Replicons

A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min

Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes
Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
 A Replicação é Bidirecional
Uma vez iniciada a replicação em cada ponto de origem, ela se
propaga para os dois lados da molécula de DNA, em ambas as
direções, até encontrar, em qualquer ponto, os extremos das cadeias
em formação dos réplicons adjacentes
Esses locais têm a forma da letra Y e são chamados de forquilhas de
replicação
A replicação bidirecional envolve duas forquilhas que se movem em
direções opostas
Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do
DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas
 A REPLICAÇÃO É SEMIDESCONTÍNUA
Duas cadeias parentais da dupla hélice vão, ambas, sendo replicadas
em cada forquilha de replicação que avança
a DNA-polimerase, polimeriza somente na direção 5’-3’ então,
ambas as cadeias-filhas devem ser sintetizadas na direção 5’-3’. Mas,
os dois filamentos de DNA da hélice dupla são antipararelos, isto é,
um deles tem a direção 5’-3’ e o outro a direção contrária
A cópia da cadeia parental 3’-5’pode ser sintetizada continuamente.
Essa cadeia-filha que avança na direção 5’-3’, recebe o nome de
cadeia líder ou cadeia contínua (leading strand)
 A REPLICAÇÃO É SEMIDESCONTÍNUA
A outra cadeia parental, 5’-3’ tem de ser copiada de um modo
intermitente, descontínuo, por meio da síntese de uma série de
fragmentos
Depois esses fragmentos são unidos e dão origem a uma cadeia
denominada cadeia retardatária ou cadeia descontínua (lagging
strand)
 Os fragmentos da cadeia descontínua receberam o nome de
fragmentos de Okazaki - são cadeias curtas com um comprimento
aproximadamente constante de 1000 a 2000 nucleotídeos de E. coli
e de 200 a 300 nucleotídeos em células eucariontes
 Síntese da Fita descontínua

Fita descontínua

Fita contínua

Síntese da Fita Contínua

 Fragmentos de
Okasaki ocorrem na
fita descontínua
A DNA polimerase III
é responsável pela
síntese da maior parte
do DNA
A DNA polimerase I
remove o primer de
RNA e preenche as
lacunas
A DNA ligase sela as
quebras
Replicação
DNA Polimerase III
Sentido 5’ → 3’
Nucleotídeos 3P são
adicionados
◦ Liberação de Pirofosfato

http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf
Primase
Ribonucleoproteína
Liga-se à helicase em procariotos
formando o chamado primossomo
Sintetiza um primer de RNA contendo
aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH
DNA polimerase lenta e sujeita a erros
Evita a progressão da forquilha uma vez
que a fita líder anda mais rápido
Fita líder
 Primase age uma vez

Fita retardada
 Primase age várias vezes
 Fragmentos de Okasaki
Direções de
replicação na Forquilha
Desenovelamento do DNA
Retirada das histonas
Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)
DNA helicase
◦ Quebra pontes de H

DNA topoisomerases
◦ Tiram a tensão
Forquilha de replicação

Polaridade da síntese define fitas

líder e retardada (descontínua)
DNA polimerase
Enzimas que catalisa a reação de síntese do
DNA
Adiciona nucleotídeos tri-fosfato à
extremidades 3’OH livre
Alongamento da cadeia de DNA sempre é
feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’)
Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter
extremidade 3’OH livre)
Possui mecanismo de correção de erros
(exonuclease 3’>5’)
 ENZIMAS
DNA-polimerases  sintetiza DNA a partir de seus precursores

DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de novo, todas

requerem um segmento inicial de nucleotídeos (chamado primer)
para dar continuidade à cadeia
Tipos de DNA polimerase
DNA polimerase I
 Descoberta em 1956 (Kornberg pai)
 Função precisa descoberta apenas em 1969: remove o primer de RNA da fita
descontínua
DNA polimerase III
 Descoberta em 1970 (Kornberg filho)
 Principal enzima que realiza a replicação em procariotos
DNA polimerase II
 Lenta, envolvida em reparo do DNA
DNA Replication
DNA Pol precisa de um molde
inicial

Primase: gera um molde de RNA

complementar

A DNA Pol III agora é capaz de

adicionar bases à extremidade
3’OH
Eliminação
dos
fragmentos
de Okasaki

DNA Pol I
 Enzimas
 Polimerase – Desenrola as voltas da dupla hélice de DNA para expor
os moldes de cadeia simples
Helicase - O desenrolamento da dupla hélice desenrolando
progressivamente as cadeias em ambas as direções. O processo de
desenrolamento envolve também a quebra das pontes de
hidrogênio, para separar as duas cadeias da dupla hélice que vão ser
copiadas
SSP (Single strand proteins) – ao se ligarem às regiões de cadeias
simples do DNA, mantém os filamentos separados, enquanto se
processa a replicação
 Enzimas
DNA-tropoisomerases (DNA-girase) – impede que um
superenovelamento ocorra
Primer – Adiciona nucleotídeos a um polinucleotídio
preexistente. Segmentos curtos de RNA, com 1 a 60 nucleotídeos de
comprimento, dependendo da espécie cuja sequência é,
naturalmente complementar à do DNA molde. Os primers que fazem
parte dos pequenos fragmentos de Okazaki da cadeia descontínua
são produzidos pela ação de uma RNA-polimerase especial,
denominada primase
Visão geral

Repare na
posição do
primer de
RNA
Reparo pela Polimerase
Mecanismo de verificação
(Proof-reading)

DNA-polimerase possui
◦ Uma atividade de polimerização 5’→
3’
◦ Uma atividade de exonuclease 3’→
5’
DNA Repair
Checagem de
pareamento
incorreto
(eucariotos)

Proteínas especiais
para reparo do erro
 CÉLULAS APRESENTAM MECANISMOS PARA
MANTER INTEGRIDADE DO DNA
Apesar de complexa, a replicação do DNA é extremamente precisa,
estimando-se que apenas um erro seja cometido na replicação de
108 bases
Essa precisão se dá principalmente a uma propriedade especial da
DNA-polimerase: ela é capaz de conferir as bases, à medida que as
adiciona ao novo filamento de DNA = leitura de prova
algumas bases incorretamente emparelhadas conseguem escapar
dessa correlação de provas, e o DNA pode sair com defeitos dessa
replicação, que não apresenta fidelidade absoluta
 CÉLULAS APRESENTAM MECANISMOS PARA
MANTER INTEGRIDADE DO DNA
Macromoléculas biológicas são suscetíveis a alteração químicas que
surgem de erros durante a síntese, ou mesmo de exposição a fatores
deletérios do ambiente (físicos ou químicos - alguns produzidos na
própria célula)
Raios cósmicos e outras radiações com muita energia podem causar
lesões por atuação direta na DNA, como modificações nas bases ou
ruptura da dupla cadeia.
A radiação ultravioleta solar também pode causar alterações como a
formação de dímeros de timinas adjacentes na cadeia de DNA
 Doenças causadas por problemas no
mecanismos de replicação
Ataxia de Friedreich's
dano progressivo no sistema nervoso
(problemas musculares, na fala e
doenças no coração)
forma mais comum das ataxias
herdadas
A sequência GAATTC se repete, quando
existem mais de 40 repetições, o
indivíduo apresenta a doença.
 Doenças causadas por problemas no
mecanismos de replicação

Xeroderma pigmentosum
envelhecimento precoce
aumento na incidência de
câncer
Falha no mecanismo de
reparação do DNA
causado pela luz UV
Conclusões
Replicação semi-conservativa
Bolha de replicação avança em duas direções
Fita líder e fita retardada
Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA
Primase faz o primer
DNA polimerase III, DNA polimerase I
DNA ligase
Telomerase