CITOGENÉTICA

Profa. Simone Neumann Wendt

Disciplina de Genética
Curso de Especialização em Biologia Molecular
Os três domínios da vida

Pearson, 2014
Estrutura dos cromossomos

Todos os cromossomos contêm uma mistura de DNA e proteínas.

Essa combinação desempenha quatro funções essenciais:

- Ajuda a compactar o DNA de modo que ele se encaixe na

célula ou no núcleo;
- Estabiliza o DNA e o protege de danos;
- Promove a condensação cromossômica necessária para a
divisão celular;
- Ajuda a regular a replicação do DNA e a transcrição gênica.
Cromossomos bacterianos e arqueais

A maioria dos genomas bacterianos e arqueais contém um único

cromossomo (haplóide), normalmente circular.

O comprimento e o número de genes que o cromossomo contém

variam entre as espécies.

Em alguns genomas, os genes essenciais estão situados em um

cromossomo principal e em um ou dois cromossomos adicionais.

As bactérias normalmente possuem plasmídeos, moléculas de

DNA extracromossômico (carregam genes não essenciais).
Diversidade cromossômica entre os domínios Bacteria e Archaea

Pearson, 2014
Os cromossomos bacterianos e arqueais são densamente
empacotados, formando uma pequena região chamada nucleoide
dentro da célula.

O cromossomo da E. coli está situado no nucleoide da célula

bacteriana. Pearson, 2014
Condensação dos cromossomos bacterianos

Como a E. coli embrulha um cromossomo de 1 mil vezes maior que

a própria célula e deixa espaço para as atividades moleculares
(replicação, transcrição e tradução)?

1 - As proteínas ajudam a organizar os cromossomos em

alças que embalam o nucleoide;

2 - O DNA circular do cromossomo é submetido a um

superenrolamento.
1 - As proteínas ajudam a organizar os cromossomos em alças que
embalam o nucleoide

O DNA bacteriano está associado a dois grandes grupos de proteínas:

- As pequenas proteínas associadas ao nucleoide: são a proteína H-NS e a

proteína HU. Participam do encurvamento do DNA que contribui para o
dobramento e condensação do cromossomo.

- As proteínas de manutenção
estrutural do cromossomo:
proteínas SMC. Se prendem ao DNA,
mantendo-o em espirais (ou em V).

Compactação do DNA bacteriano. Pearson, 2014

2 - O DNA circular do cromossomo é submetido a um superenrolamento

Duas formas:

- Superenrolamento negativo: torção do DNA

em volta de seu eixo no sentido oposto ao da
torção da dupla-hélice. Predominante na
maioria dos organismos.

- Superenrolamento positivo: Torção do DNA

no mesmo sentida de torção da dupla-hélice.
Acontece em algumas espécies arqueais, que
são hipertermófilas, vivem em temperaturas
muito elevadas. DNA circular das bactérias em
várias formas vistas por meio de
micrografia eletrônica.
Pearson, 2014
Cromossomos eucarióticos

Composição da cromatina

Nos eucariotos os cromossomos aparecem aos pares no núcleo e são

organizados como cromatina (DNA + proteínas).

Metade do componente proteico da cromatina consiste de proteínas

histônicas.

As histonas são cinco proteínas básicas pequenas, carregadas

positivamente e fortemente ligadas ao DNA carregado negativamente.

Igualmente abundante, porém mais diverso, há um conjunto de centenas

de outros tipos de proteínas de ligação ao DNA chamados, por padrão,
proteínas não histônicas.
Características das proteínas histônicas:

*Proteínas histônicas do timo bovino. Pearson, 2014

Condensação do material nuclear

Nucleossomo (fibra de 10 nm): formado por oito moléculas de histonas

(H2A, H2B, H3 e H4 - duas de cada) que, em torno, se enrola um
segmento de DNA (± 146 pb)  condensação do DNA em
aproximadamente sete vezes.
Entre dois nucleossomas  segmento de DNA ligador (tamanho variável)
ao qual se associa a histona H1  função de aproximar os nucleossomas.

Hierarquia da organização da
cromatina e da condensação
cromossômica.
Pearson, 2014
Solenóide (fibra de 30 nm - interfase): é produzida pela coalescência da
fibra de 10 nm em um filamento cilíndrico dos nucleossomos enrolados.

Cada volta do solenóide contém seis a oito nucleossomos.

A histona H1 estabiliza a fibra de 30 nm. As extremidades da proteína H1

se prendem as partículas centrais do nucleossomo adjacente.

A proteína H1 puxa os nucleossomos para um conjunto solenóide

ordenado e reveste o interior da estrutura.

Hierarquia da organização da
cromatina e da condensação
cromossômica.
Pearson, 2014
As proteínas não histônicas desempenham papel importante na compactação
da cromatina (interfase e na fase M).

A estrutura cromossômica na interfase resulta de alças de cromatina

similares ao DNA bacteriano superenrolado.

O diâmetro da alça de cromatina é de aproximadamente 300 nm, portanto

conhecida como fibra de 300 nm.

As alças de cromatina irão formar as cromátides irmãs.

Na metáfase a condensação é máxima, resultando nos cromossomos.

Hierarquia da organização da
cromatina e da condensação
cromossômica.
Pearson, 2014
Hierarquia da organização da cromatina e da condensação cromossômica.

Pearson, 2014
Suporte cromossômico é um arcabouço filamentoso de proteínas não
histônicas que confere seu formato aos cromossomos.

Destituído de cromatina, o
suporte cromossômico restante
é composto de proteínas não
histônicas cuja forma geral é
reminiscente de um
cromossomo da metáfase.

Suporte cromossômico proteico de um

cromossomo na metáfase. Pearson, 2014
As alças de cromatina contendo 20 mil a 100 mil pb são ancoradas ao
suporte cromossômico por outras proteínas não histônicas em locais
chamados regiões de associação à matriz (MARs):

1 – A cromatina é presa às
regiões de associação à
matriz (MARs).
Pearson, 2014
O modelo de posicionamento radial dos cromossomos prevê que
as alças de cromatina se juntam em estruturas tipo rosetas e ainda
são mais comprimidas pelas proteínas não histônicas.

Pearson, 2014

2 – As proteínas não histônicas organizam 3 – As rosetas são comprimidas nos

as alças de cromatina em rosetas. cromossomos metafásicos.
Estruturas dos cromossomos e padrões de bandeamento

A posição do centrômero e a proporção dos tamanhos do braço

longo (braço q) e do braço curto (braço p) na metáfase determinam
a forma do cromossomo.

Forma do cromossomo. Pearson, 2014

Cariótipo

Conjunto completo de cromossomos para uma espécie, apresenta

os cromossomos autossomos agrupados em pares homólogos, em
ordem decrescente de tamanho e, por último, os sexuais.

Maioria dos eucariontes é diplóide (2n) 

cromossomos organizados aos pares.

Cromossomos homólogos  cromossomos que

constituem um par. São morfologicamente
idênticos e com o mesmo número de genes.

Cariótipo bovino normal

2n=60
Cromossomos sexuais: algumas espécies, incluindo a espécie humana, o
sexo está associado a um par de cromossomos morfologicamente
diferente (heteromórfico). Por exemplo: X e Y.

Autossomos: cromossomos que não determinam o sexo.

Cariótipo humano feminino 2n = 46 (23 pares)

Cariótipo

Compostos fluorescentes e cores melhoradas por computador tornam

cada cromossomo característico.

Cariótipo humano normal. Pearson, 2014

No final dos anos 1960, foram desenvolvidas várias técnicas de
bandamento cromossômico que permitem identificar com precisão
cada cromossomo e segmento cromossômico em um cariótipo.

O padrão para a nomenclatura do bandamento cromossômico humano

se baseia em um padrão conhecido como bandamento G (Giemsa).

O corante Giemsa é utilizado para criar faixas claras e escuras em um

padrão diferente em cada tipo de cromossomo humano.
A numeração das regiões de bandas
começa em cada centrômero e se move
para fora ao longo de cada braço na
direção do telômero.

As regiões maiores são subdivididas e

recebem uma designação de faixa clara e
escura.

Cada faixa recebe uma designação

específica, o número do cromossomo, o
braço cromossômico e a localização da
faixa. Ex: 5q2.3.1

Padrões normalizados de bandamento

cromossômico humano (1 a 5) Pearson, 2014
Heterocromatina e eucromatina

A condensação da cromatina varia durante todo o ciclo celular, e varia

também de uma parte de um cromossomo para outra.

Durante a interfase, as regiões cromossômicas contendo os genes

expressos ativamente geralmente possuem um grau de condensação
da cromatina menor que as regiões cromossômicas que não contêm
genes expressos.

Essas regiões de expressão ativa são identificadas como eucromatina

ou regiões eucromáticas (coloração clara).
 •
Em regiões cromossômicas nas quais a cromatina é altamente
condensada contêm heterocromatina e se chamam regiões
heterocromáticas (coloração escura) .

Duas classes distintas de heterocromatina são detectadas:

- Heterocromatina facultativa exibe níveis variáveis de condensação.

- Heterocromatina constitutiva é um estado heterocromático

permanente e contém poucos genes expressos. Composta de
sequências de DNA repetitivas (telômeros e centrômeros não contém
genes expressos).
Estrutura do centrômero

O centrômero é uma região

especializada de heterocromatina
constitutiva (sequências de DNA
repetitivas), ligada por proteínas
de cinetócoro que facilitam a
ligação do microtúbulo e o
movimento do cromossomo e
das cromátides irmãs para os
pólos da célula durante a divisão
celular.

Sequência de nucleotídeos conservada no centrômero da

levedura (R = purina, Y = pirimidina). Pearson, 2014
Hibridação in situ
•
A técnica conhecida como hibridação in situ usa sondas moleculares
marcadas com radioatividade, ou mais recentemente, com compostos
fluorescentes, para detectar suas sequências-alvo.

Muitos avanços ocorreram ao longo das décadas, particularmente com

o desenvolvimento de uma nova geração de marcadores fluorescentes
(fluoróforos), para serem usados como sondas moleculares.

Os fluoróforos permitem a detecção precisa de cada cromossomo

marcado e a localização de genes específicos no cromossomo.
A hibridação in situ fluorescente (FISH) usa sondas moleculares
marcadas com compostos que emitem luz fluorescente quando
excitadas pela luz no espectro visível ou UV.

Vários compostos que emitem luz fluorescente em diferentes

comprimentos de onda podem ser usados simultaneamente para
marcar as sondas.

Vantagem que o comprimento de onda de cada emissão produz uma

cor diferente quando os cromossomos são visualizados no
microscópio.

Usada para análises cromossômicas em humanos e outras espécies.

Permite a identificação das reorganizações complexas dos

cromossomos verificadas nas células cancerosas.
Hibridação in situ fluorescente (FISH)
1.
Duas sondas (vermelha e verde) com sequências-
alvo em um cromossomo humano são detectadas
pelas emissões de cores diferentes.
Usando fluoróforos diferentes para marcar 24 sondas para
cromossomos específicos, esse cariótipo masculino humano
normal exibe uma cor diferente para cada cromossomo.
Pearson, 2014
A estrutura da cromatina influencia a transcrição gênica

A presença da cromatina nos eucariotos é uma diferença importante

em relação aos procariotos. Sendo fundamental no controle da
expressão gênica eucariótica.

Diferenças na estrutura da cromatina levam a diferentes níveis de

transcrição gênica em diferentes localizações cromossômicas.

Como a posição de um gene - heterocromatina x eucromatina - pode

influenciar no fato dele ser transcrito ou não???
Território cromossômico durante a interfase

Thomas Cremer e Christoph Cremer usaram a pintura cromossômica

para investigar a organização dos cromossomos no núcleo durante a
interfase e constataram que os cromossomos são particionados em
territórios cromossômicos.

Um território cromossômico é uma pequena região do núcleo que é o

domínio de um único cromossomo (mas a posição pode variar entre os
núcleos). Essa região não é delimitada por qualquer tipo de membrana
e nem demarcada.

Os territórios cromossômicos adjacentes são separados por um

domínio intercromossômico que não contém cromatina.
O posicionamento de um cromossomo dentro de seu território
depende da atividade em que está envolvido na interfase.

Ex.: Regiões cromossômicas que replicam no início da fase S (precoce)

ficam mais distantes da membrana nuclear e os segmentos
cromossômicos que replicam no final fase S ficam próximos a
membrana nuclear.

Os cromossomos ocupam A marcação de FISH dos cromossomos no núcleo de

territórios distintos, separados por um embrião de galinha revela a ocupação de
domínios intercromossômicos territórios distintos.
Pearson, 2014
durante a interfase do ciclo celular.
Regiões mais ativas na transcrição se encontram mais perto da
fronteira entre um território cromossômico e um domínio
intercromossômico.

Provavelmente em razão:

(1) de maior acesso as proteínas e enzimas

necessárias a transcrição;
(2) dispersão mais rápida dos transcritos
de RNA após o término da transcrição.

Os cromossomos ocupam territórios

distintos, separados por domínios
intercromossômicos durante a interfase do
ciclo celular.
Pearson, 2014
C. Anthony Blau e colaboradores, empregando um método que
identifica cada cromossomo de maneira diferente, conseguiram
mapear precisamente a localização de cada cromossomo dentro do
núcleo.

Esse conhecimento possibilitará determinar como as sequências de

DNA influenciam o posicionamento cromossômico, e por sua vez, como
o posicionamento dos cromossomos influencia a transcrição e a
replicação das sequências.

Modelo tridimensional dos cromossomos no núcleo da

levedura. Os centrômeros dos cromossomos das leveduras
são agrupados em uma extremidade do núcleo; os braços
cromossômicos irradiam a partir do agrupamento
centromérico.
A estrutura dinâmica da cromatina

Os segmentos cromossômicos existem em estados diferentes de

compactação e relaxamento durante o ciclo celular.

Essas mudanças regulam o acesso das proteínas ao DNA (proteínas

que executam a replicação, transcrição, recombinação e reparação).

As regiões que possuem:

heterocromatina facultativa – relativamente inacessíveis as proteínas

(de modo temporário);
heterocromatina constitutiva – inacessíveis as proteínas quase todo o
tempo;
eucromatina – proteínas tem facilidade de acesso ao DNA.
Vários experimentos relacionam a estrutura da cromatina com a
expressão gênica.

Variegação do efeito de posição (PEV) - Hermann Muller (1920 a

1930) estudou o efeito dos raios X na cor dos olhos de Drosophila.

Moscas selvagens apresentam olhos vermelhos e as moscas expostas

aos raios X apresentaram um padrão variegado de cor dos olhos
(manchas vermelhas e brancas).

Manchas vermelhas expressão do alelo w+ do tipo selvagem para

cor vermelha.

Manchas brancas não tem cor devido ausência da expressão do

alelo w+ .
Os cromossomos X das moscas com cor variegada tinham uma estrutura
anormal. Foram rompidos pelos raios X, pedaços deram um giro de
180º, e foram religados.

O gene w+ (cromossomo X) se deslocou da sua posição original, perto

dos telômeros, onde era expresso, para uma posição mais perto do
centrômero, formada por heterocromatina constitutiva, onde
praticamente não ocorre expressão gênica.

O grau de disseminação da heterocromatina varia entre os

cromossomos. Se ela não alcançar a nova posição do gene w+ ele é
expresso, se alcançar, o gene não é expresso.

No “efeito de posição” a expressão do gene depende de sua posição

com relação à heterocromatina centromérica.
Variegação do efeito de posição da cor do olho na Drosophila. O alelo w+ é expresso nos
cromossomos X do tipo selvagem e nas inversões em que a heterocromatina não se espalha
para cobrir o gene. Se a heterocromatina cobrir a nova posição do gene, o “w” é silenciado.
Pearson, 2014
O
B
R
I
G
A
D
A